Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.
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Methodenartikel
Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese im Gehirn von Nagetieren mit dem organotypischen Kulturtechnik. Diese Methode behält die charakteristische topografische Morphologie des Hippocampus und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Mitteln für die Entwicklungs Gyrus dentatus des Hippocampus. Zusätzlich können Gewebekulturen für bis zu 4 Wochen aufrechterhalten werden, und somit erlauben, die Reifung von neugeborenen Körnerzellen zu untersuchen. Schnittkulturen ermöglichen eine effiziente pharmakologische Manipulation von hippocampalen Schnitten unter Ausschluss komplexen Variablen wie Unsicherheiten in den tiefen anatomischen Lage des Hippocampus sowie der Bluthirnschranke stehen. Aus diesen Gründen haben wir versucht, organotypischen Kulturen für postnatale Neurogenese Forschung gezielt zu optimieren.
Einleitung
Die adulte Neurogenese im Hippocampus von Säugetieren stellt ein bemerkenswertes Beispiel für die angeborene Fähigkeit des Gehirns zur Anpassungsfähigkeit und Plastizität dar. Dentatäre Körnerzellen (DGCs) werden aus einem erneuerbaren Pool neuraler Vorläuferzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus erzeugt, der eine der beiden derzeit gut charakterisierten neurogenen Regionen im Gehirn von Säugetieren ist und als besonders wichtig für das Lernen und das Gedächtnis gilt. Der Hippocampus ist Teil des limbischen Systems und befindet sich tief im Gehirn von Säugetieren, was ihn zu einem schwierigen Ziel für präzise pharmakologische Manipulationen macht. Darüber hinaus wur....
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Protokoll
HINWEIS: Alle Tierverfahren gemäß den zum Tiergesundheit und Tier Richtlinien der Abteilung für Vergleichende Medizin an der Universität von Toronto.
1. Herstellung von Schnitten des Hippocampus
- Sterilisieren Sie die folgenden Instrumente mit dem Trocken Autoklaven bei 125 ° C: Skalpellgriff (# 3) (2), Standard-Muster Pinzetten, groß (1), Kleine Dissektor Scheren (abgewinkelt zu Seite) (1), Micro Löffel (Löffel und Flach Spachtel Enden) (1), Mikro-Spatel (abgerundet und aufgerundet verjüngten Enden) (2), Gourmet Pinsel (1), poliert Feuer Pasteur-Pipette (2), Gaze Plätze, 2 x 2 Zoll (5).
- Wenn sterile, legen Sie die Ins....
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Ergebnisse
Feststellen, ob organotypischen Kulturen wäre geeignet für adulte Neurogenese Forschung erforderlich, dass sie zwei Hauptkriterien erfüllen: 1), dass Scheiben halten charakteristischen morphologischen Merkmale der Hippocampus nach 10-21 Tagen in vitro (DIV), und 2) dass neugeborene DGCs quantifiziert werden mit Standard-immunhistochemischen Techniken, die üblicherweise in der adulten Neurogenese Forschung beschäftigt. In Bezug auf das erste Kriterium, 1A und 1B markieren Sie de.......
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Diskussion
Nach CldU (oder BrdU) Verabreichung kann die Zeitleiste der Anwendung von pharmakologischen Mitteln ausgewählt werden, um neugeborene DGCs während bestimmter Entwicklungs Fenster Ziel. Zum Beispiel kann eine hypothetische Mittel während der zweiten Woche nach der CldU Injektion, die vorgeschlagen wird, mit dem Alter der unreifen Neuronen, die zu einem Entwicklungsstadium sind, wo GABA depolarisierende übereinstimmen angewendet werden. Zukünftige Studien unter Verwendung dieses Protokolls kann die pharmakologische Mittel.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium unterstützt, das MOP JMW vom Canadian Institute of Health Research 119271 hat. Die Autoren danken Frau Yao Fang Tan für ihre hervorragende technische Unterstützung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5-Chlor-2'-Desoxyuridin (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Gefährliche, krebserregende |
| Zellkultureinsätze, 30 mm Durchmesser, 0,4 & Mikro; m Porengröße | Thermo scientific | Die 140660 | Nuclon-Delta-Beschichtung auf diesen Einsätzen sorgt für eine bessere Gewebehaftung und verbessert die Schnittqualität. |
| Konische Zentrifugenröhrchen (steril) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissektorschere (zur Seite abgewinkelt) | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 14082-09 | |
| Minimum an essentiellem Medium (MEM) | Gibco | 11095; flüssig | Bei 4 Grad lagern; C |
| Eclipse Ni-U Fluoreszenzmikroskop | Nikon | ||
| Kleber für Gewebe | Krazy Glue | KG585 | Verwenden Sie eine minimale Menge an Klebstoff, um eine Haftung zu erreichen, da jegliches Gewebe, das dem Klebstoff ausgesetzt ist, für IHC unbrauchbar ist. |
| Hank' s Ausgewogene Salzlösung (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Bei 4 Grad lagern; C |
| Pferdeserum Hitzeinaktiviert (500 ml) | Gibco | 16050-122 | 50 ml Aliquote herstellen und bei -20 & Grad lagern; C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modifizierte Glaspipetten (Unterseite der Pasteurpipette entfernt und Kante mit Bunsenflamme geglättet) | |||
| Petrischale (100 mm x 15 mm) und (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 und FB0875713A | |
| Skalpellklingen #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Skalpellgriff #3 | Fein Science Tools | 10003-12 | |
| Serologische Pipetten | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standardmusterzange | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Steriler Vakuumfilter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Chirurgische Schere | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Spritzengetriebene Filtereinheit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Gewebehacker mit beweglichem Tisch | Stoelting& nbsp; | 51425 | |
| mit feiner Spitze |
Referenzen
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
