Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Zusammenfassung

Arbeit mit infektiösen Viren Ebola wird Biosicherheitsstufe 4 Laboratorien beschränkt. Tetracistronic Minigenom-haltigen Replikation und Transkription kompetenten virusähnlichen Partikeln (trVLPs) stellen eine Lebenszyklus-Modellierungssystem, das uns sicher zu modellieren mehrere Infektionszyklen unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen, die sich ausschließlich auf Ebola-Virus-Komponenten ermöglicht.

Zusammenfassung

Ebola-Viren verursachen schwere hämorrhagische Fieber bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten, mit Letalität so hoch wie 90%. Es gibt keine zugelassenen Impfstoffe oder spezielle Behandlungen für die Erkrankung, die durch diese Viren verursacht, und die Arbeit mit infektiösen Viren Ebola wird Biosicherheitsstufe 4 Laboratorien beschränkt, die Forschung zu diesen Viren erheblich einschränkt. Lebenszyklus-Modell, Modellierungssysteme der Virus-Lebenszyklus unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen; Bis vor kurzem sind solche Systeme entweder einzelne Aspekte des Virus-Lebenszyklus, oder eine einzige Infektionszyklus beschränkt. Tetracistronic Minigenome, die von Ebola-Virus nicht-kodierenden Regionen, ein Reporter-Gen bestehen, und drei Ebola-Virus-Gene in der Morphogenese beteiligt, angehende und Eintrag (VP40, GP _1,2 und VP24), kann die Replikation und Transkription verwendet werden -competent Virus-ähnliche Partikel (trVLPs), die diese Minigenome. Diese trVLPs kontinuierlich infizieren Zellen, die das EbolaVirusproteine ​​für die Genom Replikation und Transkription, so dass wir sicher modellieren mehrere Infektionszyklen unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen verantwortlich. Wichtig ist, dass die viralen Komponenten dieser Systeme ausschließlich durch Ebola-Virus stammt und nicht von anderen Viren (wie zum Beispiel in Systemen mit pseudotypisierten Viren der Fall ist), und VP40, VP24 und GP _1,2 sind in diesem System überexprimiert , wodurch es ideal für die Untersuchung der Morphogenese und angehEintrag, obwohl auch andere Aspekte des Virus-Lebenszyklus, wie Genom-Replikation und-Transkription kann auch mit diesem System modelliert werden. Daher ist die tetracistronic trVLP Assay stellt die umfassendste Lebenszyklus-Modellierungssystem für Ebola-Viren zur Verfügung und hat ein enormes Potenzial für den Einsatz bei der Untersuchung der Biologie von Ebola-Viren in Zukunft. Hier stellen wir Informationen über die Nutzung des Systems, sowie die erwarteten Ergebnisse.

Einleitung

Ebola-Viren sind die Erreger einer schweren hämorrhagischen Fieber bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten, die mit Letalität von bis zu 90% in der menschlichen Ausbrüche ^1. Zwar gab es in den letzten Jahren in die Entwicklung von Impfstoffen sowie spezifische Behandlungen (in ^2,3 bewertet) wurden erhebliche Fortschritte erzielt, so werden diese nicht für den menschlichen Gebrauch zugelassen. Ebola-Virus-Partikel haben eine charakteristische fadenartiges Aussehen mit einer Länge von etwa 1 um und einen Durchmesser von 96 bis 98 nm ^4. Ein Nukleokapsid bildet den Kern der Viruspartikel und besteht aus 1) dem nicht-segmentierten Einzelstrang-negativen Sense-RNA-Genom, das die 7 Ebolavirus-Gene codiert (Figur 1), 2) das Nucleoprotein NP, die das Genom encapsidates, 3 ) der viralen Polymerase-Komplex, bestehend aus der Polymerase-L und dessen Cofaktor VP35, und 4) die transkriptionelle Aktivator VP30. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass das Protein VP24 ist mit Nukleokapsid assoziierts ^4. Das Nukleokapsid ist von dem Matrixbereich, in dem das Matrix-Protein VP40, die für die Morphogenese und Knospung von Virionen verantwortlich ist, befindet sich umgeben. Viruspartikel werden weiter umhüllt und in diesem Umschlag eingebettet ist die einzige Oberflächenprotein GP _1,2, die Virion Befestigung und Eintrag verantwortlich ist.

Arbeit mit infektiösen Viren Ebola muss in einem Hochsicherheitslabor unter Biosicherheitsstufe (BSL) 4 Bedingungen, die diese Arbeit auf einige wenige Standorte weltweit beschränkt durchgeführt werden. Um die Biologie dieser Viren zu studieren oder neue Therapeutika in BSL2- Bedingungen zu entwickeln, setzen die Forscher entweder auf die Überexpression von rekombinanten Proteinen Ebola-Virus, oder Lebenszyklus-Modellierungssysteme, die beide mit in der Abwesenheit von Infektions Ebola-Virus gearbeitet werden. Rekombinante Expression von Ebola-Virus-Proteine ​​entweder von Expressionsplasmiden oder viralen Vektoren erreicht. Ein Sonderfall dieser Strategie ist dieErzeugung von Virionen oder Virus-ähnliche Partikel auf Basis von anderen Viren als Ebola-Viren (üblicherweise Retroviren oder vesikulären Stomatitis-Virus) in Gegenwart von _1,2 GP rekombinant exprimiert, was zur Erzeugung von pseudotypisierten Partikel, die verwendet werden können, um die Studie Eintrag Prozess der Filoviren und Leinwand für Entry-Inhibitoren ^5. Alternativ können rekombinante Viren (zB, vesikuläre Stomatitis-Virus), die das Ebola-Virus GP _1,2 ihrer eigenen Glykoprotein codieren statt erzeugt und verwendet werden, um das Eindringen von Viren unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen ⁶ studieren.

Lifecycle Modellierungssysteme sind Formen der reversen Genetik Systeme mit dem Einsatz von Ebola-Virus-Genom abgeschnitten Analoga (Minigenome), der zunächst aus cDNA hergestellt werden und dann repliziert und vom Ebola-Virus-Proteine ​​in trans bereitgestellt transkribiert. Die erste Minigenom-System für Ebola-Virus wurde vor mehr als 15 Jahren entwickelt, ⁷Und ist seit verwendet worden, um Ebola-Virus-Genom-Replikation und Transkription (in ^8,9 bewertet) studieren. In diesem System wird ein monocistronisches Minigenoms aus einer einzigen Reportergens durch das Endgerät nicht-kodierenden Regionen des Ebola-Virus-Genom flankiert (als Leader und Trailer) (Abbildung 1) wird in Säugerzellen (in der Regel durch Transkription mit T7-RNA-Polymerase) exprimiert zusammen mit den viralen Proteinen L, VP35, VP30 und NP. Die Minigenom durch NP eingekapselt und dann repliziert und transkribiert von den anderen Nucleocapsid-Proteine ​​unter Verwendung von cis-wirkenden Signale in dem Leader und Trailer lokalisiert, was zu einer Reporteraktivität, die diese beiden Aspekte des Virus-Lebenszyklus (Figur 2) reflektiert.

Um zusätzliche Schritte des viralen Lebenszyklus, der Transkription und replikationskompetenten Virus-ähnliche Partikel (trVLP) Systeme entwickelt worden, die auf klassischen Minigenom Systeme beruhen Modell, sondern sind mit der einW eitere Ausdruck der anderen viralen Proteine ​​VP24, VP40 und GP _1,2 von Expressionsplasmiden ^10,11. Die Anwesenheit von VP40 führt zur Bildung von trVLPs, die GP _1,2 auf ihrer Oberfläche tragen, und führen einen Minigenom enthaltenden Nukleokapsid auf der Innenseite. Diese trVLPs kann verwendet werden, um Zielzellen, die entweder mit Expressionsplasmiden für L, VP35, VP30 und NP pretransfected wurden, zu infizieren, um die Replikation und Transkription des Minigenome in die Zielzellen gebracht innerhalb trVLPs ¹¹ zu erleichtern, oder naiven Zielzellen (dh ohne Plasmid-gesteuerte Expression des Ebola-Virus-Proteine) ^10. Dies führt Reporteraktivität in Zielzellen, die die Replikation der Minigenome in den Erzeugerzellen Morphogenese und Knospung trVLPs, deren Eintritt in die Zielzellen zeigt, und 1) in dem Fall pretransfected Zielzellen auch Genomreplikation und sekundären Transkription ( dh Transkription von viraler Proteine ​​produced in Zielzellen) in Zielzellen, oder 2) im Falle von naiven Zielzellen auch primäre Transkription (dh Transkription von viralen Proteinen in trVLPs in Zielzellen gebracht) (Abbildung 3). Wichtig ist, daß diese Systeme nur verwendet, um einen einzigen Infektionszyklus zu modellieren, und verlassen sich auf die Überexpression von allen viralen Proteinen, die im Fall von VP24 und VP40 ist besonders problematisch, da diese Proteine ​​wurde gezeigt, dass starke negative Regulatoren der Genom-Replikation sein und wenn die Transkription von Plasmiden ^12,13 überexprimiert. Ferner trVLP Vorbereitungen in diesen Systemen hergestellt werden, enthalten einen hohen Anteil an nicht-infektiösen Partikeln, posiert Herausforderungen für die biochemische Analyse von Infektions trVLPs ^14.

Um diese Probleme zu überwinden, haben wir vor kurzem ein tetracistronic Minigenom System, das zusätzlich zu einem Reporter-Gen, enthält auch die Gene, die für VP40, GP _1,2 und entwickelteVP24 (Abbildung 1). Ähnlich dem klassischen monocistronisches Minigenom System führt dieses System für die Herstellung von trVLPs die Zielzellen infizieren können (Figur 4) ^15. Im Gegensatz zur klassischen Minigenom System VP40, GP _1,2 und VP24 sind nach der viralen Genom-Transkription anstatt von Plasmiden überexprimiert hergestellt. Als Ergebnis wird die Kinetik und die Expressionsniveaus dieser Proteine ​​viel enger imitieren die während des viralen Lebenszyklus festgestellt und damit das Verhältnis von infektiösen nicht-infektiösen trVLPs wird in diesem System ¹⁵ um etwa 500-fach. Ferner wurde unter Verwendung dieses Systems war es möglich, kontinuierlich Passage tetracistronic Minigenom haltigen trVLPs, Modellieren mehrerer Infektionszyklen. Als solche sind tetracistronic trVLPs derzeit umfassendste Lebenszyklus Modellierungssystem zur Verfügung zu Ebola-Virus Biologie unter BSL2- Bedingungen zu studieren. Hier informieren wir Sie ausführlich über den Einsatz of dieses Systems sowie der erwarteten Ergebnisse.

Protokoll

1. Aufteilung des Produktionszellen für anfänglichen Produktion von trVLPs

1. Entfernen Medium von 80-90% konfluenten 293 Zellen in 75 cm ^2-Kolben kultiviert in hohem Glucose Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin (DMEM10 ). Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), darauf achten, um die Zellen zu entfernen, und 2 ml Trypsin-EDTA zu den Zellen.
2. Inkubieren der Zellen bei Raumtemperatur, bis die Zellen zeigen deutliche Rundung, wenn sie unter einem Mikroskop (ca. 30 sec) beobachtet. Zellen zu entfernen, indem Sie auf Kolben und 8 ml DMEM10. Gründlich resuspendieren durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren, bis eine Einzelzellsuspension wird beobachtet, wenn unter dem Mikroskop betrachtet.
3. Zählen Sie die Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler. Verdünnte Zellen zu 2 x 10 ⁵ Zellen pro ml in DMEM10. Pipette 2 ml Zellsuspension pro Well in 6-Well-Platten (4 x 105 Zellen pro Vertiefung).
4. Die Platten in einem befeuchteten Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO _2.

2. Transfektion von Zellen für Produzent anfänglichen Produktion von trVLPs

1. 24 Stunden nach der Spaltung der Zellen (siehe Abbildung 5 für einen Überblick über das Experiment Timing), Pipetten Plasmid-DNA ¹⁵ (für Beträge siehe Tabelle 1) in ein steriles 2 ml Kryoröhrchen mit Filterspitzen. 100 l pro OptiMEM gut an die DNA. Vortexen die Mischung kurz und sanft nach unten drehen die Rohre mit Hilfe einer Mikro. Wenn mehrere Vertiefungen sind mit identischen Plasmiden transfiziert werden, kann ein Mastermix für mehrere Vertiefungen gebildet werden.
2. Vortexen Sie das Fläschchen mit Transit LT1 vor dem Gebrauch. Fügen 7,5 ul Transit LT1 pro Vertiefung zu der verdünnten DNA. Vortexen Sie vorsichtig die Mischung, kümmert sich nicht um Flüssigkeit im Deckel des Cryovial sammeln, und die Proben für 15 min bei Raumtemperatur.
3. Vorsichtig mischen die TransfektionKomplex durch Pipettieren von oben und unten. 100 l der Transfektionskomplexe tropfenweise in jede Vertiefung. Rock die Platte vorwärts / rückwärts und von Seite zu Seite, um die Transfektionskomplexe zu verteilen. Die Platte wirbeln nicht, da dies zu einer ungleichmäßigen Verbreitung der Transfektionskomplexe.
4. Rückkehr der Zellen in den Inkubator.
5. Nach 24 Stunden, entfernen Sie den Überstand von Zellen. 4 ml DMEM mit 5% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin (DMEM5) zu den Zellen. Dieser Schritt kann bis zu 3 Vertiefungen in einer Zeit ohne Trocknen der Vertiefungen ausgeführt werden, vorausgesetzt, die Löcher enthalten identische Proben (ansonsten aufgrund der selbstverstärkenden Art der trVLPs in diesem System kann eine Kreuzkontamination zu einem Problem werden und Dieser Schritt sollte man gut gemacht werden zu einem Zeitpunkt).
6. Rückkehr der Zellen in den Inkubator.

3. Herstellung von Zielzellen

1. Split 293-Zellen, wie in Abschnitt 1 pro Vertiefung einer beschrieben, der Aussaat 4 x 10 ⁵ Zellen in 2 ml DMEM106-Well-Platte.
2. 24 Stunden nach der Aufspaltung der Zielzellen und 24 Stunden vor der Infektion, Transfektion von Zielzellen, wie in Kapitel 2 unter Verwendung der DNA beschriebenen Mengen in der Tabelle 1 und 4,5 ul Transit LT1 pro Vertiefung.

4. Die Infektion der Zielzellen und Ernte von Produktionszellen

1. Die Überstände aus den Produzentenzellen bis 15-ml-Röhrchen. Entfernen Sie alle verbleibende Überstand mit einem Vakuumschlauch. Fügen Sie 250 ul Glo Lyse-Puffer zu den Zellen.
2. Zentrifugenüberstand für 5 min bei 800 × g und Raumtemperatur, um die Proben der Zelltrümmer zu entfernen.
3. Entfernen des Überstandes von einer Vertiefung der Zielzellen. Vorsichtig 3 ml gelöscht Produzent Zellüberstand, um Zellen mit der langsamsten Geschwindigkeit Pipette Ziel. Vermeiden Pipettieren direkt auf die Zellen, um zu vermeiden Aufbrechen der Zellmonoschicht. Dieser Schritt muss man gut gemacht werden zu einem Zeitpunkt.
4. Wenn alle Proben wurden transVorzugs, kehren die Zielzellen in den Inkubator zu Sedimentation trVLPs und Infektion der Zielzellen zu ermöglichen.
5. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur in der Glo-Lyse-Puffer, resuspendieren Produzentenzellen in der Lyse-Puffer mit einer Mikropipette zu 150 ul eingestellt, und übertragen Sie die Probe in ein 2 ml Kryoröhrchen. An diesem Punkt können Lysate bei -80 ° C eingefroren oder direkt gemessen, wie in Abschnitt 6 beschrieben.
6. 24 Stunden nach der Infektion, entfernen Sie den Überstand von den Zielzellen. 4 ml pro Vertiefung DMEM5 zu den Zellen. Dieser Schritt kann bis zu drei Vertiefungen in einer Zeit durchgeführt werden, wenn die Vertiefungen identische Proben (ansonsten aufgrund der selbstverstärkenden Art der trVLPs in diesem System kann eine Kreuzkontamination zu einem Problem werden, und dieser Schritt sollte Ein gut durchgeführt zu einem Zeitpunkt).

5. Ernte von Zielzellen für eine Single Cycle-Infektion

1. Wenn nur eine einzige Infektionszyklus sollte beurteilt werden, bei 72 Stunden nach der Infektion zu entfernen ter Stand von den Zielzellen mit einem Vakuumschlauch.
2. Ernten Sie die Zellen in 250 ul Glo Lyse-Puffer, wie in Kapitel 4 für Produzentenzellen beschrieben.

6. Ernte der Zielzellen und Dauer Passagierung von trVLPs

1. Wenn trVLPs kontinuierlich agiert werden, bereiten eine neue Reihe von Zielzellen, wie in Kapitel 3 beschrieben, so dass sie bereit sind für die Infektion 72 Stunden nach der Infektion des ersten Satzes von Zielzellen (siehe Abbildung 5) sind.
2. Infizieren den neuen Satz von Zielzellen, wie in Abschnitt 4 beschrieben (unter Verwendung des ersten Satzes von Zielzellen anstelle der Produzentenzellen).
3. Wiederholen Sie diese Schritte alle 72 Stunden.

7. Analyse der Reporteraktivität

1. Wenn Zelllysate wurden eingefroren, aufgetaut bei Zimmertemperatur. Stellen Sie sicher, dass Proben Raumtemperatur vor der Messung erreicht.
2. Tauen die erforderliche Menge (40 ul pro Probe) von Renilla Glo Assay-Puffer (idealerweise eingefroren in Aliquote) bei Raumtemperatur. Sicherzustellen, dass die Pufferraumtemperatur vor der Messung erreicht hat.
3. Fügen ^1/100 Volumen von Renilla Glo Substrat auf die Renilla Glo Assay-Puffer zu Renilla Glo Reagenz zu erhalten, und durch Vortexen mischen. Pipette 40 ul der Renilla Glo Reagens in einer weißen 96-Well-Platte.
4. Dann werden 40 ul der Probe auf die Renilla-Glo Reagenz. 10 Minuten warten, dann mit einer Integrationszeit von 1 s gemessen, die Proben in ein Luminometer.

Ergebnisse

Transfektion von 293-Zellen mit Produzent Expressionsplasmide das Ebola-Virus Nukleokapsidproteine ​​NP, VP35, VP30 und L, ein tetracistronic Minigenom und die Zubehör T7-Polymerase Ergebnisse in Minigenom-Replikation und-Transkription und-Reporteraktivität, die leicht bei 72 h (Abbildung 6 nachweisbar ist kodiert ). Wichtig ist, dass die beobachtete Reporteraktivität (10 ^5.6 relativen Lumineszenz-Einheiten (RLU)) größer als die einer Negativkontrolle, in der das Expressionsplasmid Codierung L wurde aus der Transfektion (10 ³ RLU) um mehr als 2 log weggelassen. Das niedrige Niveau der Aktivität auch in Abwesenheit von L beobachtet wird, ist aufgrund einer kryptischen Promotor in der Minigenom-Plasmid am wahrscheinlichsten. Zielzellen mit trVLPs aus dem Überstand von Erzeugerzellen infiziert tatsächlich zeigen etwas erhöhte Reporteraktivität im Vergleich zu den Produktionszellen und Werte erreichen zwischen 10 ⁶ und 10 ⁷ RLU, abhängig von dem Durchgang. Im Gegensatz dazu wHenne der Überstand der L Steuerproduzentenzellen auf Zielzellen passagiert (alle Nukleokapsid-Protein exprimieren, einschließlich L), hat die Reporteraktivität nicht das Hintergrundrauschen des Luminometer (ca. 10 ² RLU) überschreiten.

Die tetracistronic trVLP Test kann verwendet werden, um den Lebenszyklus von Ebola-Viren zu untersuchen. Zum Beispiel ist die Infektion von 293-Zellen mit trVLPs abhängig von der Anwesenheit der Bindung von Faktoren wie ^Tim-1-16, die in trans in diesen Zellen vorgesehen werden muss. Folglich wird in einem tetracistronic trVLP Assay ein Tropfen auf die Reporteraktivität in Zielzellen von etwa 100-fach in Abwesenheit von Tim-1 (7A) beobachtet. Die Rolle von spezifischen (virale oder zelluläre) Proteine ​​im Viruslebenszyklus kann auch mit RNAi-Technologie zusammen mit diesem Ansatz bewertet werden. Als Beispiel Herunterregulierung der L Ergebnisse RNAi-vermittelte in einem Rückgang der Reporter-Aktivität von etwa 100-fache, was auf die zentrale Rolle von LReplikation und Transkription (7B) ^7. Ferner ist es möglich, das Minigenom, um die Wirkung der Mutationen auf die Virus-Lebenszyklus zu bewerten direkt zu manipulieren. Als Beispiel, wenn VP24-Expression aus dem Minigenom erfolgt mit 3 Stopp-Codons unmittelbar hinter dem Start-Codon abgeschafft, Reporteraktivität in Produzentenzellen ist nicht dramatisch verändert; Jedoch ist die Reporteraktivität in den Zielzellen um etwa das 20-fache nach einem Durchgang und 400-fach nach zwei Durchgängen reduziert, was auf eine Rolle von VP24 in der Produktion von infektiösen trVLPs (7C) ^15.

Abbildung 1. Struktur des Ebola-Virus-Genom sowie monocistronischen und tetracistronic Minigenome. Kodierenden Regionen für das Ebola-Virus-Protein als rot dargestellt (NP,VP35, VP30 und L), Gelb (VP40 und VP24) oder blau (GP _1,2) Boxen. Nicht-kodierenden Regionen (NCR) sind grün markiert, mit dem Führer und Anhänger Regionen angezeigt. Der Index gibt an, welche Virus NCR wurde für die Verbindung der kodierenden Regionen verwendet. Die kodierende Region für die Reporter (rep) in lila dargestellt.

Abbildung 2. monocistronischen Minigenom-Assay. Zellen werden mit Expressionsplasmiden für die Ebola-Virus Nukleokapsidproteine ​​(NP, VP35, VP30, L), ein monocistronischen Minigenom (mg) und der T7-Polymerase transfiziert. Die Minigenom wird zunächst von der T7-Polymerase (a) in eine unencapsidated Minigenom-RNA in der gleichen Orientierung wie das virale Genom (vRNA), die dann von NP (b) eingekapselt transkribiert. Diese eingekapselt vRNA wird über einen komplementären RNA-Minigenom repliziert (cRNA) Zwischenprediate (c), und dann in Reporter-mRNAs (d), die in Reporterprotein (e) übersetzt werden transkribiert.

Abbildung 3. trVLP Assay mit einem monocistronischen Minigenom. Zellen werden mit Expressionsplasmiden für die Minigenom Assay-Komponenten (das Ebola-Virus Nukleokapsidproteine ​​NP, VP35, VP30, L, ein monocistronischen Minigenom und die T7-Polymerase) sowie VP40, GP ₁ transfiziert _{, 2} und VP24. Dies führt zu der Bildung von trVLPs die Minigenom haltigen Nukleokapsiden (F) aufzunehmen. Diese können dann trVLPs infizieren Zielzellen (g), die entweder mit Expressionsplasmiden für NP, VP35, VP30 und L (oben) pretransfected werden, was bei der Replikation und sekundäre Transkription (d), was zu Reporter-Expression (e) oder naiv Zielzellen (unten), wodurch die Transkription der primären minigenomes (h), auch Reporter-Expression (e) führt.

Abbildung 4. trVLP Assay mit einem tetracistronic Minigenom. Zellen werden mit Expressionsplasmiden für die Ebola-Virus Nukleokapsidproteine ​​(NP, VP35, VP30, L), ein tetracistronic Minigenom (mg) und der T7-Polymerase transfiziert. Start der Transkription (a), die Verkapselung (b), Genomreplikation (c) und Transkription (d) sowie der Übersetzung (e) wie in einem monocistronischen Minigenom-Test auftreten. (F) jedoch neben Reporter-mRNA, mRNA für VP40, VP24 GP _1,2 und werden auch aus der tetracistronic Minigenom transkribiert wird, was zur Bildung von trVLPs. Diese trVLPs infizieren Zielzellen, die mit Expressionsplasmiden für die Nukleokapsid-Proteine ​​NP, VP35, VP30 und L sowie der zellulären Ebola Virus pretransfected wurdenAnheftungsfaktor Tim-1, was zu einer Genom-Replikation und-Transkription und die Produktion von trVLPs, die verwendet werden können, um neue Zielzellen zu infizieren.

Figur 5 Zeitsteuerung eines tetracistronic trVLP Assay für 3 aufeinanderfolgende Passagen. Die Tage der Aussaat Zellen (en), Transfektion von Zellen (t), Infizieren von Zellen (i), Mediumwechsel (c) und Ernten von Zellen und trVLPs (h) für drei aufeinanderfolgende Durchgänge angegeben (durch Pfeile angedeutet).

Abbildung 6. Typische Konzentrationen in einem tetracistronic trVLP Assay beobachtet Reporteraktivität. Ein tetracistronic trVLP Assay wurde über 5 Passagen nach der Protoc durchgeführtol in diesem Manuskript beschrieben. Als Negativkontrolle wurde das Expressionsplasmid Codierung L wurde (L) von der Transfektion der p0 Erzeugerzellen weggelassen. Zielzellen in den Durchgängen P1 bis P5 wurden mit Expressionsplasmiden für alle Nucleocapsid-Proteine, einschließlich L. Das Hintergrundrauschen des Luminometers ist als gestrichelte Linie angegeben transfiziert. Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 biologischen Replikaten von 3 unabhängigen Experimenten gezeigt.

Abbildung 7. Die Beurteilung der Auswirkungen verschiedener viraler und zellulärer Faktoren auf die viralen Lebenszyklus mit tetracistronic trVLPs. (A) Tim-1 als eine Anlage Faktor. Zielzellen, die mit Expressionsplasmiden, kodierend für die Nukleokapsid-Proteine ​​mit oder ohne Plasmid kodierend für Tim-1 ⁽¹⁵⁾ beschrieben wurden, wurden mit pretransfected tet infiziertracistronic trVLPs. 72 Stunden nach der Infektion Reporteraktivität in p1 Zielzellen bestimmt. Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 biologischen Replikaten von 4 unabhängigen Experimenten sind. (B) Effekt von RNAi-Knockdown von L auf Genom-Replikation und Transkription Zielzellen, die mit Expressionsplasmiden für die Nukleokapsid Komponenten pretransfected wurden, Tim-1 und miRNAs gegen gerichtet gezeigt. L (Anti-L) oder ein nicht verwandtes Protein (anti-GFP) (in ¹⁵ beschrieben) wurden mit tetracistronic trVLPs infiziert. 72 Stunden nach der Infektion Reporteraktivität in p1 Zielzellen bestimmt. Mittelwerte und Standardabweichungen von 5 biologischen Replikaten von 2 unabhängigen Experimenten sind in der Minigenom auf trVLP Infektiosität gezeigt. (C) Effekt von Mutationen. Ein tetracistronic trVLP Test wurde durchgeführt, entweder mit einem Wildtyp-Minigenom (4cis-WT) oder ein Minigenom in die 3 Stopcodons hatte unmittelbar nach dem Start-Codon des VP24 eingeführt worden ist, zur Aufhebung exprimieren of dieses Protein aber Einführen nur minimale Änderungen an der Minigenom in Bezug auf Länge, Nukleinsäurezusammensetzung, Sekundärstrukturen usw. Reporteraktivität in P0, P1 und P2 wurde 72 h nach der Transfektion / Infektion gemessen. Mittelwert und Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten von 3 unabhängigen Experimenten gezeigt.

	Produzenten-Zellen (P0)	Zielzellen (P1 und höher)
pCAGGS-NP	125	125
pCAGGS-VP35	125	125
pCAGGS-VP30	75	75
pCAGGS-L	1000	1000
p4cis-vRNA-RLuc	250	-
pCAGGS-T7	250	-
pCAGGS-Tim1	-	250

Tabelle 1. DNA zur Transfektion beträgt. Die Menge jedes Plasmid für die Transfektion von Produzenten und Zielzellen erforderlich ist, in ng pro Well einer 6-Well-Platte dargestellt. Alle Plasmide werden in Watt et al ¹⁵ beschrieben.

Diskussion

Die in diesem Manuskript beschrieben tetracistronic trVLP Assay ermöglicht die Modellierung des Ebola-Virus-Lebenszyklus über mehrere Infektionszyklen. Wichtig ist, die in diesem System produziert trVLPs enthalten nicht die genetische Information für die Nukleokapsidproteine ​​NP, VP35, VP30 und L, die zusammen fast 60% des Ebola-Virus-Genom und sind essentiell für die virale Replikation. Vielmehr müssen diese Proteine ​​in Zielzellen in trans von Expressionsplasmiden zur Verfügung gestellt werden, und jede Infektion der Zellen nicht exprimiert alle 4 dieser Proteine ​​fehl. Wichtig ist, gibt es keine Hinweise auf die genetische Rekombination für Filoviren, und es gibt keine homologen Bereiche zwischen tetracistronic Minigenom und den Expressionsplasmiden für die Nukleokapsid-Proteinen geteilt. Deshalb gibt es weder eine praktische noch eine theoretische Beweise Basis, die für die Möglichkeit der Erzeugung von voller Länge Ebola-Virus-Genome, die dann möglicherweise in Folge haben könnte bieten könntedie Produktion von infektiösen Viren Ebola, so dass dieses System sicher für den Einsatz unter BSL2- Bedingungen.

Es gibt zwei wichtige Schritte in der tetracistronic trVLP Test, der von experimentellen Bedingungen beeinflusst werden, also die Produktion von trVLPs, und die Infektion der Zielzellen mit diesen trVLPs. Herstellung von trVLPs abhängt hohen Minigenom-Replikation und-Transkription, der wiederum von einem hohen Transfektionseffizienz. Transfektionseffizienz leicht, indem ein L Steuerung, bei der das Expressionsplasmid für L ist für ein Expressionsplasmid eGFP codiert ausgetauscht bewertet. Transfektionsraten unter diesen Bedingungen sollte durch Inspektion mit einem Fluoreszenzmikroskop 24 Stunden nach der Transfektion 50% überschreiten. Weiterhin haben Zellen frei von Mykoplasmen zu sein, da nach unserer Erfahrung Mykoplasmen-Kontaminationen dramatisch beeinträchtigt Minigenom-Replikation und Transkription (unveröffentlichte Daten). Aufgrund ihrer hohen Transfizierbarkeit 293 cells sind die Zelllinie der Wahl für trVLP Assays; Jedoch sind diese Zellen relativ schlecht anfällig (wenn auch nicht vollständig Brechungs) nach Infektion mit Ebola-Virus ^16. Expression eines Befestigungsfaktor, wie Tim-1 erhöht Infektion von 293-Zellen mit trVLPs etwa 100-fach, und ist entscheidend für den Erfolg dieses Systems über mehrere Passagen.

Während tetracistronic trVLPs nicht selbst replizieren auf ihre eigenen, sie sind selbst replizieren in Zellen, die die Nukleokapsidproteine ​​auszudrücken. Als solche müssen Vorkehrungen getroffen werden, um Kreuzkontaminationen zwischen den Wells mit verschiedenen trVLPs (zB mit unterschiedlichen Mutationen im Minigenom) zu vermeiden. Von einem technischen Standpunkt aus gesehen, aufgrund der großen Differenz zwischen positiven und negativen Signalen in diesem Assay (ca. 4 Stamm), ein Übersprechen zwischen den Proben bei der Messung der Luciferase-Aktivität, kann ein Problem sein; dies kann jedoch leicht durch Verlassen einer leeren Brunnen zwischen jeder Probe in die vermieden werden96-Well-Platte für die Messung Luciferase-Aktivität verwendet.

Es gibt eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für tetracistronic trVLPs. Offensichtlich sind sie gut geeignet für die Untersuchung der Eingabe filovirus Teilchen, da Infektions trVLPs die typische gewindeartigen Struktur von Infektions Filoviren ¹⁴ und enthalten die gleichen Komponenten, wie virale Partikel filovirus. Wichtig ist, die nicht Bestandteil anderer Viren enthalten, wie es der Fall bei der Verwendung von pseudotypisierten Virionen oder virusartigen Partikeln, wie Retroviruspartikel tragenden GP _1,2 oder rekombinanten Viren, wie rekombinantes Virus der vesikulären Stomatitis exprimieren GP _1,2 . Die Anforderung für die Befestigung Faktoren bei der Verwendung 293-Zellen als Zielzellen in diesem System können zum Screening genutzt und untersuchen die Rolle solcher Haftungsfaktoren, während die Rollen der anderen zellulären Faktoren, wie die in der Genom-Replikation und Transkription beteiligt sowie Morphogenese und Knospeding, kann mit Hilfe der RNAi-Technologie untersucht werden. Der Effekt von Mutationen in der viralen Proteine ​​auf der Viruslebenszyklus kann auch untersucht werden, auch wenn man im Hinterkopf behalten, dass, während VP40, GP _1,2 und VP24 sind nach der viralen Transkription ausgedrückt, wird die Expression der viralen Proteine ​​von anderen Ausdruck erreicht Plasmide, so dass Effekte aufgrund der Überexpression dieser Proteine ​​müssen berücksichtigt werden. Außerdem sollte darauf geachtet werden, dass Mutationen in der Minigenom nicht wesentlich über die Länge des Minigenoms ändern, da die Reporteraktivität direkt von Minigenom Länge ¹⁵ berührt. Da schließlich tetracistronic Minigenome sind virale Genom-Analoga, die Virusgene tragen, und werden durch die virale Polymerase-Komplex repliziert, sollte es auch möglich sein, um die Entwicklung dieser Gene als Antwort auf Mutationen unter BSL2 Bedingungen zu studieren. Während also noch weitere Studien in dieser Richtung erforderlich ist, sollte es möglich sein, beispielsweise zur Einführung suboptimalMutationen in Genen innerhalb der Minigenom und dann Durchgang, bis trVLPs kostenlose Mutationen entstehen.

Eine Einschränkung des tetracistronic trVLP Assay, der beachtet werden muss, ist die Tatsache, dass, während es die meisten Modelle des Virus-Lebenszyklus, primäre Transkription in Zielzellen wird durch dieses System nicht modelliert, da die Zielzellen haben, die Nucleocapsid-Proteine ​​in trans auszudrücken Damit die trVLPs zu replizieren. Wenn primäre Transkription ist zu bewerten, ist es möglich, naive Zielzellen ¹⁰ zu verwenden; aber in diesem Fall kein Genom-Replikation in Zielzellen erfolgt und keine weiteren infektiösen trVLPs erzeugt, Abbrechen der Infektion. Dies ist ein Hauptproblem, das nicht ohne Rendering die trVLPs komplett selbst replizieren, indem die Gene für die Proteine ​​in das Nukleokapsid Minigenom, die de facto machen sie zu infektiösen rekombinanten Viren Ebola würde überwunden werden können. Tatsächlich EbolA-Viren exprimieren Luciferase oder andere Reporter wurden generiert und können verwendet werden, um zu beurteilen und zu studieren Genom-Replikation und Transkription werden ^17,18; allerdings ist ihr Einsatz auf BSL4 Labors beschränkt. Außerdem hat es zu berücksichtigen, dass während VP40, GP _1,2 und VP24 von einem viralen Genoms analogen Ausdruck, ihre Position in der Minigenom gehalten werden ^{(2., 3.,} und ^4. Transkriptionseinheit) ist nicht identisch mit ihre Position in dem viralen Genom ^{(3., 4., 6.} und Transkriptionseinheit), die die absolute Expressionsniveaus sowie ihre relativen Expressionsniveaus gegeneinander beeinflussen.

Insgesamt ist die tetracistronic trVLP Assay stellt die umfassendste Lebenszyklus-Modellierungssystem für Ebola-Viren bisher verfügbaren und ermöglicht die Modellierung von Genom-Replikation und Transkription, Partikel Morphogenese und angehenden sowie Befestigung und enversuchen in Zielzellen über mehrere Infektionszyklen. Als solche hat sie ein enormes Potenzial für den Einsatz bei der Untersuchung der Biologie von Ebola-Viren unter BSL2- Bedingungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
75 cm2 Zellkulturflasche	Corning
DMEM	Sigma	D6546	auf 37 ° vorheizen; C vor dem Gebrauch
FBS	Life Technologies	26140-079	Hitzeinaktivierung 30 min @ 56 ° C
L-Glutamin	Life Technologies	25030-081	100x
Pen/Strep	Life Technologies	15070-063	100x 0,25
% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056
PBS			8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, H2O 1 L hinzufügen; Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern
6-Well-Platten	Costar	3516
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
Glo lyse Puffer	Promega	E2661
Renilla Glo Luciferase Assay System	Promega	E2720
96 Well Assay Platte (weiß)	Costar	3912
Modulus Mikroplatten-Luminometer	Turner Microsystems	998-9300