Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Prinzipien und Techniken zur Messung und Berechnung der glomerulären Filtrationsrate, der Urinflussrate und der Ausscheidung von Natrium und Kalium bei einer Ratte zu demonstrieren. Diese Demonstration kann verwendet werden, um den Schülern ein allgemeines konzeptionelles Verständnis dafür zu vermitteln, wie die Nierenfunktion gemessen werden kann.
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Methodenartikel
Physiology Lab Demonstration: glomeruläre Filtrationsrate in einem Ratten-
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Messungen der glomerulären Filtrationsrate (GFR) und der fraktionierten Ausscheidung von Natrium (Na) und Kalium (K) sind entscheidend für die Beurteilung der Nierenfunktion bei Gesundheit und Krankheit. GFR wird gemessen als die renale Clearance von Inulin, das am Glomerulus gefiltert, aber nicht entlang des Nephrons sezerniert oder resorbiert wird. Die fraktionierte Ausscheidung von Na und K kann aus der Konzentration von Na und K im Plasma und Urin bestimmt werden. Die renale Clearance von Inulin kann bei einem anästhesierten Tier nachgewiesen werden, das Katheter in der Oberschenkelarterie, der Oberschenkelvene und der Blase hat. Die für dieses Verfahren verwendeten Geräte und Hilfsmittel sind diejenigen, die in einer Forschungseinrichtung üblich sind, und machen dieses Verfahren somit zu einem praktischen Mittel zur Messung der Nierenfunktion. Der Zweck dieses Videos besteht darin, die Verfahren zu demonstrieren, die für die Durchführung einer Labordemonstration erforderlich sind, bei der die Nierenfunktion vor und nach einem Diuretikum beurteilt wird. Die vorgestellte Technik kann zur Beurteilung der Nierenfunktion in Rattenmodellen für Nierenerkrankungen verwendet werden.
Einleitung
Die wichtigste Funktion der Niere ist die homöostatische Regulierung des extrazellulären Wasser- und Elektrolytgehalts. Die Nieren regulieren das extrazelluläre Wasser, Natrium (Na) und Kalium (K) genau, um ein normales physiologisches Niveau aufrechtzuerhalten. Störungen der Nierenfunktion können zu schwerwiegenden Stoffwechselstörungen führen, die tödlich verlaufen können. Der grundlegende Nierenprozess findet im Nephron statt und beginnt mit der Filtration des Plasmas am Glomerulus und endet mit der Ausscheidung des Urins. Weitere Prozesse, die die endgültige Konzentration von Wasser, Na und K im Urin bestimmen, sind die Sekretion und die Reabsorption im Nephron. Messungen der glomerulären Filtrationsrate (GFR) und der fraktionierten Ausscheidung von Na und K sind entscheidend für die Beurteilung der Nierenfunktion bei Gesundheit und Krankheit. Der Leser wird auf zuvor veröffentlichte Übersichtsartikel und Lehrbücher verwiesen, um die Nierenfunktion1-4 gründlicher zu erörtern.
GFR kann gemessen werden als die renale Clearance von Inulin, das am Glomerulus gefiltert, aber nicht entlang des Nephrons5 sezerniert oder resorbiert wird. Obwohl diese Technik eine Anästhesie, eine chirurgische Vorbereitung und ein Terminalexperiment erfordert, gilt sie als Goldstandard der GFR-Messung. Mit Inulin, das mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) markiert ist, kann die Plasma- und Urinkonzentration von FITC-Inulin leicht in kleinen Volumina gemessen und zur Berechnung der GFR zu mehreren Zeitpunkten eines Experiments verwendet werden. Die fraktionierte Ausscheidung von Na und K kann aus der Konzentration von Na und K im Plasma und Urin bestimmt werden.
Das konzeptionelle Verständnis, wie die Nierenfunktion gemessen werden kann, kann leicht in einem kurzen Labor demonstriert werden, das den Schülern die aktive Teilnahme an einigen Aspekten des Experiments ermöglicht. Dieses Video zeigt die Vorbereitung vor dem Labor, die Demonstration der Nierenfunktion und die Auswertung der Ergebnisse nach dem Labor. Die chirurgischen Techniken, die für die Messung der GFR erforderlich sind, werden an einer anästhesierten Ratte demonstriert. Darüber hinaus werden Beispielrechnungen für GFR und die fraktionierte Ausscheidung von Na und K vor und nach der Verabreichung eines Diuretikums gezeigt.
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Protokoll
Vor jeder Tierverfahren muss der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) das Protokoll zu genehmigen. Das Protokoll wurde von der Michigan State University IACUC genehmigt.
1. Pre-lab Herstellung von FITC-Inulin-Lösung
- Warm 20 ml Kochsalzlösung auf 70 ° C langsam einrühren 100 mg FITC-Inulin (5 mg / ml FITC-Inulin), bis alle Inulin gelöst.
- Coole Lösung für RT und fügen Sie 800 mg Rinderserumalbumin (40 mg / ml BSA, gefriergetrocknetes Pulver, im wesentlichen Globulin frei, Endotoxin, ≥98% Reinheit durch Agarose-Gelelektrophorese).
- Filtern Sie die Inulin-BSA-Lösung mit Filterpapier (Grad 1). Legen Sie die filtrierte Lösung in einem 20-ml-Spritze mit einer Spritze-tip Filter (0,2 um) und mit Folie abdecken, um vor Licht zu schützen.
2. Anästhesie und Chirurgie
- Legen Sie die Ratte in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran gefüllt Anästhesie zu induzieren. Nehmen body Gewicht (250-350 g) und legen Sie die Ratte auf einem beheizten chirurgische Plattform, die 37 ° C Körpertemperatur während des Experiments zu erhalten. Sichern Sie vorsichtig die Ratte auf die Plattform mit Labor-Band in den Pfoten. Aufrechterhaltung einer Narkose mit 1-2% Isofluran mit medizinischer Qualität 100% O 2 in Luftströmungsgeschwindigkeit von 0,8 bis 1,0 l / min.
- Legen Sie eine verjüngte Katheter (intravaskuläre Spitze OD, 2.7F) in die Oberschenkelarterie für Blutdruck und Herzfrequenzmessung und Blutabnahme.
- Legen Sie einen Katheter (PE-50) in die Oberschenkelvene für Inulin Infusion. Sichern Sie den Katheter umgebende Gewebe mit 5-O geflochtenen Seide chirurgisches Naht 6.
- Befestigen Sie den arteriellen Katheter mit einem DMS-Druckaufnehmer. Aufzeichnung des Blutdrucks und der Herzfrequenz mit Datenerfassungssoftware und Anzeige auf einem Computerbildschirm in Echtzeit. Diese Technik wird im Detail auf Video 6 gezeigt.
- Setzen Sie die Blase über einen suprapubischen Einschnitt. Schneiden Sie ein kleinesLoch in der Spitze der Blase und legen Sie eine Kanüle (PE-190) mit einer Wärme abgefackelt Spitze in der Blase zur Urinsammlung. Sichern Sie die Kanüle in die Blase mit einer Tabaksbeutelnaht.
3. Urin- und Blutentnahme
- Die Spritze wird von FITC-Inulin in einer Spritzenpumpe mit Durchflussrate einzustellen von 1 ml / h pro 100 g Körpergewicht (3 ml / h bei einer Ratte mit einem Gewicht von 300 g). Befestigen Sie die Spritze in die Vena femoralis-Katheter. Starten Sie das Inulin Infusion und ermöglichen eine 1-2 hr Äquilibrierungsperiode. Halten Spritze mit Folie zum Schutz vor Licht bedeckt.
- Festzustellen, ob Urinflußrate stabil und angemessen für die Probenanalyse (20 ul / min) durch Sammeln einer Urinprobe in ein vorher gewogenes Sammelgefß für einen Zeitraum von 10 min. Bestimmen Sie Urinvolumen gravimetrisch mit einer digitalen Waage. Eine ausreichende Urinvolumen für eine 10 min Erfassungszeitraum beträgt 0,2 ml. Weiterhin Urinproben zu sammeln, bis zwei aufeinanderfolgenden Sammlungen zeigen eine Urinflussrate von 20 ul / min oder mehr.
- Pre-Drug Samples
- Sammeln einer Urinprobe während eines 20 min Periode. Sammeln einer Blutprobe (0,5 ml) aus dem Arterienkatheter in der Mitte des Urinsammelperiode. Seien Sie vorsichtig, um ganz klar den arteriellen Katheter von Kochsalzlösung vor dem Sammeln einer Blutprobe in einer Sammlung Fläschchen mit 1 U Heparin. Verwenden Sammlung Fläschchen mit Volumenmarkierungen, um die Sammlung von 0,5 ml des arteriellen Blutes zu erleichtern.
- Spülen der arterielle Katheter mit Heparin-Kochsalzlösung (20 U / ml), um den Katheter von Blut (ca. 0,1 ml) gelöscht. Die Länge der arteriellen Katheter sollte so kurz wie möglich sein, um das Volumen der Heparin-Kochsalzlösung benötigt, um bündig zu begrenzen.
Hinweis: Das verwässerte Blutproben ungenaue Berechnungen der GFR und gebrochene Ausscheidung von Na und K. - Warten Sie 10 Minuten, und wiederholen Sie die Sammlung von einer zweiten Pre-Droge Urin und Blutprobe.
- Nach der Sammlung von zwei Pre-Drogenproben, verwalten ein Diuretikum drug, Furosemid (10 mg / kg) über den arteriellen Katheter. Spülen Sie den arteriellen Katheter mit heparinisierter Kochsalzlösung, um den Katheter von Drogen löschen. Kümmern, um die Injektion von Luft durch den arteriellen Katheter zu verhindern. Notieren Sie sich die Zeit des Furosemid Injektion.
- Post-Drogen Samples: An jedem der 3 Zeitpunkte unter, sammeln eine Urinprobe während eines 10 min Erfassungszeitraum, und eine Blutprobe (0,5 ml) in der Mitte des Urinerfassungszeitraum.
- Für Post-Drug Probe 1 - sammeln fünf Minuten nach Furosemid.
- Für Post-Drug Probe 2 - sammeln zehn Minuten nach Furosemid.
- Für Post-Drug Probe 3 - sammeln fünfzehn Minuten nach der Furosemid.
- Nachdem alle Proben gesammelt worden sind, euthanize die Ratte gemäß institutionellen Verfahren durch Thorakotomie und Entfernung des Herzens. Entfernen Sie die beiden Nieren. Decapsulate (entfernen Sie die umgebenden Membran) und tupfen Sie die Nieren, um überschüssiges Blut zu entfernen. Wiegen die Nieren.
4. Probenanalyse
- Messen Sie alle Urinprobenvolumen gravimetrisch mit einer Digitalwaage und Rekordgewichte.
- Zentrifuge Vollblutproben mit einem Tischzentrifuge (1800 x g), um Plasma abzutrennen. Übertragen Plasmaproben, kleine Fläschchen beschriftet.
- Analysieren Na und K-Konzentrationen in Urin und Plasma-Proben mit einer Natrium / Kalium-Analysator.
- Messung von FITC-Inulin in Plasma und Urin
- Verdünnter pre-drug Harn (von 1: 200 bis 1: 400), und post Medikament Urin (1:10) mit HEPES-Puffer (500 mM, pH 7,4).
- In 40 ul Standard oder Probe und 60 ul HEPES-Puffer in einer 96-Well-Platte (eine Probe pro well) und lassen Sie sie für 10 Minuten mischen mit Aluminiumfolie abgedeckt, während.
- Erzeugen eine Standardkurve für FITC-Inulin-Konzentrationen von 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Abbildung 1). Bestimmen Sie FITC-Inulin Fluoreszenz in Proben und Standards unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader mit der Ex-Zitat und Emissionswellenlängen von 485 und 538 nm.
- Setzen Sie die Werte für die Fluoreszenzstandards zu einem 4-Paramter logistische Funktion Regressionsanalyse. Die Regressionsfunktion Parametern werden FITC-Inulin-Konzentration im Plasma und Urinproben (Tabelle 1) zu berechnen.
5. Post-lab Ergebnisanalyse Berechnungen
- Berechnen Urinflussrate (UV; ml / min): [Volumen der Urin gesammelt (ml)] ÷ [Zeitpunkt der Erhebung (min)]
- Berechnen glomerulären Filtrationsrate (GFR; ml / min): [Urin-Inulin-Konzentration (ug / ml) x UV (ml / min)] ÷ [Plasma Inulin konz. (Ug / ml)]
- Berechnen Gefilterte Sodium Load (umol / min): Plasma-Natrium-Konzentration (& mgr; mol / ml) x GFR (ml / min)
- Berechnen Natriumausscheidungsrate (U Na V; mol / min): Urin-Natrium-Konzentration (& mgr; mol / ml) x UV (ml / min)
- Berechnen Fractional Ausscheidung von Natrium (Na FE;%): [U Na V (& mgr; mol / min)] ÷ [Gefiltert Sodium Load (& mgr; mol / min)] x 100
- Berechnen Filtered Potassium Load (& mgr; mol / min): Plasma-Kalium-Konzentration (& mgr; mol / ml) x GFR (ml / min)
- Berechnen Kaliumausscheidung Rate (U K V; & mgr; mol / min): Urinkaliumkonzentration (& mgr; mol / ml) x UV (ml / min)
- Berechnen Fractional Ausscheidung von Kalium (FE K;%): [U K V (& mgr; mol / min)] ÷ [Gefiltert Potassium Load (& mgr; mol / min)] x 100
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Ergebnisse
Die im Labor Demonstration verwendet Diuretikum Furosemid war die sehr schnell hemmt die Wiederaufnahme von Na und K von der Niere zu einer erhöhten Na, K und Wasserausscheidung innerhalb von Minuten nach der Arzneimittelverabreichung filtriert. Durch seine primäre Mechanismus sollte Furosemid minimale Auswirkungen auf die GFR und dem gefilterten Last von Na und K, aber wird Harnfluss und fraktionierte Ausscheidung von Na und K zu erhöhen
Die repräsentativen Ergebnisse in Tabelle 3
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Diskussion
Ein geeigneter Marker für die GFR Messung muss vier Kriterien erfüllen: frei im Glomerulus filtriert werden, sein ungebundenes an Plasmaproteine, und weder absorbiert noch im Nephron sezerniert werden. Inulin ist ein Fructose-Polymer, das diese Kriterien erfüllt. Als Ergebnis wird die renale Clearance von Inulin als Goldstandard für die Messung GFR 7. Das demonstriert Technik stellt den traditionellen Ansatz zur Bestimmung der renalen Clearance von Inulin am Urin Sammlungen während einer konstanten Infusion v...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Die Meinungen oder Aussagen im vorliegenden Dokument sind die privaten Ansichten des Autors aus und sind nicht als offizielle oder als Ausdruck der Ansichten der Abteilung der Armee oder das Verteidigungsministerium aufgefasst werden.
Danksagungen
Die Finanzierungsquelle für das Labor Demonstration war NIGMS Zuschuss: GM077119. Wir danken Herrn Dr. Joseph R. Haywood und Dr. Peter Cobbett für ihre Unterstützung des Kurz Couse in Integrative und Organsysteme Pharmakologie. Wir danken auch Frau Hannah Garver für ihre technische Unterstützung des Labors Demonstration.
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Materialien
5-0 Geflochtenes chirurgisches Seidennahtmaterial Surgical Specialties Corp SP1033 Assay-Platte, 96-Well-Costar 3922 Rinderserumalbumin Sigma Chemical Co A2934-25G Zentrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Konische Probenröhrchen Dot Scientific Inc. #711-FTG Applikatoren mit Wattespitze Solon Manufacturing Co 56200 Datenerfassungssoftware ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Skalieren Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Mullschwämme Covidien 2146 Beheizte Operationsliege EZ-Anästhesie EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isofluran Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isofluran-Verdampfer EZ-Anästhesie EZ-190F Mikrodisparierzange Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Mikroplatten-Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Natrium/Kalium-Analysator NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Nadelhalter mit Schere Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (für Blasenkatheter) BD Medical 427435 Druckmessumformer ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Chirurgische Schere Fine Science Tools 91402-12 Chirurgische Handschuhe Kimberly-Clark Sterling Nitril Handschuhe Spritzenpumpe Razel Scientific R99-E Gewebezange Fine Science Tools 91121-12 Gewebeschere George Tiemann Tel. 105-420
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5-0 Geflochtenes chirurgisches Seidennahtmaterial | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Assay-Platte, 96-Well-Costar | 3922 | ||
| Rinderserumalbumin | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
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| Olsen-Hegar Nadelhalter mit Schere | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (für Blasenkatheter) | BD Medical | 427435 | |
| Druckmessumformer nbsp; | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Kulturröhrchen | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Ratte Femur Tapered Arterienkatheter | Strategische Anwendungen Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemid 5% | Intervet | #34-478 | |
| Strabismus Schere | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Student Chirurgische Schere | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Chirurgische Handschuhe | Kimberly-Clark | Sterling Nitril Handschuhe | |
| Spritzenpumpe | Razel Scientific | R99-E | |
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| Gewebeschere | George Tiemann Co | 105-420< | |
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