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EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay

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DOI:

10.3791/52437

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11. September 2016

 , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency

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Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Verfahren zur Messung der gesamten kultivierbaren Viren anhand der Buffalo Green Monkey Nierenzelllinie vor. Das Verfahren stellt ein standardisiertes Instrument zur Messung des Vorkommens infektiöser Viren in Umwelt- und Trinkwassern zur Verfügung.

Zusammenfassung

Eine standardisierte Methode ist erforderlich, wenn nationale Studien zum Vorkommen von Viren in Umwelt- und Trinkwassern mehrere analytische Laboratorien nutzen. Die Methode 1615 der U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) wurde mit dem Ziel entwickelt, einen solchen Standard für die Messung von Enteroviren und Noroviren in diesen Gewässern bereitzustellen. Das Virus wird mit einem elektropositiven Filter aus Wasser konzentriert, mit Rindfleischextrakt von der Filteroberfläche eluiert und dann durch organische Flockung weiter konzentriert. Hier stellen wir das Protokoll der Methode 1615 für die Filterelution, die Sekundärkonzentration und die Messung der gesamten kultivierbaren Viren vor. Ein Teil des konzentrierten Eluats aus jeder Probe wird auf zehn Replikkolben mit Buffalo Green Monkey-Nierenzellen geimpft. Die Anzahl der Kolben, die zytopathische Wirkungen zeigen, wird verwendet, um die wahrscheinlichste Anzahl (MPN) infektiöser Einheiten pro Liter zu quantifizieren. Die Methode verwendet eine Reihe von Qualitätskontrollen, um die Datenqualität zu erhöhen und Schwankungen zwischen und innerhalb von Laboratorien zu reduzieren. Laboratorien müssen definierte Leistungsstandards erfüllen. Methode 1615 wurde evaluiert, indem die Viruserholung aus Reagenzien und Grundwasser, das mit dem Sabin-Poliovirus Typ 3 besiedelt war, untersucht wurde. Die durchschnittliche Wiederfindung von Polioviren mit dem gesamten kultivierbaren Assay betrug 111 % in Wasser in Reagenzienqualität und 58 % im Grundwasser.

Einleitung

Enteroviren sind eine heterogene Gruppe von Viren, die den menschlichen Darm-System zu infizieren, und die über die fäkal-oral übertragen werden. Diese Viren geben Oberflächen- und Grundwasser durch Kläranlage und Klärgrube Abwasser, nicht richtig konstruiert oder gebrochen Klärgruben, kaputte Abwasserleitungen, Mischwassereinleitungen und andere Punkt und Nicht-Punktquellen 1-4. Infektionen des Menschen und Krankheiten von Wasser Viren auftreten durch den Verzehr von kontaminierten oder unzureichend desinfizierte Wasser oder durch Freizeit-Wasserkontakt. Krankheitssymptome können leichte bis schwere Gastroenteritis einzubeziehen; Bindehautentzündung; Fieber; oberen Atembeschwerden; Hand, Maul- und Klauenseuche; Myokarditis; aseptische Meningitis; Enzephalitis; Lähmung; Sepsis 5-8 und Tod 9,10.

USEPA-Methode 1615 sieht ein Verfahren vor infektiösen Partikel Enterovirus in der Umwelt- und trinken Wasser zu messen. Diese Gewässer kann ein enthaltenMischung von infektiösen und nicht-infektiösen Virionen, sondern nur die infektiösen Partikel stellen eine potentielle Gefahr für die Gesundheit. Infektiöse Viruspartikel verlieren Infektiosität im Laufe der Zeit in der Umwelt- und trinken Wasser aus dem Verlust von Protein - Kapsid Integrität, Schäden an Nukleinsäuren durch UV - Strahlung aus dem Sonnenlicht, und Schäden aufgrund irgendwelcher Desinfektionsmittel , die 11 bis 13 vorhanden sein können. Die gesamte Prozedur kultivierbaren Virus in dem Verfahren vorgesehen ist, bei der Herstellung von zytopathische Effekte (CPE) in der Buffalo Green Monkey Niere (BGM) Zelllinie basiert. Diese Zelllinie wurde aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Umwelt virology Feld gewählt 14,15, obwohl der Bereich von infektiösen Virustypen erkannt werden 15 hauptsächlich auf bestimmte Enteroviren beschränkt. Der Zweck dieses Papiers ist es Methode 1615 die Verfahren zur Elution von fünf Zoll elektropositiveren Patronenfilter, sekundäre Konzentration und Messung der gesamten kultivierbaren Viren zu beschreiben. Eine Auswertung derGesamtverfahren wird in Cashdollar et al. 16 beschrieben.

Protokoll

HINWEIS: Bitte beachten Sie zusätzliche Materialien Abschnitt S1 für eine Liste von Definitionen. Die QS-Verfahren im Zusammenhang mit US-EPA-Methode 1615 sind in der ergänzenden Materialien Abschnitt S2 beschrieben.

1. Filter Elutionsverfahren

  1. Erste Elution
    1. Platzieren 500 ml gepufferter 1,5% Rindfleischextrakt, pH 9,0, auf Raumtemperatur erwärmt in einem Meßzylinder. Öffnen Sie die Filterpatronengehäuse und fügen Sie eine ausreichende Menge an Rindfleischextrakt die elektro Filter vollständig zu bedecken. Ersetzen Sie das Filtergehäuse Deckel und gießen Sie die verbleibenden Rindfleischextrakt in einen sterilen Becher.
    2. Nach 1 min Kontaktzeit, vorbei an der Rindfleischextrakt-Lösung in dem Gehäuse zusammen mit dem in der sterilen Becherglas langsam durch den Filter verbleibende einen Druckbehälter oder peristaltische Pumpe. Sammeln Sie das Eluat in einen 2 l Becherglas.
  2. Zweite Elution
    1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1 zusätzlich 500 ml gepufferte 1,5% Rindfleischextrakt unter Verwendung von, Aber die Kontaktzeit bei Schritt 1.1.2 bis 15 min zu erhöhen.
    2. Fügen Sie den Rindfleischextrakt aus der zweiten Elution mit dem 2-Liter-Becher, dass von der ersten Elution enthält. In einer sterilen Rührstab in den Becher.

2. Organische Flockung Konzentrationsverfahren

  1. Sterilisieren eine Kombinationstyp pH-Elektrode mit 0,525% Natriumhypochlorit für mindestens 5 min. Spülen Sie die Elektrode mit sterilem dH 2 O und dann mit 0,05 M Natriumthiosulfat entchloren. Kalibrieren Sie den pH-Messgerät mit pH 4 und 7-Standards.
  2. Das Becherglas, das Eluat auf einer Rührplatte enthält. Schalten Sie die Platte und erhöhen die Rührgeschwindigkeit bis ein Wirbel gebildet wird.
  3. Der pH-Wert des Eluats auf 3,5 ± 0,1 langsam durch tropfenweise Zugabe von 1,2 M HCl zu dem Eluat. In der HCl tropfenweise, weil die schnelle Zugabe Virus inaktiviert. Während dieser Zeit wird das Eluat trüb wie ein Niederschlag zu bilden beginnt.
  4. Reduzieren Sie die Misch speed zu einem langsamen Umrühren und dann weiter den pH-Wert des Eluats auf 3,5 ± 0,1 bei Raumtemperatur für 30 min zu überwachen und zu warten.
  5. Gießen des ausgefällten Rindfleischextrakt Suspension in eine oder mehrere Zentrifugenflaschen und zentrifugieren für 15 min bei 2.500 × g bei 4 ° C. Entfernen der Flaschen aus der Zentrifuge und entweder ansaugen oder langsam der Überstand dekantiert, den Verlust des pelletierten Niederschlag zu verhindern. Überstand verwerfen.
    HINWEIS: Es kann unter Rindfleischextrakt viele in der Menge und Qualität der Niederschlag eine beträchtliche Variation sein. Der Niederschlag von einigen viel produziert wird sich auflösen schnell, während die aus anderen Chargen mit Schwierigkeiten löst.
  6. 30 ml 0,15 M Natriumphosphat auf die Zentrifugenflasche den Niederschlag enthält.
    1. Verwenden 0,15 M Natriumphosphat, pH 9,0, für Ausscheidungen von Rindfleischextrakt viele, die innerhalb von 5 Minuten auflösen. Man rührt 10 min nach der Niederschlag vollständig aufgelöst ist, und dann gehen Sie sofort 2,7 Schritt.
    2. Verwenden, 0,15 M Natriumphosphat, pH 7,0-7,5 für alle anderen Ausfällungen. Rühre 10-15 Minuten auflösen, oder schwieriger Niederschläge, brechen sie mit einem sterilen Spatel auf, indem wiederholt die Lösung nach oben ziehen und nach unten während des Rühren mit einer Pipette, durch den Niederschlag bei 160 Umdrehungen pro Minute auf einem Orbitalschüttler, oder durch eine Kombination dieser Verfahren.
      HINWEIS: Wenn mehr als eine Zentrifugenflasche verwenden, kombinieren die Niederschläge unter Verwendung von weniger als 30 ml Natriumphosphat und verwenden Sie dann den restlichen Teil der 30 ml, die Flaschen zu spülen, nachdem die Niederschläge in eine Flasche oder Becher zu kombinieren.
    3. Wenn der kombinierte Niederschlag in einem flachen Boden Zentrifugenflasche ist, einen Rührstab in die Flasche hinzu. Gehen 2.6.5 zu Schritt.
    4. Wenn der kombinierte Niederschlag in einer Zentrifuge Flasche mit einem konischen Boden ist, überträgt sie in ein kleines Becherglas und fügen Sie dem Becher mit einem Rührstab.
    5. Stellen Sie die Flasche oder Becher auf einem Magnetrührer, und rühren, bis die precipitate vollständig gelöst hat.
    6. Re-Sterilisieren einer Kombinationstyp pH-Elektrode mit 0,525% Natriumhypochlorit und entchloren mit 0,05 M Natriumthiosulfat, wie in Schritt 2.1 beschrieben. Kalibrieren Sie den pH-Messgerät mit pH 7 und 10 Standards. justieren langsam den pH-Wert des vollständig gelösten Niederschlag auf 9,0 mit 1 M NaOH und dann rühren für 10 min.
  7. Entfernen Sie den Rührstab und Zentrifuge des gelösten Niederschlag 10 min bei 4,000-10,000 xg und 4 ° C.
  8. Füllen Sie vorsichtig den Überstand in ein Becherglas, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie einen Rührstab in den Becher und das Pellet verwerfen.
  9. Das Becherglas auf einem Magnetrührer, und rühren Sie die Lösung. Mit 1,2 M HCl tropfenweise, um den pH-Wert auf 7,0 bis 7,5 einzustellen.
  10. Filter sterilisieren den Überstand durch Hindurchleiten durch einen Sterilfilter enthält ein Vorfilter, das mit 15 ml von 1,5% Rinderextrakt vorbehandelt wurde, 0,05 M Glycin, pH 7,0-7,5.
  11. Assayprobe Volume (S) Berechnungen:
    1. Verwenden Sie die Gleichung 1 S für alle Testproben mit Ausnahme der Lab Fortified Blank und dem Lab Reagenzblindwert zu berechnen,
      figure-protocol-1 Gleichung 1
      wobei D (Volumen der ursprünglichen Wasseruntersuchende Probe) für das Grundwasser 500 L ist, TSV (Gesamtprobenvolumen) ist das Volumen des Feldes durch die 5-Zoll-elektropositiveren Patronenfilter geleitet Probe vom Labor erhalten und FCSV (Final Konzentrierte Probenvolumen) nach Filtration wird das Volumen in Schritt 2.10. Ein Beispiel ist in ergänzenden Materialien Abschnitt S4.1 gezeigt.
    2. Berechnen S für das Labor Fortified Blank (LFB, dh eine positive Qualitätskontrolle mit gesäten analysenreinem Wasser) und dem Labor Reagenzblindwert (LRB, dh eine negative Qualitätskontrolle unter Verwendung von analysenreinem Wasser) durch die FCSV multipliziert mit 0,3.
  12. Teilen Sie die FCSV in dree subsamples.
    1. Bereiten subsamples 1 und 2 mit einem Volumen gleich dem 1,04 - fachen der Assay Probenvolumen. Gefriert diese Teilproben bei oder unter -70 ° C, wenn sie nicht die gesamte kultivierbare Virus-Assay analysiert werden können unter Verwendung von (Subsample 1, Schritt 4) oder verarbeitet für die molekulare Assays (nicht dargestellt) innerhalb von 24 h; Andernfalls halten bei 4 ° C.
    2. Einfrieren des Restvolumens (Subsampling 3) bei oder unter -70 ° C.
  13. Berechnen Sie die Inokulum Volumen durch die S dividiert durch 10.

3. Gesamt kultivierbaren Virus Quantal Assay

Hinweis: Für alle Schritte immer Lösungen hinzufügen sorgfältig Störung der Zellschicht zu vermeiden.

  1. Dekantieren oder absaugen Medien von Testgefäßen eine Monoschicht von BGM-Zellen bei 3-6 Tage nach der Spaltung enthält, und dann ein Volumen von ausgeglichener Salzlösung gleich den Medien entfernt hinzuzufügen.
  2. Dekantieren oder die ausgewogene Salzlösung aus der Zellkultur te aspirierenst Gefäße verwendet werden und dann die Zellkultur-Testgefäße impfen
    1. Impfen 10 Testgefäße für jede Testprobe mit einem Volumen von Substichprobe 1 gleich dem Inokulum Volumen zusammen mit der gesamten kultivierbaren Virus quantal Testkontrollen (ergänzende Materialien Abschnitt S2.4).
    2. Für die LFB und dem Lab Befestigte Probenmatrix (LFSM, dh ausgesät Wassermatrixprobe), bereiten 5-, 25- und 125-fachen Verdünnungen unter Verwendung von Unterabtastungs 3 und 0,15 M Natriumphosphat, pH 7,0-7,5 als Verdünnungsmittel. Ein Beispiel für ein Verfahren, um die Verdünnungen zur Herstellung wird in ergänzenden Materialien Abschnitt S3 gegeben. Impfen 10 gewaschen Zellkulturtestgefäße für jede Verdünnungsreihe 3.2.1 Inokulum Volume auf jedem Testgefäß zusätzlich zu den Gefäßen beimpft mit unverdünntem Subsample in Schritt 1 verwendet wird .
    3. Für jede Testprobe von Schritt 3.2.1 (andere als die geimpft in Schritt 3.2.2), die CPE in allen 10 Wiederholungen nach 14 Tagen der Inkubation hat (siehe Schritt 3.3), prepare 5-, 25- und 125- und 625-fachen Verdünnungen von Substichprobe 3. Inoculate 10 gewaschen Zellkulturtestgefäße für jede Verdünnungsreihe ein Inokulum Volume auf jedem Testgefäß zusammen mit einem neuen Satz des gesamten kultivierbaren Virus quantal mit Testkontrollen (ergänzende Materialien Abschnitt S2.4).
    4. das Inokulum über die Oberfläche der Zellmonolayern verteilen, indem die Gefäße hin und her kippen. Inkubieren Sie die Testgefäße bei Raumtemperatur für 80 bis 120 min auf einem mechanischen Schüttler bei 1-5 Schwingungen / min oder mit alle 15-20 min von den Gefäßen rocking jeder Virus zu ermöglichen anwesend Zellen zu adsorbieren.
    5. In vorgewärmten Erhaltungsmedium, und dann brüten die Testgefäße bei 36,5 ± 1 ° C.
  3. Geben Sie für das Auftreten von CPE in jedem Testgefäß mit einem Mikroskop täglich für die ersten 3 d und anschließend untersuchen sie alle 2-3 Tage bis zum Tag 14. Übertragung alle Testgefäße, die ≥75% CPE zu einem Gefrierschrank zeigen auf oder eingestelltunter -70 ° C. Frieren Sie alle verbleibenden Kulturen und die gesamten kultivierbaren Virus quantal Testkontrollen bei oder unter -70 ° C, nachdem die Gefäße am letzten Tag der Prüfung.
  4. Auftauen alle Kulturen und filtern ≥15% des Mediums aus jeder CPE-positiven Testgefäß durch ein 0,2 um Sterilfilter. Wenn das angegebene Volumen nicht durch den Filter aufgrund einer Verstopfung, zentrifugieren, das Medium für 10 min bei 1,500-18,000 xg und 4 ° C vor der Filtration übergeben werden.
  5. Führen Sie einen zweiten Durchgang aller 1. Durchgang Testgefäße mit gewaschenen BGM Testgefäße.
    1. Impfen der neuen Testgefäße mit einer Impfung Volumen, das 10% des aufgetauten Medium von allen negativen Testgefäße und aus dem gefilterten Mediums aus positiven Gefäße darstellt.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4-3.4.3, aber frieren jede Testgefäß , das am 1. Durchgang und positiv am 2. negativ war , wie in Schritt 3.3 beschrieben. Führen Sie einen 3. PassAlter als für den 2. Durchgang beschrieben nur die negativen Testkontrollen und Zellkulturen , die während des 1. Durchgang und positiv in der 2. Passage negativ waren.
  6. Identifizieren Sie einzelne Testgefäße als Virus positiv , wenn sie CPE zeigen sowohl in der 1. und 2. Passagen oder in dem Fall , in dem CPE erst in der 2. Passage auftritt, sowohl in der 2. und 3. Passagen.
  7. Verwenden Sie USEPA Most Probable Number Rechner mit den Standard - Programmeinstellungen festgelegt , wie in Tabelle S2 gezeigt , um die Virus - Titer aller Testproben zu berechnen.
    1. Geben Sie die Anzahl der Virus positive Wiederholungs Prüfgefäßen aus Schritt 3.6 für jede Testprobe in den Rechner der MPN / ml Wert (M ml) und die obere (CL uml) und unteren (CL LML) 95% Vertrauensgrenzen / ml - Werte zu bestimmen .
    2. Obtain der MPN / L - Wert (M L) des entsprechenden Testprobe 2 unter Verwendung der Gleichung.
      figure-protocol-2 Gleichung 2
      M ml ist die MPN / ml Wert in Schritt 3.7, S ist der Assay Probenvolumen und D ist das Volumen der ursprünglichen Wasseruntersuchende Probe.
    3. Berechnen Sie die obere Vertrauensgrenze / L durch den CL uml Wert für den M mL Wert ersetzt wird . Berechnen Sie die untere Vertrauensgrenze / L durch den CL LML Wert für den M mL Wert ersetzt wird . Eine Beispielrechnung wird in ergänzenden Materialien Abschnitt S4.2 gezeigt.
    4. Bericht M mL Werte von 0 als ≤ 1 / D. Zum Beispiel, ≤ 0,002 MPN / L (≤ 1/500 L) für Grundwasserproben.
    5. Berechnen Sie die MPN und 95% Vertrauens Grenzwerte für die einzelnen Lab Befestigte Blank und Lab ReAgent Blank , indem zuerst die Werte / ml in den Rechner durch S erhalten multipliziert und dann um 0,3 das Ergebnis geteilt wird .

Ergebnisse

Das Virus wurde von der Quelle Grundwasser von drei Trinkwasseraufbereitungsanlagen konzentriert und ein eigener Brunnen mit elektro Filter. Zwei Probensätze, bestehend aus einem Feldprobe und LFSM Kontrolle wurden von den Kläranlagen zu verschiedenen Gelegenheiten gesammelt, und ein Probensatz wurde aus dem eigenen Brunnen gesammelt. Insgesamt Virus Erholung wurde von einer Pflanze und eine Probe von einem anderen aus der Berechnung ausgeschlossen wurden unter Verwendung von LFSM Proben aus zwei der Pflanzen und der privaten Brunnen (zwei Proben bestimmt, da der MPN-Wert des Saatguts mit jeder Probe verwendet nicht genau wegen ermittelt werden konnte abnorme CPE Ergebnisse unter Wiederholungs Kolben). Bedeuten Poliovirus Erholung von Grundwasserproben gemittelt 58% mit einem Variationskoeffizienten von 79% (2) 16. Kein kultivierbaren Virus wurde in einem der doppelten ungeimpfte Grundwasser Feldproben nachgewiesen.

Leistungsmerkmale der Methode wurde auch unter Verwendung von LFB s gemessenspiele geändert durch zwei verschiedene Samen Ebenen verwenden. Es wurde ein "low" Titer von 300 MPN von Poliovirus verwendet wurde, die Leistung auf einem Niveau zu bewerten, weniger als die "Standard" 500 MPN LFB Ebene in USEPA Methode 1615. A "hoch" Titer von 1000 MPN von Poliovirus verwendet Leistung bei der zu testen Pegel der LFSM Kontrolle. Diese Kontrollen in ähnlicher Weise mit einer durchschnittlichen Wiedergewinnung von 111% und einem Variationskoeffizienten von 100% (Abbildung 2). Alle LRB Proben waren negativ , und alle LFB Proben innerhalb der Akzeptanzbereich (ergänzende Materialien Tabelle S1) durchgeführt.

figure-results-1
Abbildung 1. Filter Elution. Ein Schema für die Verwendung eines Druckbehälters für Patronenfilter Elution gezeigt. Positive Luftdruck wird verwendet, um Rindfleischextrakt Lösung im Druckbehälter durch das Kassettengehäuse con drückenTaining die elektroPatronenFilter. Eine peristaltische Pumpe kann für den Druckbehälter ausgewechselt werden, wobei der Einlass der Pumpe in den Behälter des Rindfleischextrakt Lösungsaufnahme gelegt.

figure-results-2
Abbildung 2. Mittlere Poliovirus Recovery (%) von Boden und Reagenz-Grade Wasser. Die mittlere prozentuale Ausbeute für Poliovirus vom Boden gezeigt wird ( figure-results-3 ; n = 4) und analysenreinem Wasser ( figure-results-4 ; n = 12) Proben. Die zwölf Reagenzqualität Wasserproben umfasste sechs ausgesät mit 300 MPN und sechs ausgesät mit 1000 MPN des Poliovirus. Fehlerbalken stellen Standardfehler.

Diskussion

USEPA - Methode 1615 wurde während der ungeregelten Contaminant Überwachung Verordnung des dritten Überwachungszyklus (UCMR3) 17 und in erster Linie für den Einsatz entwickelt zur Messung der Virus Auftreten im Grundwasser. Es teilt sich eine Reihe gemeinsamer Schritte mit der Informationssammlungsregel (ICR) Methode, 15,18 aber hat zwei kleine Unterschiede. Beide verwenden quantal Assays Virus, das CPE produzieren auf BGM-Zellmonolayern mit Quantifizierung basiert auf Most Probable Number (MPN) Berechnungen zu messen. Verfahren 1615 erlaubt die Verwendung eines neueren elektro Filter für Virus aus verschiedenen Wasser Matrices konzentriert und reduziert die Anzahl von Zellkultur Prüfgefäß repliziert pro Verdünnung von 20 bis 10. Sowohl kleinere Änderungen Gesamtverfahren Kosten zu senken. Die Verringerung der Anzahl der Wiederholungen verringert Arbeit, sondern führt zu einer geringfügig niedrigeren Nachweisgrenze. Obwohl Grundwasser niedrigere Konzentrationen des Virus zu erwarten ist als die Oberflächengewässer, 19,20 the Menge getestet der Probe ist das Fünffache des Oberflächenwassers, für die Unterschiede teilweise kompensiert wird. Die Verwendung von weniger Wiederholungen wird für die meisten Oberflächengewässer angemessen sein, aber einige werden die Probenverdünnung erfordern.

Methode 1615 hat mehrere kritische Schritte und Einschränkungen. Rindfleisch Extrakte variieren von Charge zu Charge. Jede Partie sollte für die Wirksamkeit des Virus Elution und die Fähigkeit zur Viruskonzentration durch die sekundären Konzentrationsstufen getestet werden, wie ergänzende Materialien Abschnitt S2.3 ist. Das Verfahren verwendet genaue Formeln für die Menge der Probe auf die Berechnung BGM-Zellkulturen zu inokulieren und Virustiter zu bestimmen. Ungenaue Ergebnisse werden erzeugt, wenn diese Formeln sind nicht streng befolgt. Eine aseptische Technik muss für die Aufrechterhaltung der Zellkulturen verwendet werden. Nicht infizierte BGM-Zellkultur-Steuerelemente, die Not während des Zeitraums von 14 Tagen Inkubation wahrscheinlich zeigen, weisen auf Probleme mit der Zellkultur Wartung. Große Sorgfalt muss auch taken während mit der Inokulation Schritte, das Pipettieren von und Medium neben Zellkulturflaschen Kreuzkontamination zu vermeiden. Die Qualitätskontrollen in ergänzenden Materialien Abschnitt S2 beschrieben sind, müssen streng befolgt werden. Abschnitt S2 bietet auch Ratschläge zur Fehlerbehebung für Qualitätsfragen.

Der primäre Mechanismus der Virus Adsorptionsfilter zu elektropositiven ist eine auf die Stärke der positiven Ladung auf dem Filter und der Stärke der negativen Ladung 'Virus im Zusammenhang mit seinem isoelektrischen Punkt und dem pH - Wert des Wassers Belastung im Zusammenhang mit Interaktion 21 getestet. Elution von Filter wird auch durch die Stärke dieser Wechselwirkung beeinflusst. Weil sie unter den Virustypen und sogar zwischen Stämmen innerhalb derselben Art, die Elution von den Filtern unterschiedlich ist nicht einheitlich. Dies bedeutet, dass jedes Ergebnis kann die tatsächliche Höhe der Virus in Umwelt Gewässern unterschätzen. Die Verwendung der einzelnen BGM-Zelllinie unterschätzt auch Virus Auftreten. Die Reichweitevon Enterovirus , die CPE in dieser Zelllinie in erster Linie auf Polioviren und Enterovirus B Spezies Serotypen sowie einige Reoviren 14,15,22 begrenzt produzieren kann. Andere infektiöse Virustypen werden nicht erkannt.

Poliovirus Einziehungen von Boden und Reagens - Qualität Wasser erfüllt die US - EPA - Methode 1615 Performance Akzeptanzkriterien für beide Leistungsbewertung (PE, dh Wasser ausgesät Reagenzqualität Proben mit Titern unbekannt einem Analysten, die die Leistung des Analytikers vor dem Start werden verwendet , um zu bewerten einer Studie) und LFB Proben (ergänzende Materialien Tabelle S1). Die 58% ige Rückgewinnung aus dem Grundwasser das Kulturverfahren unter Verwendung ist ähnlich wie die von anderen berichtet unter Verwendung von Leitungswasser 23,24. Die mittlere Rückgewinnung aus den LFB Proben von 111% mit einem Variationskoeffizienten (CV) von 100% erfüllt auch die Akzeptanz Verfahren Leistungskriterien, obwohl sie höher sind als die für PE-Proben beobachtet during der ICR. ICR bedeuten Ring Erholung 56% mit einem Variationskoeffizienten (CV) von 92%, während mittlere labor Einziehungen 36-85% variiert (CVs 58-131%; nicht veröffentlichte Daten aus der ICR-PE-Datenbank). Höhere Gewinnungsraten wurden in dieser Studie für niedrige Samen LFB Proben beobachtet als für höhere Samenproben (122 im Vergleich zu 42%). Zu der Zeit, dass die ICR geplant wurde, wurde erwartet, dass PE-Proben niedrigen Startwerte empfangen würden geringere Ausbeute haben, dass Bezieher hoher Samen. beobachtet hier für die LFB Proben, Erholung Poliovirus für ICR PE Proben waren 71% auf, die ähnliche (CV 100%), 54% (CV 69%) und 44% (71% CV) für Saatgut Werte ≤300 MPN, 300- 1500 MPN und> 1500 MPN sind.

Es gibt viele Methoden zur Messung infektiösen Virus in Wasserproben 25. Dieses Verfahren ist von Bedeutung in Bezug auf andere Verfahren, die in dem Grad der Standardisierung. Die Standardisierung umfasst nicht nur Qualität und Leistung steuert,sondern verwendet auch definierte Volumina und Formeln, um sicherzustellen, dass alle analytischen Laboratorien das Verfahren identisch durchführen. Ohne Standardisierung ist es schwierig, Ergebnisse in Laboratorien zu vergleichen und somit die Standardisierung ist wichtig, wenn, groß angelegte Studien in mehreren Analyselabors durchzuführen. Mit dem eingebauten in der Normung könnte diese Methode in Zukunft weiter ausgebaut werden, um zusätzliche Virustypen und Zelllinien umfassen. Forschungen im Gange Daten bereitzustellen für die Aufnahme von Adenoviren in die Methode.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, für die Bereitstellung des in dieser Studie verwendeten Sabin-Poliovirus-Serotyps 3; Mary Jean See, Nancy Schable und Jenifer Jones von der Dynamac Corporation für die Vorbereitung von BGM-Kulturen; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar und Larry Wymer für ihre Beiträge zur Gesamtbewertung der USEPA-Methode 1615; Gretchen Sullivan für technische Hilfe; und lokale private Brunnenbesitzer und Versorgungsunternehmen, die es uns ermöglicht haben, Wasserproben zu sammeln. Obwohl diese Arbeit von der USEPA geprüft und zur Veröffentlichung freigegeben wurde, muss sie nicht unbedingt die offizielle Politik der Agentur widerspiegeln. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten stellt keine Billigung oder Empfehlung zur Verwendung dar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rindfleischextrakt, getrocknetes PulverBD Bacto211520
KryoröhrchenThermo Fisher3775/945373
Hank' s ausgewogene SalzlösungInvitrogen14170-112
Mechanische SchaukelplattformDaiggerEF4907G
OrbitalschüttlerThermo Fisher14-285-729
Sterilisationsfilter mit VorfilterVWR28143-295
SterilisationsspritzenfilterCorning431219
pH StandardsSigma-Aldrich33643, 33646, 33648
MEMSigma-AldrichM1018 oder M4642
Leibovitz L-15Sigma-AldrichL4386
Natriumbicarbonat, 7,5%Sigma-AldrichS8761
Fötales RinderserumInvitrogen10082-139
Antibiotikum-AntimykotikumLife Technologies15240-062
Trypsin, EDTAInvitrogen25200072

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:

These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2),

to:

These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).

The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:

The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR,

to:

The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

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Enterovirus NachweisNorovirus NachweisViruskonzentrierungelektropositiver FilterRindextrakt Elutionorganische FlokkulationBuffalo Green Monkey Zellenzytopathischer Effekt AssayMost Probable NumberVirusr ckgewinnungs Assay
EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay
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