Method Article

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

DOI:

10.3791/52452

⸱

April 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seit der Entdeckung des grün fluoreszierenden Protein-Gens haben fluoreszierende Proteine die molekulare Zellbiologie beeinflusst. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression unterschiedlicher fluoreszierender Proteine durch Gentechnik für das Barcoding einzelner Zellen genutzt wird. Das Verfahren ermöglicht die Verfolgung unterschiedlicher Populationen in einer Zellmischung, was ideal für Multiplex-Anwendungen ist.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluoreszierende Proteine, Fluoreszenzfarbstoffe und Fluorophore im Allgemeinen haben das Gebiet der molekularen Zellbiologie revolutioniert. Insbesondere die Entdeckung fluoreszierender Proteine und ihrer Gene hat die Entwicklung von Proteinfusionen für die Lokalisierung, die Analyse der transkriptionellen Aktivierung und Translation von Proteinen von Interesse oder die allgemeine Verfolgung einzelner Zellen und Zellpopulationen ermöglicht. Die Verwendung von fluoreszierenden Proteingenen in Kombination mit retroviraler Technologie hat die Expression dieser Proteine in Säugetierzellen auf stabile und zuverlässige Weise ermöglicht. Hier wird gezeigt, wie man diese Gene nutzen kann, um Zellen innerhalb einer Zellpopulation ihre eigene Biosignatur zu verleihen. Da die Biosignatur mit retroviraler Technologie erreicht wird, werden die Zellen "unbegrenzt" mit einem Barcode versehen. Als solche können sie einzeln innerhalb einer Mischung von Barcode-Zellen verfolgt und in komplexeren biologischen Anwendungen eingesetzt werden. Die Verfolgung unterschiedlicher Populationen in einer Mischung von Zellen ist ideal für Multiplex-Anwendungen, wie z. B. die Entdeckung von Medikamenten gegen eine Vielzahl von Zielen oder das Aktivierungsprofil verschiedener Promotoren. Das Protokoll beschreibt, wie man Barcode-Säugetierzellen elegant mit unterschiedlichen genetischen Fluoreszenzmarkern entwickelt und amplifiziert und wie man mehrere Marker gleichzeitig oder einen Marker mit unterschiedlichen Intensitäten verwendet. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie die Zellen in Kombination mit zellbasierten Assays weiter genutzt werden können, um die Aussagekraft der Analyse durch Multiplexing zu erhöhen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologien wie Fluoreszenz-Spektroskopie, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie, alle auf Fluoreszenz, eine Eigenschaft, die weithin in biochemischen, biomedizinischen und chemischen Anwendungen genutzt. Fluoreszenz, ob intrinsische oder durch eine entsprechende Kennzeichnung, wurde für die Analyse von Protein-Expressionsmuster und Profile des Zellschicksals, Protein-Interaktionen und biologischen Funktionen 1-9 ausgeschöpft und durch Fluoreszenz / Förster-Resonanzenergietransfer zur Detektion von Biomolekül-Wechselwirkungen und Konformationsänderungen 10-13. Seit der Isolierung des Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) 14, die Entdeckung weiterer natürlich vorkommende fluoreszierende Proteine ​​aus anderen Cnidaria, insbesondere Korallen, weitgehend die Anzahl der vorhandenen fluoreszierenden Proteinen mit unterscheidbaren Anregungs / Emissionsspektren erhöht. Dies, zusammen mit der Einführung von Mutationen in den Genen 15-19 HAVe die Möglichkeiten weiter ausgebaut, wodurch eine wahre Palette von fluoreszierenden Proteinen den Wissenschaftlern, die Mikroskopie nutzen, Durchflusszytometrie und andere Fluoreszenz-basierten Technologien für ihre Forschung.

Parallel zwar unabhängig, die Entwicklung von Retrovirus-Technologie drastisch die stabile Expression des ektopischen genetische Information in Säugerzellen 20-23 erleichtert. Es ist daher nicht überraschend, dass diese Technik verwendet worden, um Gene von fluoreszierenden Proteinen in einer breiten Anzahl von Zelltypen und Geweben 24-28 oder zur Herstellung von transgenen Tieren 29-31 übertragen. Nach der Art der Retroviren wird die genetische Information der ektopischen fluoreszierenden Proteins in das Genom der Zelle 32 eingeführt, und die Zelle wird fluoreszierenden `für ever'. Diese Eigenschaft wurde Tracking der Zellschicksal erlaubt, oder einer einzelnen Zelle innerhalb einer Population von Zellen. Die jetzt fluoreszierende Zelle so acqui hatrot sein eigenes Biosignatur und definiert als Barcode versehen werden. Seine einzigartige Biosignatur identifiziert sie von anderen Zellen, und wichtiger ist, unterscheidet sie von Zellen, die genetisch manipuliert, um verschiedene fluoreszierende Proteine ​​mit unterscheidbaren Absorptions- / Emissionsspektren zum Ausdruck bringen. Biologische Anwendungen wie die Verfolgung von Pluripotenz Reprogrammierungsfaktoren Richtung 33, die Analyse subnuclear Faktoren für die Aufklärung der nukleoläres Lokalisierungs 34, der Aufbau der fluoreszierenden Reporter-Plasmide für die Transkriptionsstudien 35 oder dem genetischen Markierung von Neuronen für die Untersuchung der neuronalen Netzwerkarchitektur 36 sind nur vier Beispiele der vielen, unterschiedlichen Fluoreszenzprotein-Gene für die gleiche Versuchsanordnung ausgenutzt haben.

Durchflusszytometrie wurde allgemein zur Analyse der biologischen Prozesse in der Ebene einer einzelnen Zelle, wie beispielsweise die Genexpression, Zellzyklus, Apoptose verwendet und Signalisierung durch Phosphorylation 37-43 .Die stabile Expression von fluoreszierenden Protein Gene in Säugerzellen wurde weiter verbessert den Nutzen der Durchflusszytometrie zur Zellanalyse 38,44 und Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen 45. Erweiterte Möglichkeiten haben Fluss erlaubt Zytometrie auf eine weit verwendete Methode für die Hochdurchsatz-und High-Content-Screening-46 geworden. Trotz der nun erweiterten Anzahl von Fluorometer und Robotik-Technologien, die paar Plattenleser Systeme, Bildgebung und fließen Cytometry, scheint es einen Mangel in der experimentellen Design, das zu nutzen und passen diese erweiterten technologischen Möglichkeiten können.

Schnell, zuverlässig, einfach und robust zellbasierten Methoden drastisch für Multiplex-Anwendungen, die weiter zu verbessern Hochdurchsatz-Kapazität benötigt. Dies gilt insbesondere auf dem Gebiet der Wirkstoffentdeckung, wo technische Tests auf Zellbasis in einem gemultiplexten Format kann die Kraft des Hochdurchsatz-Screening-39,47-50 erweitern . Multiplexing, denn sie ermöglicht die gleichzeitige Analyse in einer Probe, weiterhin verbessert Hochdurchsatzfähigkeiten 51-54. Fluorescent genetischen Barcodes ermöglicht nicht nur elegant Multiplexing, sondern auch, einmal entwickelt, umgeht die Notwendigkeit der zeitaufwendig Protokollen, senkt die Kosten einher mit Antikörpern, Perlen und Flecken 39,52,55 und können die Anzahl der Bildschirme für Hoch zu reduzieren Durchsatz-Anwendungen. Vor kurzem haben wir beschrieben, wie retrovirale Technologie Multiplexing durch fluoreszierende genetischen Barcodes für biologische Anwendungen, durch eine zuvor entwickelte, um HIV-1-Protease-Aktivität 56,57 mit verschiedenen klinisch gängigen Varianten 58 überwachen Test zum Ausdruck zu verbessern. Die Methodik wird in einem aussagekräftigeren Weise erklärt sich auf die Auswahl und verstärken genetisch fluoreszierende Barcode-Zellen und, wie man Platten von klonalen Populationen Ausdruck unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen und / oder unterschiedliche Fluoreszenz intensit produzierener Jahren. Panels von Zellpopulationen zu unterscheiden, basierend auf ihren Fluoreszenzeigenschaften zu verbessern multiplexierten Funktionen, die weiter in Kombination mit zellbasierten Assays, die verschiedene biologische Fragen anzugehen nutzt werden können. Das Protokoll beschreibt auch, wie man eine Gruppe von Barcode-Zellen, die einen der zuvor im Labor entwickelt die zellbasierte Assays zu konstruieren, wie beispielsweise 59. Dieses Protokoll wird damit nicht beabsichtigt, den etablierten retroviralen / lentiviralen Technik des Gentransfers, den Wert von fluoreszierenden Proteinen oder die Anwendungen der Durchflusszytometrie 60,48 zeigen, sondern die Verbesserung der Leistung der Kombination der drei für die Multiplex-Anwendungen zeigen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung von Säugerzellen, virale Produktion und Transduction für Genetische Barcoding

  1. Tafel 2.5 x 10 6 adhärenten Zellen in einer 10 cm-Platte (oder ungefähr 50-60% Konfluenz) einen Tag vor der Transfektion in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS). Für den produktiven Einsatz retroviralen Verpackungszelllinie der Wahl wie Phoenix-GP (eine Art Geschenk von Gary Nolan, der Stanford University).
    HINWEIS: Die Verpackungszelllinie stabil exprimiert Gag- und Pol-Proteine, die für retrovirale Teilchenbildung in trans. Vergewissern Sie Zellen gesund sind und an der Platte in einer Monoschicht anhaftet, vor der Transfektion.
  2. 24 Stunden später, bereiten Sie die DNA-Transfektion Mischung.
    1. Bis 125 & mgr; l serumfreiem DMEM hinzuzufügen 3 ug Vesicular Stomatitis Virus-Hüllglykoprotein Vektor (pCI-VSVg) und 3 ug des Transfervektor, der die Fluoreszenz-Protein-Gen von Interesse. Mischen Sie und fügen Sie 15 ul Polyethylimin (2 mg / ml).
    2. Inkubieren Mischung bei Raumtemperatur für 15 Minuten und in den Zellen tropfenweise.
      HINWEIS: Polyethylimin wird die homogene DNA-Gemisch als Transfektionsreagenz zur Bildung von Polyplexen zugegeben. Um virale Partikel zu erhalten, die unterschiedliche fluoreszierende Protein-Marker, führen Sie jede Transfektion unabhängig mit dem Marker der Wahl. Denken Sie daran, dass die retroviralen Transfervektors liegt bei etwa 7 kb Länge und kann nicht, wenn oberhalb von 10 kb verpackt werden.
  3. Inkubiere Platten bei 37 ° C. Um Virusproduktion statt Platten bei 30 ° C oder 32 ° C, statt zu erhöhen.
    HINWEIS: 24 h nach der Transfektion Medien können mit 7 ml frisches Medium ersetzt, und obwohl dies die Zellgesundheit zu verbessern, kann die Viruslast in den Überstand zu verringern.
  4. 48 Stunden nach der Transfektion sammeln die Überstand-haltigen Viruspartikeln und Filter mit 0,45 uM Polytetrafluorethylenfilter. Verwenden Sie frisch gesammelten Virusüberstand für die Weiterleitung. OthDERNFALLS halten Stand in Aliquots bei -80 ° C und vermeiden Frost-Tau. Beachten Sie, dass Virustiter wird wahrscheinlich bis zu 50% bei jedem Gefrier-Tau-Zyklus zu verringern.
  5. Plattenzelllinie der Wahl, 24 Stunden vor der Transduktion wenn adhärenten oder unmittelbar vor der Transduktion wenn nicht adhärenten. Seed 2,0 x 10 5 bis 3,0 x 10 5 anhaftenden Zellen (hier Huh 7.5.1 und HEK 293T) oder 5,0 x 10 5 bis 1 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen (hier SupT1) pro Napf in einer 6-Well-Platte.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, für die Kalibrierung die Anzahl der Zellen vor der Weiterleitung an ausgesät werden, insbesondere also für adhärente Zellen, also Zellen erreichen eine Konfluenz von etwa 60% zum Zeitpunkt der Weiterleitung.
  6. Plus 5 ug / ml Polybrene (hexadimethrene Bromid) an ausgesäten Zellen und fügen zuvor gesammelten viralen Überstand auf etwa 20-40% Befall (hier 2 ml) zu erhalten.
    HINWEIS: Die MOI oder der Prozentsatz der Infektion ist meist willkürlich, da Sortierung ermöglicht, jede subpopulat verstärkenIonen von Zellen. Offensichtlich kann eine höhere Rate der Infektion erleichtert und beschleunigt den Prozess der Amplifikation.
  7. Transduzieren Zellen durch Zentrifugieren in einer hängenden Schaufelrotor bei 1.500 × g für 120 min bei 32 ° C. Resuspendieren nicht adhärente Zellen mit frischem Medium vor der Inkubation. Für adhärente Zellen, ersetzen Sie sie durch frische Medien 24 Stunden nach der Transduktion.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Platten vor der Zentrifugation mit Parafilm versiegeln, damit kein Ende. Genetisch Barcode-Zellvielfalt zu erhöhen, transduzieren Zellen mit Viruspartikeln, die unterschiedliche Fluoreszenzproteine ​​(aus Schritt 1.4 erhalten). Bei der Auswahl von Fluoreszenzmarkern, sicherzustellen, dass sie mit der Instrumentierung kompatibel sind und diese unterscheiden sich fluoreszierende Parameter.

2. Auswahl und Verstärkung von genetisch mit Strichcode Cells

  1. Analysieren transduzierten Säugerzellen mittels Durchflusszytometrie mindestens 72 Stunden nach der Transduktion die Zinses Transduktion quantifizieren. Verwenden Sie einen vergleichbaren nicht-transduzierten Zelllinie als negative Kontrolle.
    HINWEIS: Sortierung wird verwendet, um einzelne Barcode-Zellpopulationen, einen hohen Prozentsatz der Anfangsübertragung zu reinigen, werden zwar nicht erforderlich, sollte den Prozess der Verstärkung.
  2. Nutzen Sie die Zell-Sorter der Wahl, um die Zellen, die das Protein von Interesse zum Ausdruck zu erhalten.
    1. Zu diesem Zweck sorgen die Tore richtig in die richtigen Kanäle eingestellt.
      1. Verwenden Sie dazu die gleiche naive Zelllinie als negative Kontrolle und den Parameter / Kanal-Spannung, so dass die negativen Bevölkerung ist unter den Wert von 10 3 auf jeder Fluoreszenzachse. Bestimmen Sie Gating für positive Fluoreszenz als Ereignisse, die über der von der Negativkontrolle für jede Leuchtstoffkanal angezeigt.
    2. Seien Sie sich bewusst, dass jedes Instrument kann variieren und die richtige Spannung für die Bestimmung Gating entsprechend angepasst werden, so dass positive und negative Kontrollen unerlässlich in jeder experimental Setup.
      1. Für Fluoreszenzdetektion in diesem Versuchsaufbau mit dem FITC-Kanal (530/30 Bandpassfilter mit einer 502 Langpassfilter vorgegangen) für eGFP, den PE-Kanal (585/42 Bandpassfilter mit einer 556 Langpassfilter vorgegangen) für td Tomato und die APC-Kanal (660/20 Bandpassfilter) für E2 Hochrot.
        HINWEIS: Die 488-nm-Laser regt eGFP und td Tomate, während E2 Hochrote wird von der 633 nm Laser angeregt.
  3. Sortieren in 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml 100% FCS.
    HINWEIS: Der Prozess des Sortierens fluoreszierenden Zellpopulationen ist nicht zwingend als eine direkt mit der Art von individuellen Klonen (siehe unten) zu gelangen. Sortieren engen Populationen basierend auf ausgewählten Fluoreszenz sorgt für eine Backup-Bevölkerung für die zukünftige Auswahl von Einzelklonen. Beachten Sie, dass einzelne Zellen sind manchmal schwierig zu wachsen, während eine große Population von Zellen kann leicht eingefroren werden und dann aufgetaut und in einer späteren Phase verstärkt.
  4. Spin unten sortierten Populationen in einem hängenden Becherrotor Zentrifuge bei 524 g bei 32 ° C für 5 min Zellen zu pelletieren. Re-suspendieren in 1 ml frischem Medium und Wiederplatte Zellen, so dass Zellkonfluenz unter 60% liegt, um das Wachstum und Teilung für mindestens zwei Tage beträgt.
    1. Beispielsweise Platte anhaftenden Zellen bei etwa 3 x 10 5 Zellen in 2 ml Medium pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen und 2 x 10 6 Zellen in 2 ml Medium in einer 6 cm Platte. Verwenden DMEM für adhärente Zellen und RPMI für nicht-adhärente Zellen (oder einem festgelegten Medium falls erforderlich). Platzieren plattierten Zellen in einem Brutschrank bei 37 ° C über mehrere Tage, um die Amplifikation zu ermöglichen.

3. Beschaffen Klonpopulationen gentechnisch mit Strichcode-Zellen bei unterschiedlichen Intensitäten

  1. Erhalten klonalen Populationen von Zellen, die ursprünglich transduziert (Schritt 1.7) oder aus der sortierten Population (Schritt 2.3).
    Hinweis: das wird gleich oder ähnlich Niveau der Fluoreszenz-Protein-Expression unter all der Zelle zu gewährleistens innerhalb der Population (a dichten Population mit einem kleinen CV der mittleren Fluoreszenzintensität von bis zu 40%).
    1. Zu diesem Zweck sortiert einzelnen Zellen in 96-Well-Platten mit einer automatischen Zellablagerungseinheit (ACDU). Stellen Tore für die Sortierung nach Populationen von Interesse. Stellen Sie sicher, Tore sind mindestens eine log-Skala abheben, um unterscheidbare Populationen bei der Auswahl von Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten zu erhalten. Bei dem hier dargestellten Vorgehensweise die gleiche Durchflusszytometrie experimentellen up wie die in Schritt 2.2 beschrieben, eingestellt.
  2. Amplifizieren einzelnen Klone in einem Brutschrank bei 37 ° C für mindestens 2 Wochen. Durch den Prozess der Amplifikation analysiert die Zellen unter dem Mikroskop, um zu gewährleisten, dass die wachsende Bevölkerung ergeben sich aus Einzelzellen und nicht aus mehr als einer.
    HINWEIS: Denken Sie daran, dass der Sorter wird eine Zelle pro Vertiefung im Durchschnitt platzieren, und während einige Brunnen darf keine Zelle überhaupt, andere können mehr als eine haben.
    1. Um dies zu gewährleisten, ein povölkerung ergibt sich aus einer Zelle nur, extrem sanft mit der Platte und nicht stören die Brunnen durch Pipettieren. Beachten Sie die Platte gut gut, unter dem Mikroskop.
      HINWEIS: Während der einzelnen Zellen kann manchmal schwierig sein, zu erkennen, sobald sie anfangen Division sie leicht erkennbar sein.
    2. Beachten Sie, dass oft Zellen Klumpen "an den Rändern. Entsorgen Sie diese Brunnen, in denen mehrere klonalen Populationen beobachtet werden kann und so alle, die einen engen Bevölkerung haben.
      HINWEIS: Es ist ratsam, die zu größeren Platten zur Verstärkung übertragen.
  3. Bildschirm des vermeintlichen klonalen Populationen von mittels Durchflusszytometrie analysiert sie. Vergleichen Sie sie mit einer negativen Kontrolle unter Verwendung der gleichen Durchflusszytometrie Versuchsaufbau.
    1. Analysieren Sie nur einen Prozentsatz der Probe und den Rest als Backup. Wählen Sie die am deutlichsten getrennte Populationen nach durchschnittlichen Intensität und Engegefühl in der Bevölkerung. Verstärken sie nach Bedarf oder Gefrier Aktien inGefriermedien mit 20% Glycerin bei -80 ° C für kurze Zeit oder flüssigem Stickstoff für längere.
      HINWEIS: Denken Sie daran, dass eine "wahre" klonalen Population sollte einen sehr engen Fluoreszenzmuster haben.

4. Stellen Sie sicher Multiplexing-Funktionen für High Throughput Screening (HTS)

  1. Zu kombinieren, wie viele verschiedene klonale Populationen wie benötigt, das in einem gemultiplexten Format weiter genutzt werden kann. Wählen Klone mit unterscheidbaren Absorptions- / Emissionsspektren und / oder unterschiedlicher Intensitäten. Wenn eine 96-Well-Platten-Format verwendet wird, welches geeignet für HTS, Samen 50.000 Zellen in 200 ul pro Vertiefung.
    HINWEIS: Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen ist nur eine Schätzung und kann auf Zelltyp noch ändern und ob es adhärenten ist oder nicht.
  2. Analysieren der Probe unter Verwendung von Durchflußzytometrie, um sicherzustellen, daß jeder der unabhängigen fest fluoreszierenden Zelllinien können voneinander unterschieden werden. Vor der Analyse vorzubereiten negativenund einfarbige Controller zu Parametern und Korrekturwerte eingestellt.
    HINWEIS: Parameter einstellen, um die Mischpopulationen deutlich unterscheiden werden, damit sie weiter in einem Multiplexformat genutzt werden.

5. Passen Genetisch Barcode-Zelllinien auf die biologische Anwendung der Wahl

  1. Transduzieren fest genetisch barcodiert Zellinien mit Viruspartikeln, die die Analysenelemente der Wahl enthalten, wie sie hier in Stolp et al. 2013 59 beschrieben. Denken Sie daran, dass der Test der Wahl sollte eine zusätzliche und unterscheidbare Fluoreszenzkanal zu besetzen und so ist es bis zur entsprechenden Barcode-Zelllinie übertragen werden sollen.
    HINWEIS: Jeder Barcode-Zelllinie können einen anderen Test zu tragen.
  2. Sortieren genetisch fluoreszierende Barcode-Zellen, die für die, die Testelemente enthalten.
    HINWEIS: Assay Elemente können an eine Markierung oder fluoreszierende Protein gekoppelt (als Fusion oder durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle) konstruiert werden, foder einfache Erkennung durch Western-Blot, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Der in diesem Protokoll verwendete System beruht auf HA-Epitop Oberflächenexpression alleine oder mit zusätzlichen FLAG-Epitop Ausdruck.
    1. Färben die klonalen Populationen, die den Test mit HA und APC-Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern. Dann analysieren die klonalen Populationen mit anti-FLAG und FITC-konjugierten Antikörperfärbung.
    2. Auf die Spur wieder den Test, Analyse oder "decodieren" die Bevölkerung in den entsprechenden Kanal, wo die verschiedenen gentechnisch Barcode versehen Zelllinien unterschieden werden können. Hier dekodieren die Art des Substrats durch Analysieren von in dem PE-Kanal für td Tomato Detektion.

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Results

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Multiplexing Fluoreszenz genetisch barcodiert Zellen zum Zwecke der biologischen Anwendungen kann nur erreicht werden, wenn individuelle klonale Populationen wurden erzeugt. Multiplexing ist am effektivsten, wenn mit Barcode Populationen deutlich unterschiedlichen fluoreszierenden Eigenschaften mit minimalen spektralen Überlappung. Die in Figur 1 mit klonalen Populationen von Säugerzellen SupT1 gezeigte Beispiel zeigt, dass Zellen, die mit Strichcode versehene mCherry und Cyano fluoreszierendes Protein ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier zwei etablierte Verfahren kombiniert wurden; Gentechnik durch retrovirale Technologie und Detektion von fluoreszierenden Proteinen unter Verwendung der Durchflusszytometrie. Fluorescent Protein basierenden genetischen Barcodes für die Herstellung von einzigartigen Zellinien stellt eine robuste und einfache Weise für Verbundanwendungen. Erzeugung gentechnisch barcodierte Zellen durch Retrovirus-Technologie ist zunächst ein langwieriger Prozess, sondern erlaubt es, zu erhalten, einmal etabliert, eine zuverlässige und...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten Dr. Garry Nolan danken der Stanford University für die Bereitstellung der Phoenix GP Verpackungszelllinie für die Herstellung von retroviralen Partikeln. Wir danken Herrn Dr. Roger Tsien an der University of California in San Diego für die Bereitstellung von td Tomaten. Wir möchten auch die San Diego State University Durchflusszytometrie Core Facility für ihre Dienste und Hilfe danken.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ml SpritzenBD309604zur Filterung des Virus
0,45 &Mikro; TetrafluorethylenfilterPall Corporation4219zur Filterung des Virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning45000-304Zellwachstumsmedium für HEK 293T-Zellen
PEI (Polyethylenimin)Polywissenschaften23966-22 mg/ml Konzentration verwendet
Hängeeimerzentrifuge (gekühlt)Eppendorf5805 000.017verwendet für Spin-Infektion
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Corning21-040-CVzum Waschen von Zellen
Polybren (Hexadimethreenbromid)Sigma-Aldrich107689Wird verwendet, um die Effizienz von Virusinfektionen zu erhöhen. Wird an einem 5 & micro; g/ml-Konzentration.
FACSAriaBD Biosciences-Gerätzur Sortierung von Zellpopulationen
FACSCantoBD Biosciences-Gerätzur Zellanalyse
Phoenix-GPGeschenk der Gary Nolan-Zellliniezur Herstellung retroviraler Partikel
Fötales KälberserumMediatechMT35015CVfür das Zellwachstum und die Sortierung
SupT1-ZellenATCCCRL-1942Humane T-Lymphoblasten
HEK 293T-ZellenATCCCRL-11268Menschliche embryonale Nierenzellen, die auch das große SV40-T-Antigen
enthalten RPMI 1640Corning10-040-CVZellwachstumsmedien für SupT1-Zellen
von

References

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