Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit der Verwendung eines Mikrotiterplattenformats für das Mikroalgen-Screening zu demonstrieren. Dieses schnelle Screening kombiniert die WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometrie zur Messung der Photosyntheseausbeute als Indikator für die Gesundheit des Photosystems II (PSII) mit kleinvolumigen Bakterien-Algen-Cokulturen.
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Methodenartikel
A Small Volume Bioassay um bakterielle / Phytoplankton Co-Kultur Bewerten Sie mit Wasser-Pulse-amplitudenmodulierten (WATER-PAM) Fluorometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Herkömmliche Verfahren für die experimentelle Manipulation von Mikroalgen haben große Volumen der Kultur (20 ml bis 5 l) verwendet, so daß die Kultur kann während des ganzen Versuchs 1-7 unterabgetastet werden. Subsampling großer Mengen kann aus verschiedenen Gründen problematisch: 1) es Veränderung der Gesamtmenge und dem Oberflächenbereich bewirkt: Volumenverhältnis der Kultur während des Experiments; 2) pseudo-Replikation (dh Parallelproben aus der gleichen Behandlung Kolben 8) wird häufig nicht wahr Wiederholungen (dh Probenahme von Wiederholungsbehandlungen) eingesetzt wird; 3) die Dauer des Experiments durch das Gesamtvolumen begrenzt ist; und 4) axenische Kulturen oder die übliche bakterielle Mikroflora sind schwierig während der Langzeitversuche beizubehalten als Verunreinigung häufig während Unterabtasten auftritt.
Die Verwendung von Mikrotiterplatten können 1 ml Kulturvolumen für jede verwendet werden repliziert, mit bis zu 48 separaten Behandlungen innerhalbein 12,65 x 8,5 x 2,2 cm Platte, wodurch der experimentellen Volumen verringert und ermöglicht so ein umfassendes Replikation ohne Unterabtastung eine Behandlung. Zusätzlich kann diese Technik modifiziert, um eine Vielzahl von Versuchsformate einschließlich passen: bakterielle Algen Kokulturen, Algen Physiologie Tests und Toxinscreening 9-11. Einzelne Vertiefungen mit einer Alge, Bakterie und / oder Co-Kulturen können für zahlreiche Laborverfahren einschließlich abgetastet werden, aber nicht beschränkt auf: Wasser-Puls-Amplitudenmoduliertes (WATER-PAM) Fluorometrie, Mikroskopie, bakterielle Kolonie bildenden Einheit (cfu) zählt und Durchflusszytometrie. Die Kombination aus dem Mikrotiterplattenformat und WASSER-PAM Fluorometrie ermöglicht mehrere schnelle Messungen der photochemischen Ausbeuten und andere photochemische Parameter mit geringer Variabilität zwischen den Proben, hohe Reproduzierbarkeit und vermeidet die vielen Fallstricke der Unterabtastung eine Glasballon oder Erlenmeyerkolben im Verlauf eines Experiments .
Einleitung
Phytoplankton Physiologie ist traditionell in mesoskaligen Experimente im Bereich von 20 ml in Erlenmeyerkolben bis 5 l in Glasballons 1-7 untersucht. Diese experimentellen Maßstab erfordert Abtastung für experimentelle Beobachtung, da opfern Parallelproben für jeden Zeitpunkt erzeugt eine unüberschaubare Versuchsaufbau.
Die Fähigkeit, die Anzahl der unabhängigen Versuche erhöhen, während die gleiche Tages Inkubator Raum durch Miniaturisieren des Versuchsvolumens für Algen Physiologie Experimente verringern oder beseitigen die Grenzen der Unterabtastung und Pseudo-Replikation aus großen Volumina. Ein Mikrotiterplattenformat für....
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Protokoll
1. Berechnungen für Versuchsaufbau
- Berechnen des Volumens der Algen- und / oder Bakterienkulturen für Steuerelemente, die unter Verwendung von Gleichung 1 für das gesamte Experiment benötigt werden benötigt:
Wobei y gleich der Anzahl der Steuerungen pro Tag benötigt und z gleich der Anzahl von Tagen. - Berechnen des Volumens der Algen- und / oder Bakterienkulturen, die unter Verwendung von Gleichung 2 für die Co-Kulturen für den Versuch benötigt werden:
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Ergebnisse
WASSER-PAM Fluorometrie Lesungen.
WASSER-Puls-Weiten-Modulierte (PAM) Fluorometrie ist eine schnelle und effiziente Methode, um die Fluoreszenz (stellvertretend für Chlorophyllgehalt) und photosynthetische Ausbeute (PSII Gesundheit) von Algenkulturen zu bestimmen. Die PAM WinControl Software generiert eine Tabelle der Rohdatenwerte für (die folgenden sind die grundlegenden Parameter für dunkle angepasst Algenproben):
F 0 = Fluoreszenz dunkeladaptierten Ze.......
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Diskussion
Algenwachstum in Miniaturformat.
Die Miniaturisierung der Algenkulturen zu einer 1 ml Kulturvolumen in einer Mikrotiterplatte ermöglicht die Replikation innerhalb eines Experiments erhöht werden. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Alge ist im gesamten Experiment gesund; führen eine Wachstumskurve (Figur 2), unter Verwendung des Mikrotiterplatten-Format, um verschiedene Algenmittel daraufhin überprüfen, den Nahrungsbedarf der Alge erfüllt sind. Darüber hinaus kann es wich.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Zuschuss 402105), der Canadian Foundation for Innovation (Zuschuss 129087) und Alberta Education and Training (Zuschuss AAETRCP-12-026-SEG) an RJC.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Inkubator für 10 Kubikfuß Tag (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25 cm2, Entlüftungs-/Verschlusskappe, 7 ml Arbeitsvolumen, 200/cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Platten – 48-Well-BD | Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson Der Pipettierstandard– Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson Der Pipettierstandard– Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Weite Blendenspitzen unsteril [100– 1.250 & Mikro; l] | VWR International | 89079-468< | a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com |
| Ultrafeine Spitzen unsteril [100– 1.250 & Mikro; l] | VWR International | 89079-470< | a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com |
| Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulsamplitudenmodulation (Wasser-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Deutschland | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm Durchmesser Quarzglasküvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Natriumchlorid (kristallin/zertifiziertes ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broce 2216 | BD Biosciences Discovery Laborbedarf | BD Biosciences Discovery Laborware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Laborware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50 L | NCMA [Nationales Zentrum für Meeresalgen und Mikrobiota | NCMA [Nationales Zentrum für Meeresalgen und Mikrobiota | www.ncma.bigelow.org |
Referenzen
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
