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Methodenartikel

A Small Volume Bioassay um bakterielle / Phytoplankton Co-Kultur Bewerten Sie mit Wasser-Pulse-amplitudenmodulierten (WATER-PAM) Fluorometrie

10K Aufrufe

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DOI:

10.3791/52455

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11. März 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alberta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit der Verwendung eines Mikrotiterplattenformats für das Mikroalgen-Screening zu demonstrieren. Dieses schnelle Screening kombiniert die WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometrie zur Messung der Photosyntheseausbeute als Indikator für die Gesundheit des Photosystems II (PSII) mit kleinvolumigen Bakterien-Algen-Cokulturen.

Zusammenfassung

Herkömmliche Verfahren für die experimentelle Manipulation von Mikroalgen haben große Volumen der Kultur (20 ml bis 5 l) verwendet, so daß die Kultur kann während des ganzen Versuchs 1-7 unterabgetastet werden. Subsampling großer Mengen kann aus verschiedenen Gründen problematisch: 1) es Veränderung der Gesamtmenge und dem Oberflächenbereich bewirkt: Volumenverhältnis der Kultur während des Experiments; 2) pseudo-Replikation (dh Parallelproben aus der gleichen Behandlung Kolben 8) wird häufig nicht wahr Wiederholungen (dh Probenahme von Wiederholungsbehandlungen) eingesetzt wird; 3) die Dauer des Experiments durch das Gesamtvolumen begrenzt ist; und 4) axenische Kulturen oder die übliche bakterielle Mikroflora sind schwierig während der Langzeitversuche beizubehalten als Verunreinigung häufig während Unterabtasten auftritt.

Die Verwendung von Mikrotiterplatten können 1 ml Kulturvolumen für jede verwendet werden repliziert, mit bis zu 48 separaten Behandlungen innerhalbein 12,65 x 8,5 x 2,2 cm Platte, wodurch der experimentellen Volumen verringert und ermöglicht so ein umfassendes Replikation ohne Unterabtastung eine Behandlung. Zusätzlich kann diese Technik modifiziert, um eine Vielzahl von Versuchsformate einschließlich passen: bakterielle Algen Kokulturen, Algen Physiologie Tests und Toxinscreening 9-11. Einzelne Vertiefungen mit einer Alge, Bakterie und / oder Co-Kulturen können für zahlreiche Laborverfahren einschließlich abgetastet werden, aber nicht beschränkt auf: Wasser-Puls-Amplitudenmoduliertes (WATER-PAM) Fluorometrie, Mikroskopie, bakterielle Kolonie bildenden Einheit (cfu) zählt und Durchflusszytometrie. Die Kombination aus dem Mikrotiterplattenformat und WASSER-PAM Fluorometrie ermöglicht mehrere schnelle Messungen der photochemischen Ausbeuten und andere photochemische Parameter mit geringer Variabilität zwischen den Proben, hohe Reproduzierbarkeit und vermeidet die vielen Fallstricke der Unterabtastung eine Glasballon oder Erlenmeyerkolben im Verlauf eines Experiments .

Einleitung

Phytoplankton Physiologie ist traditionell in mesoskaligen Experimente im Bereich von 20 ml in Erlenmeyerkolben bis 5 l in Glasballons 1-7 untersucht. Diese experimentellen Maßstab erfordert Abtastung für experimentelle Beobachtung, da opfern Parallelproben für jeden Zeitpunkt erzeugt eine unüberschaubare Versuchsaufbau.

Die Fähigkeit, die Anzahl der unabhängigen Versuche erhöhen, während die gleiche Tages Inkubator Raum durch Miniaturisieren des Versuchsvolumens für Algen Physiologie Experimente verringern oder beseitigen die Grenzen der Unterabtastung und Pseudo-Replikation aus großen Volumina. Ein Mikrotiterplattenformat für Algen Bioassays unter Verwendung einer 1 ml Kulturvolumen zum experimentellen Manipulation Algen in verschiedenen Bedingungen entwickelt. Diese kleinen Versuchsvolumen ermöglicht die Anzahl der Wiederholungen erhöht wird, erhöht experimentelle Reproduzierbarkeit aufgrund einer verringerten Variabilität zwischen Wiederholungsproben undExperimente und ermöglicht echte Replikation während experimentelle Kontrollen (dh axenischen Algenkulturen) 140 Tage (Figur 2) 12.

Diese Mikrotiterplattenformat wird leicht für eine Vielzahl von experimentellen Fragen angepasst, wie: Bietet ein Bakterium haben eine symbiotische, neutral oder pathogenen Wechselwirkung mit seinem Algen Host? Ist die Zugabe einer Verbindung zu stimulieren oder toxisch einer Alge? Diese und andere Fragen können in einer schnellen Hochdurchsatz-Art und Weise mit diesem neuen Format 9-11 angesprochen werden.

Ein 48-Loch-Mikrotiterplatten Kulturplatte ermöglicht je 1 ml und eine unabhängige Versuchsanordnung, die zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt abgetastet werden. Verschiedene Parameter können von diesem 1 ml Volumen einschließlich abgetastet werden, aber nicht beschränkt auf: Chlorophyllfluoreszenz und photochemische Parameter mit Wasser-Pulse-amplitudenmodulierten (WATER-PAM) Fluorometrie (siehe Materialien und Geräte-Tabelle) 13. WATER-PAM-Fluorometrie ist eine schnelle und nicht-invasive Technik, die verwendet werden können, um Versuche mit Algen 13 ausgeführt überwachen. Es erlaubt die Messung der photosynthetischen Effizienz und PSII Gesundheit von einem kleinen Kulturvolumen (150 bis 300 & mgr; l der Kultur in Medium zu einer 2 verdünnt - 4 ml Volumen für WATER-PAM) 14,15. Neben Wasser-PAM Fluorometrie kann dieser Aufbau verwendet werden, um eine Vielzahl von weiteren Parametern zu messen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Mikroskopie, um die Bakterien zu Algenzellen und Veränderungen in der Algenzellmorphologie befestigt visualisieren; bakterielle koloniebildende Einheit (CFU) zählt; und Durchflusszytometrie für Algenzellzahlen und die Ermittlung Subpopulationen.

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Protokoll

1. Berechnungen für Versuchsaufbau

  1. Berechnen des Volumens der Algen- und / oder Bakterienkulturen für Steuerelemente, die unter Verwendung von Gleichung 1 für das gesamte Experiment benötigt werden benötigt:
    figure-protocol-1
    Wobei y gleich der Anzahl der Steuerungen pro Tag benötigt und z gleich der Anzahl von Tagen.
  2. Berechnen des Volumens der Algen- und / oder Bakterienkulturen, die unter Verwendung von Gleichung 2 für die Co-Kulturen für den Versuch benötigt werden:
    figure-protocol-2
    HINWEIS: Es ist möglich, "Co-Kultur-Experimente mit jeder Verbindung Bildschirm zu ersetzen; nur stellen Sie die letzte Verbindung, Lösungsmittel und Algenkonzentrationen um das experimentelle Design passen.
  3. Verwenden der Gleichungen 1 und 2, um das Endvolumen des frühen exponentiellen Algenkultur berechnen (üblicherweise 5 Tage für ~ 10 4 Zellen / ml, aber diese sollten durch performi bestimmt werdenng eine Algenwachstumskurve) für das Experiment erforderlich ist (in diesem Band für Schritt 2.3) mit der Gleichung 3 benötigt wird:
    figure-protocol-3
  4. Verwenden der Gleichungen 1 und 2, um das Endvolumen von 10 4 KBE / ml Bakterienkultur (oder gewünschte Animpfkonzentration) für das Experiment erforderlich ist unter Verwendung der Gleichung 4 (das Volumen für den Schritt 4.2 benötigt wird) zu berechnen:
    figure-protocol-4
    HINWEIS: Verwenden Sie die zusätzlichen 10 ml in Schritten 1.3 und 1.4 bis zum Pipettieren Fehler ausmachen und alle Tests, die durchgeführt werden (zB Wasser-PAM, Durchflusszytometrie, Mikroskopie, etc.) auf 0 d. Erhöhen Sie diese Lautstärke, wenn notwendig, um die Versuchsplanung passen.
    HINWEIS: Für ein Rechenbeispiel eines 8-Tage-Experiment finden Sie in Abschnitt 10. Siehe zusätzliche Tabelle für Medien Rezepte.

2. Wachsende Algenzellen für Versuchsaufbau

  1. Isolieren oder zu erhalten einaktiv wachsenden axenischen Algenkultur.
  2. Aseptisch Transfer 10% des Endvolumens der Algenkultur in sterile Algenmedium (zB L1 oder ähnliche marine Algenmedium, siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle), wodurch ein 1: 9 Verdünnung der Algenkultur in frischem Medium. Wachsen die verdünnte Alge in einer Tages Inkubator mit vorher festgelegten Wachstumsbedingungen für diesen Stamm (zB 18 ° C mit einem 16: 8 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus wird häufig verwendet).
  3. Wenn die Kultur wurde frühen exponentiellen Phase, Wiederkultur erreicht die Alge in der gleichen sterilen Algenmedium (zB L1 oder ähnliche Meeresalgen mittel), gewährleisten die Endkonzentration einer 1: 9-Verdünnung und daß das Endvolumen von Algen ist gleich der V A berechnet (Schritt 1.3).
    HINWEIS: Es ist wichtig, sicherzustellen, dass diese Kulturen sind axenischen. Testen Sie alle Algen Medien und Algenvorratsflaschen für Verunreinigungen durch Plattieren einer 20 ul-Aliquot auf eine allgemeine Meeresbakterienmedium (zB Marine-Broth 2216 mit 1,5% Agar oder ähnlich) ergänzt.
  4. Wachsen Algenkultur zu frühen exponentiellen Phase (~ 10 4 Zellen / ml).
    HINWEIS: Jeder Algenstamm hat eine einzigartige Wachstumskurve je nach Kulturbedingungen. Frühen exponentiellen Phase (~ 10 4 Zellen / ml) kann durch Durchführen einer Algenwachstumskurve, basierend auf der Zelldichte (dh unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder Mikroskopie) bestimmt werden.

3. Vorbereitung Bakterienzellen zur Impfung

  1. Pre-Bestimmung der Bakterienkonzentration (cfu / ml) und die optische Dichte (OD) des Bakteriums bei der stationären Phase um dabei eine Wachstumskurve in der ausgewählten Bakterienmedium und Wachstumsbedingungen (zB Meeres Broth 2216 bei 25 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute, oder ähnliches). Verwenden Sie diese Informationen, um die Zellen (Schritt 3.3) wachsen und später, um die Zellen korrekt in Schritt 3.7 verdünnen.
  2. Unter aseptischen Bedingungen wird eine isolierte und frisch gewachsenen Bakterienkolonie aus einem 1,5% Agar-Platte (zB Marine-Broth 2216 geschmeidigmentiert mit 1,5% Agar oder ähnliche marinen Bakterien festen Mediums) in 5 ml Bakterien flüssige Medium (beispielsweise Meeres Broth 2216 oder ähnlichen marinen Bakterien Medium).
  3. Wachsen die Bakterien bis zur stationären Phase auf einer Rolltrommel oder Schüttler (~ 12 bis 36 Stunden, abhängig von dem Bakterium). Planen der Versuch, daß das Bakterium der stationären Phase (~ 10. AUGUST - 10. SEPTEMBER cfu / ml) erreicht zur gleichen Zeit, dass die Algenzellen haben die frühen exponentiellen Phase (~ 10 4 Zellen / ml) erreicht.
  4. Mit einer Pipette waschen unten keine Biofilm in das Teströhrchen in das Medium angebracht. Pipette 1 ml der gut gemischten Bakterienkultur in ein steriles 1,5 ml Mikroröhrchen. Zentrifuge für 1 min bei 14.000 x g.
  5. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand (bakterielle Medien), ohne dass der Pellet (Bakterienzellen). 1 ml der sterilen Algen Medien (zB L1 oder ähnlich) zu dem Mikroröhrchen (mit Pellets). Vortex Mikroröhrchen zu Pellets in Algenmedium zu resuspendieren.
  6. Zweiten Wasch:wiederholen Sie Schritt 3.5.
    HINWEIS: Es ist wichtig, um die Bakterienzellen mit Algenmittel waschen, um vor dem Impfen der Algen mit ihnen gründlich entfernen Sie alle bakteriellen Medien, Zelltrümmer, ausgeschieden Proteinen und kleinen Molekülen aus den Zellen, da dies die Nährstoffzusammensetzung ändern die Algenmedium oder einzuführen bioaktiver Moleküle auf den Bildschirm.
  7. Seriell verdünnt den gewaschenen Bakterienzellen in Algen Medien bis zu einer Endkonzentration, die 100-fach konzentrierter als die gewünschte endgültige Konzentration der Bakterien (cfu / ml) ist. Speichern Sie die Mikroröhrchen, die Zellen, die für Schritt 4.2 gewaschen wurden und in Algenmedium verdünnt.
    HINWEIS: Planen Sie, das Experiment auf der Grundlage, die eine 1: 1-Verhältnis von Algen, Bakterien auf 0 d. Um diese die gewünschten Anfangsbakterienkonzentration für das Experiment zu tun ist 10 4 KBE / ml, so wird in Schritt 3.7 die ersten Zellen sollten in Serie bis 10 6 cfu / ml verdünnt werden.

4. Vorbereitung Bakterien zum Experimental-Setup

  1. Bereiten Sie 4 steril autoklaviert Glaserlenmeyerkolben und beschriften: a) "Algensteuerkolben", b) "verdünnt bakterielle Lager Kolben", c) "bakterielle Steuerkolben", und d) "Co-Kulturflasche".
  2. Verdünnen Sie die Bakteriensuspension aus Schritt 3.7 1:99 mit sterilem Algenmedium auf ein Endvolumen = V B (Schritt 1.4). Machen Sie die Verdünnung im Kolben bezeichnet verdünnten Bakterien Lager (Schritt 4.1).
    HINWEIS: In dem vorherigen Beispiel (Schritt 4.2), diese 1:99 Verdünnung ergibt eine Endkonzentration von 10 4 KBE / ml. Swirl Kolben, um Zellen zu mischen.
  3. Pipette V Steuerung (Schritt 1.1) aus der verdünnten Bakterien Lager und steckte es in die bakterielle Steuerkolben.
  4. Pipette Vcontrol steriler Algenmedium in das bakterielle Steuerkolben (dies ist ein 1: 1-Verdünnung). Swirl Kolben auf Zellen mischen und beiseite stellen für Schritt 7.3.
  5. Pipette V Co-Kultur aus dem verdünnten Bakterien LagerKanne auf die Co-Kultur-Kolben für Schritt 6.1 Kolben zur Seite.
    HINWEIS: Bei der mehreren Co-Kulturen auf demselben Alge auf einmal (das heißt, eine Co-Kultur von zwei verschiedenen bakteriellen Isolate mit einer Kontrolle) ist es erforderlich, neu zu berechnen, V Co-Kultur für jeden Stamm einzeln und dann Schritt 4,5 für jeden Co-Kultur getrennt. Es ist auch notwendig, die V A in Schritt 1.3 berechnet zu erhöhen, um sowohl in der Gleichung 5 gezeigt Kokulturen umfassen:
    figure-protocol-5

5. Vorbereitung Algen für Versuchsaufbau

  1. Vorsichtig mischen den frühen exponentiellen Algenkultur (aus Schritt 2.4) mit einem Weithals-Pipettenspitze, bis die Zellen gut gemischt auftreten.
  2. Pipette V Steuerung von der Algenvorratsflasche mit dem Algensteuerkolben. Gently Pipette mit einer 10 ml Pipette. Dann im Tages Inkubator senden Sie das Algenvorratsflasche.
  3. Pipette V control steriler Algenmedium zur Algensteuerkolben (dies ist ein 1: 1-Verdünnung). Schwenken Sie den Kolben und in den Tages Inkubator zu mischen, bis zur Stufe 7.4 benötigt.

6. Vorbereitung Experimental Co-Kultur

  1. Pipette vorsichtig V Co-Kultur von der Algen Lager Kolben in die Bakterien Co-Kulturflasche mit Schritt 4.5. Zurück Zusammenarbeit Kulturflasche an den Tages Inkubator, bis zur Stufe 7.5 benötigt.
    HINWEIS: Die Konzentration der Bakterien in der Bakterienkontrolle sollte die Konzentration der Bakterien in dem experimentellen Kokultur entsprechen. In ähnlicher Weise sollte die Konzentration der Algen im Algenkontrolle der Konzentration von Algen im experimentellen Kokultur entsprechen. Durch die mit den gleichen Ausgangskeim und Algenkonzentrationen kann die Bevölkerungsdichte während des gesamten Experiments verglichen werden.

7. Einrichten Mikrotiterplatten

  1. Teilen Sie eine sterile 48-Well-Mikrotiterplatte nach Abbildung 1.Beschriften Sie oben äußeren Vertiefungen, die entweder steriles Verdünnungsmittel oder nicht-photo Proben.
    HINWEIS: Die Randomisierung der Plattenvertiefungen können für Proben, die am selben Tag durchgeführt werden. Zum Beispiel wird Quadranten 1 in 1 d im Experiment abgetastet werden; die Brunnen, die randomisiert werden sollten, sind B2 - 4 und C 2 - 4. Lassen Sie den Umfang der mit steriler Lösung gefüllt Platte wie in Abbildung 1 dargestellt.

figure-protocol-6
. Abbildung 1: Schematische Darstellung der Probenplatzierung in einem 48-Loch-Mikrotiterplatte Wells zu füllen sind, wie folgt: Spalten 1 und 6, Brunnen A bis F ( figure-protocol-7 ) Werden mit 1 ml 1x PBS (oder einem anderen sterilen Lösung / Medium gefüllt). Zeilen A und F, Brunnen 2-8 ( figure-protocol-8 ) Werden mit 1 ml Bakterienkontrolle gefüllt; rows B und E Brunnen 2-8 ( figure-protocol-9 ) Werden mit 1 ml Algenkontrolle gefüllt; Zeilen C und D, Brunnen 2-8 ( figure-protocol-10 ) Werden mit 1 ml Co-Kultur. 4, sollte dies im gesamten Platten randomisiert und entsprechend zu kennzeichnen - Die Platte ist in 4 Quadranten (A2, A5, D2 und D5) diese Quadranten jeweils spezifische Probenahme Tage 1 unterteilt. Innerhalb eines jeden Tages werden wir raten Randomisierung der Algenkontrolle ( figure-protocol-11 ) Und Co-Kultur ( figure-protocol-12 ) Vertiefungen unter Verwendung eines Zufallszahlengenerators. Beschriften Sie den Deckel über das 1 × PBS und / oder bakterielle Kontrollvertiefungen, um Schattierung Algenkulturen zu verhindern.

  1. Je 1 ml 1x Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4) oder einem anderen sterilen Lösung in die entsprechenden Vertiefungen wie in Abbildung 1 dargestellt. Führen Sie diese langsam und mit Vorsicht. PBS wird change die Ionenstärke der Algen- und / oder Co-Kulturmedium, wenn es spritzt in anderen Vertiefungen so sorgfältig behandeln.
  2. Je 1 ml der Bakterienkontrollkultur in Bohrlöcher bezeichnet Bakterienkontrolle (Abbildung 1). Die bakterielle Kolben wirbeln vor dem Pipettieren jede Platte um bakterielle Absetzen zu vermeiden.
  3. Wird 1 ml Algenkontrollkultur in Bohrlöcher Algenkontrolle mit einem breiten Mund Pipettenspitze (Abbildung 1) gekennzeichnet. So regelmäßig Swirl das Algenkolben als bakterielle Kolben. Wenn die Alge tendenziell sinken oder schwimmen, wirbeln so regelmäßig wie benötigt wird, um eine optisch einheitliche Kultur zu erhalten.
  4. Mit einem breiten Mund Pipettenspitze Pipette 1 ml Co-Kultur in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 1). Schwenken der Co-Kultur-Kolben so regelmäßig wie der Algenkolben.
  5. Verschließen Sie jede Platte mit Parafilm und in einen Tages Inkubator bei der gewünschten Temperatur und Tageslichtzyklus (18 ° C mit einem 16: 8 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus wird häufig verwendet). Stehen Lassendie Platten in der Tages Inkubator, bis Sie sie PAM Messwerte (§ 8) zu nehmen. Stellen Sie sicher, alle Platten sind in der gleichen Richtung ausgerichtet sind, um für eine konsistente Belichtung ermöglichen.
  6. Nehmen Sie ein 20 ul-Aliquot aus dem PBS, Algen Medien, Algen Lager und Algenkontrolle und Drop Platte auf eine geeignete nicht-selektivem Medium (zB Marine-Broth 2216 mit 1,5% Agar) und Inkubation Platten bei 18 - 25 ° C für 72 h bis auf Verunreinigungen zu testen. Wenn das Wachstum in jeder der Lösungen, die nicht die Bakterien enthalten sollte erscheint, dann werden diese Daten nicht verwendet werden sollte.
  7. Nehmen PAM Fluorometrie Werte mit Hilfe der verbleibenden Probe aus den Algenkontrolle und Co-Kulturflaschen für die experimentelle 0 d PAM Fluorometrie lesen (siehe Schritt 8.1). Alle anderen 0 d Messungen sollten auch mit den restlichen Algenkontrolle, Bakterienkontrolle und Co-Kultur-Proben durchgeführt werden.

8. Unter PAM Fluorometrie Lesungen ab Lager Proben

  1. Null die WATER-PAMmit sterilem Algen Medien in einer sauberen Küvette vor der Einnahme von Lesungen 8.
  2. Je 300 & mgr; l von Algenkontrolle oder Co-Kulturkolben in eine saubere Küvette, die 2,7 ml des gleichen Algenmedium in dem Experiment verwendet. Die Probe und Verdünnungsmittel vorsichtig mit einem breiten Mund Pipettenspitze.
  3. Abreiben alle Fingerabdrücke von außerhalb der Küvette mit einem Tuch, bevor Sie die Küvette in das Wasser-PAM.
  4. Zeigen Küvette in WASSER-PAM. Decken Sie die Probe mit der Kappe und lassen Sie es dunkel Anpassung für 3 min. Adaptionszeiten variieren abhängig von den Arten von Algen abhängig und muss für die spezifische Alge in dem Experiment verwendet wird, bestimmt werden. Vermeiden Sie lange Adaptionszeiten (> 20 min), indem WASSER-PAM Lesungen während der Mitte der Nacht-Rhythmus der Algen Tageszentren 16,17.
  5. Nach Einbruch der Dunkelheit Adaption, schlug F 0-Taste. Wenn Fluoreszenzmesswerte sind vor 3900, verdünnte Probe 1: 1 in Algenmedium. Dark-Anpassung für weitere 3 min und takea neue Lesart. Wenn die F 0 oder F m die Anzeige noch immer über 3900, weiterhin die Probe zu verdünnen 1: 1 in Algenmedium, bis die F 0 und F m Werte unter 3900.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie für diese Verdünnungen bei der Aufnahme endgültige Fluoreszenz Konto: zum Beispiel, wenn der Algenprobe wird im Verhältnis 1: 9 bei der ersten Übertragung von der gut mit dem Verdünnungsröhrchen, dann ist die Algenfluoreszenzmesswert von 500 sollte mit der inversen multipliziert werden der Verdünnungsfaktor (in diesem Fall 10) und der Ist-Fluoreszenz der Schlauch wird dann 5,000.
  6. Nach der Einstellung F 0, werfen Sie einen sättigenden Impuls (SAT-Pulse) Lesung alle 90 Sekunden durch Drücken der TV-Taste, um F m Messungen vornehmen. Das Zeitintervall zwischen den Ablesungen je Algenstamm eingestellt werden. Verwerfen Probe.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 8,1 bis 8,6 für die übrigen Proben.

9. Da PAM Fluorometrie Lesungen von Mikrotiterplatten

  1. Beschriftung6 sterile Probenröhrchen von> 3 ml Volumen für Brunnen B2 - 4 für die Algenkontrolle und Vertiefungen C2 - 4 für die bakterielle Co-Kultur (siehe Plattenlayout in Abbildung 1).
  2. Aliquoten 2,7 ml sterile Algenmedium in jedes Röhrchen.
  3. Die Röhrchen in Tages Inkubator und es ihnen ermöglichen, auf die Temperatur der Alge wurde für 30 Minuten angewachsen akklimatisieren.
  4. Vor dem Entfernen der Mikrotiterplatte aus dem Inkubator sicher, dass die Lichtdurchlässigkeit in die dunklen gewöhnt Brunnen wird durch Abdecken der Platte mit Aluminiumfolie (oder ähnlich), nur entfernen Sie die Folie, während aktiv Übertragung Kultur aus den Vertiefungen zu den Verdünnungsröhrchen (Schritte 9.5 beschränkt - 9.7).
  5. Aseptisch mischen die erste Mikrotiterplatte (gut B2) mit einem breiten Mund Pipettenspitze durch langsames Auf- und Abpipettieren.
  6. Besorgen Sie sich die Verdünnungsröhrchen aus dem Inkubator und aseptisch Transfer 300 ul von gut B2 (Abbildung 1) zu dem entsprechenden Probenröhrchen mit einem breiten Mund Pipettenspitze (dies ist eine 1: 9 Verdünnung der Probe in Algenmedium).
  7. Wiederholen Sie die Schritte 9,5-9,6 für die restlichen Bohrlöcher (B3,4 und C2 - 4).
  8. Bedecken Sie Probenröhrchen mit Aluminiumfolie und bringt sie zu den Tages Inkubator, bis sie zur WASSER-PAM.
  9. Führen Sie WASSER-PAM Messwerte wie in den Schritten 8.1 - 8.7. Verschließen Sie die Mikrotiterplatte mit Parafilm vor der Rückgabe an den Inkubator.
  10. Die Messungen in festgelegten Zeitintervallen für die Dauer des Experiments. Die Frequenz und die Länge der Probenahme sollten zu Beginn des Experiments geplant werden.

10. Versuchsbeispiel

Die Probe Experiment ist eine 10 Tage Co-Kultur eines Bakteriums (Phaeobacter gallaeciensis BS107) und Mikroalgen (Emiliania huxleyi Stamm (CCMP3266)). Er enthält einen Algenkontrolle, bakterielle Kontrolle, und eine bakterielle Algen experimentellen Kokultur.

  1. Berechnen Sie Volumen von Bakterien- und Algenbestände erforderlich (Schritt 1.1-1,4)
    figure-protocol-13
  2. Vorbereiten des Algen Lager, eine V A von 40 ml, durch Inokulieren 4 ml Alge in 36 ml Medium inkubiert und bis zum frühen exponentiellen Wachstums bei einer Zelldichte von ~ 10 4 Zellen / ml (Schritte von 2,1 bis 2,4) erreicht.
  3. Vorbereiten des bakteriellen Lager Kolben durch Verdünnen 400 ul der 10 6 cfu / ml Bakterien in Abschnitt 3 zu einer V B von 40 ml mit Algenmedium erhalten (Endkonzentration von Bakterien 10 4 cfu / ml).
  4. Über Hälfte (20 ml) des bakteriellen Lager an die bakterielle Steuerkolben und 20 ml Algen Medien, um die Bakterienbekämpfung zu machen. Über Hälfte (20 ml) der Algen Lager an die Algensteuerkolben und 20 ml Algen Medien bilden das Algenkontrolle (Abschnitt 5). Übertragen Sie die restlichen 20 ml der Bakterien Lager an die Co-Kultur-Kolben und mit den restlichen 20 ml Algen Lager mischen, um die Co-Kultur zu etablieren (Abschnitt6).
  5. Pipettieren 1x PBS (pH 7,4), Steuerelemente und die Co-Kultur in zwei voretikettierten Mikrotiterplatten (Abbildung 1), 1 ml pro Vertiefung. Verwenden Sie 3 ml der verbleibenden Kontrollen und Co-Kulturen auf 0 d Messungen (Keimzahl, WASSER-PAM (§ 8), mikroskopische Beobachtung von Algenzellmorphologie und Algenzellfixierung für die Durchflusszytometrie) stellen.
  6. Nehmen Sie WASSER-PAM Lesungen für die Algenkontrolle und Co-Kultur einmal täglich für 10 d, und immer zur gleichen Zeit wie die 0 d Messungen wurden (§ 8) übernommen.

11. Andere Parameter von Interesse

  1. Bestimmen bakterielle KBE-Konzentration: führen Sie eine serielle Verdünnung der Bakterienkontrolle und Co-Kultur in sterile 1x PBS (oder ähnlich), dann fallen Platte auf die Marine Broth 2216 mit 1,5% Agar (oder ähnlich) ergänzt und beobachten Sie die Anzahl der KBE, die wachsen die bakteriellen CFU / ml für jede Vertiefung 18 bestimmen.
  2. Zur Bewertung der Algenzellkonzentration: fix Algenkontrolle und ZusammenarbeitKultur mit einer 0,15% igen Endkonzentration von Glutaraldehyd. Inkubieren für 10 Minuten im Dunkeln, dann Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Bearbeiten Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer (FACS Calibur oder ähnliches) zu Algenzellen zu zählen.
  3. Beachten Algenzellmorphologie: Algenkulturen und Bakterien-Algen-Co-Kultur mit Hilfe der Mikroskopie (dh die Lichtmikroskopie, Epifluoreszenz, oder ähnliches).

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Ergebnisse

WASSER-PAM Fluorometrie Lesungen.

WASSER-Puls-Weiten-Modulierte (PAM) Fluorometrie ist eine schnelle und effiziente Methode, um die Fluoreszenz (stellvertretend für Chlorophyllgehalt) und photosynthetische Ausbeute (PSII Gesundheit) von Algenkulturen zu bestimmen. Die PAM WinControl Software generiert eine Tabelle der Rohdatenwerte für (die folgenden sind die grundlegenden Parameter für dunkle angepasst Algenproben):

F 0 = Fluoreszenz dunkeladaptierten Ze...

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Diskussion

Algenwachstum in Miniaturformat.

Die Miniaturisierung der Algenkulturen zu einer 1 ml Kulturvolumen in einer Mikrotiterplatte ermöglicht die Replikation innerhalb eines Experiments erhöht werden. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Alge ist im gesamten Experiment gesund; führen eine Wachstumskurve (Figur 2), unter Verwendung des Mikrotiterplatten-Format, um verschiedene Algenmittel daraufhin überprüfen, den Nahrungsbedarf der Alge erfüllt sind. Darüber hinaus kann es wich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Zuschuss 402105), der Canadian Foundation for Innovation (Zuschuss 129087) und Alberta Education and Training (Zuschuss AAETRCP-12-026-SEG) an RJC.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Inkubator für 10 Kubikfuß Tag (6012-1)Caron Corporate112310-6012-1-11www.caronproducts.com
Nunc EasYFlask 25 cm2, Entlüftungs-/Verschlusskappe, 7 ml Arbeitsvolumen, 200/csThermo Fisher ScientificN156340www.fishersci.ca
Multiwell TC Platten – 48-Well-BDBiosciences Discovery Labware353078www.bdbiosciences.com
P1000 Gilson Der Pipettierstandard– Gilson's PipetmanMandel Scientific Company Inc.GF-F123602www.mandel.ca
P10mL Gilson Der Pipettierstandard– Gilson's PipetmanMandel Scientific Company Inc.GF-F161201www.mandel.ca
Weite Blendenspitzen unsteril [100– 1.250 & Mikro; l]VWR International89079-468<a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com
Ultrafeine Spitzen unsteril [100– 1.250 & Mikro; l]VWR International89079-470<a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com
Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml]Thermo Fisher Scientific9402151www.fishersci.ca
WATER-Pulsamplitudenmodulation (Wasser-ED)Heinz Walz GmbH, Effeltrich, DeutschlandEDEE0232www.walz.com
15 mm Durchmesser Quarzglasküvette (WATER-K)Caron Corporatewww.caronproducts.com
Natriumchlorid (kristallin/zertifiziertes ACS), Fisher ChemicalThermo Fisher ScientificThermo Fisher Scientific www.fishersci.ca
BD Difco Marine Broce 2216BD Biosciences Discovery LaborbedarfBD Biosciences Discovery Laborwarewww.bdbiosciences.com
BD Bacto AgarBD Biosciences Discovery LaborwareBD Biosciences Discovery Labwarewww.bdbiosciences.com
L1 Medium Kit, 50 LNCMA [Nationales Zentrum für Meeresalgen und MikrobiotaNCMA [Nationales Zentrum für Meeresalgen und Mikrobiotawww.ncma.bigelow.org

Referenzen

  1. Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
  2. Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
  3. Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
  4. Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
  5. Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
  6. Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
  7. Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
  8. MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
  9. Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
  10. Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
  11. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
  12. Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
  13. Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
  14. Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
  15. Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
  16. WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
  17. Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  18. Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
  19. Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
  20. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  21. Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
  22. Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
  23. Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
  24. Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).

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