Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Summary

Der Mechanismus, der den therapeutischen Effekten der Tiefen Hirnstimulation (DBS) zugrunde liegt, muss untersucht werden. Die in diesem Manuskript vorgestellten Methoden beschreiben einen experimentellen Ansatz zur Untersuchung der zellulären Ereignisse, die durch die THS ausgelöst werden, indem das Genexpressionsprofil von Kandidatengenen analysiert wird, die die Neurogenese nach einer THS-Operation erleichtern können.

Abstract

Tiefen Hirnstimulation (DBS) Chirurgie, die auf die verschiedenen Regionen des Gehirns, wie der Basalganglien, Thalamus und subthalamicus Regionen ist eine wirksame Behandlung für verschiedene Bewegungsstörungen, die ausgefallen sind, um Medikamente reagieren. Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der DBS Operation begonnen hat, die Anwendung dieser OP-Technik, um andere Bedingungen so vielfältig wie krankhafte Fettsucht, Depressionen und Zwangsstörungen zu erweitern. Trotz dieser Ausweitung Hinweise, ist nur wenig über die zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen, die wohltuende Wirkung des DBS Operation erleichtern bekannt. Ein Ansatz für diese Frage ist es, Genexpressionsanalyse in Neuronen, die elektrische Stimulation erhalten zuführen. Frühere Studien haben gezeigt, daß Neurogenese bei der Ratte Gyrus dentatus wird in DBS ausgelöst Targeting des anterioren Nucleus des Thalamus ^1. DBS Operation gezielt den ATN ist weithin für die Behandlung refraktärer Epilepsie eingesetzt. Es ist daher von sehr interest für uns, um die Transkriptionsänderungen durch elektrische Stimulation der ATN induzierte erkunden. In diesem Manuskript beschreiben wir unsere Methoden für die stereotaktisch geführte DBS Operation gezielt den ATN bei erwachsenen männlichen Wistar-Ratten. Wir haben auch die nachfolgenden Schritte für Gewebedissektion, RNA-Isolierung, cDNA-Präparation und quantitative RT-PCR diskutieren zur Messung der Genexpression ändert. Dieses Verfahren könnte angewandt und für die Stimulierung der Basalganglien und andere Regionen des Gehirns allgemein klinisch gezielt modifiziert werden. Die Genexpression Studie hier beschriebenen übernimmt einen Kandidaten Zielgen Ansatz für die Entdeckung der molekularen Spieler, die Regie führen konnte den Mechanismus für die DBS.

Introduction

Die Geschichte hinter der Entwicklung der Tiefenhirnstimulation als neurochirurgische Technik stammt aus den 1870er Jahren, wenn die Möglichkeit der elektrischen Stimulation des Gehirns Schaltungen wurde ² untersucht. Die Verwendung von chronischen Hochfrequenzstimulation zur Behandlung von neuronalen Erkrankungen begann in den 1960er Jahren ^3. Später in den 1990er Jahren mit dem Aufkommen von chronischen Implantation DBS-Elektroden ^4-6, die Anzahl von neuronalen Störungen, die von DBS behandelt wurden weiter zu. Tiefe Hirnstimulation wurde zum ersten Mal in den USA zur Behandlung von essentiellem Tremor ⁶ verwendet. Heute ist die Operation wird häufig zur neuronalen Störungen, die derzeit nicht behandelbar durch pharmakologische Intervention, zu behandeln. DBS ist derzeit zur Behandlung von Bewegungsstörungen Parkinson-Krankheit und Dystonie ^7-9 behandeln. Alzheimer-Demenz, Huntington-Krankheit, Epilepsie, Schmerzen und neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen, Zwangsstörungen, Tourette7; s Syndrom und Sucht sind einige der Bedingungen der Behandlung zugänglich durch DBS ^10-12. Während DBS Operation FDA zur Behandlung von Parkinson, Dystonie und essentiellem Tremor genehmigt die Verwendung von DBS für die Behandlung von anderen oben genannten Bedingungen sind in verschiedenen Stadien der Labor- und klinischen Studien mit vielversprechend für Patienten ^13,14.

Klinisch wird DBS Operation in zwei Stufen durchgeführt. Die erste Stufe beinhaltet die chirurgische Positionierung der DBS-Elektroden an der gezielten anatomischen Lage mit einer Kombination aus radiologischen Positionierung, CT, MRT sowie Mikromesswerte für eine verbesserte Präzision. Die zweite Stufe beinhaltet die Implantation eines Impulsgenerators in der oberen Brustkorb des Patienten und die Installation Verlängerungskabel von der Kopfhaut an den Impulsgenerator. Bezogen auf das neurologische Erkrankung, haben mehrere Programmiersysteme für den Pulsgenerator standardisiert und wird verwendet, um die gewünschte Spannung zu liefern. Das Endvolumentage wird stufenweise erreicht, um die besten klinischen Reaktion mit minimaler Spannung ¹⁵ zu empfangen. In unseren Studien, im Gegensatz zu den chronischen DBS Implantate klinisch verwendet wird, für die der Einfachheit halber haben wir uns dem Studium eine einmalige Hochfrequenzstimulation (1 Stunde) in unserem Tiermodell zurückgegriffen.

Ein Teil der Forschung unserer Gruppe konzentriert sich auf die Untersuchung der Verwendung von DBS Operation bei therapierefraktärer Epilepsie. Die stereotaktische chirurgische Ansätze mit Hochfrequenz-Stimulation wurde von vielen anderen als eine wirksame Möglichkeit, medizinisch refraktärer Epilepsie, die etwa 30% aller Fälle von Epilepsie ^10,16,17 bildet Behandlung untersucht. Kleinhirn-Stimulation zur Förderung der kortikalen Oberfläche sowie den tiefen Kleinhirnkerne wurden in der Vergangenheit als Ziele verwendet, um Epilepsie ^10,18,19 behandeln. Darüber hinaus hat Hippocampus Stimulation auch versucht worden, aber mit unterschiedlichen Ergebnissen ^20,21. Einige der anderen untersuchtenDBS Ziele für Epilepsie sind die Großhirnrinde, Thalamus, Nucleus subthalamicus und Vagusnerv ^8. Im Anschluss an die Ergebnisse mehrerer Studien in den letzten Jahren, die vordere Thalamuskern (ATN) hat als die häufigste DBS Ziel für Epilepsie-Behandlung ^10,22 entstanden. Gestützt auf das Wissen über neuroanatomische Schaltung und Erkenntnisse aus Tiermodellen haben verschiedene Studien über die therapeutische Wirkung die tiefe Hirnstimulation der ATN bei der Behandlung von Epilepsie ^23-26 konzentriert. Das ATN ist Teil des limbischen Kreis und ist in der Region des Gehirns, die Anfallshäufigkeit betrifft entfernt. Studien von Hamani et al., Haben die Wirksamkeit von ATN-DBS in einer Pilocarpin induzierten Epilepsie-Modell getestet und festgestellt, dass die bilateralen ATN Stimulation verlängerte Latenzen für Pilocarpin-induzierten Krampfanfällen und Status epilepticus ^24. Darüber hinaus wurde Hochfrequenzstimulation des ATN gefunden Anfallsfrequenz in einem Pentylentetrazol (PTZ) Modell ep reduzierenilepsy ^25,27-29. Lee et al., Haben eine mittlere Reduktion der Anfallshäufigkeit um etwa 75% auf chronische tiefe Hirnstimulation des ATN bei der Behandlung von refraktären partiellen Epilepsie ³⁰ ausgewiesen.

Eine neue klinische Studie zur Behandlung refraktärer Epilepsie hat vielversprechende Ergebnisse nach DBS Operation Ausrichtung der vorderen Thalamuskern (ATN) ²² gezeigt. Eine multizentrische randomisierte Studie mit 110 Patienten, die bilaterale DBS des ATN zur Behandlung refraktärer Epilepsie (SANTE-Studie) zeigte einen Rückgang der Anfallshäufigkeit um etwa 40% ^31. Die Ergebnisse aus dieser Studie deutete auch auf eine verzögerte optimale Antiepileptikum Wirkung 2-3 Monate nach der Operation beobachtet. Weitere Studien von Toda et al., Mit diesen Ergebnissen untermauert, wo sie gezeigt, Neurogenese geschieht zu einem späteren Zeitpunkt nach der DBS (Tage 3-5) im Tiermodell ^ein. Zusätzlich Encinas et al., Haben hippocampalen neurogene gemeldetsis in der erwachsenen Maus Gyrus dentatus nach hochfrequente Stimulation des ATN ^32. Frühere Studien ^33-35 haben sinkende Neurogenese in bestimmten Fällen epileptischen wie chronische Temporallappen-Epilepsie und eine Assoziation mit Lerndefiziten, Gedächtnisstörungen und spontan wiederkehrenden Motorkrampfanfälle berichtet. Weiterhin gab es eine Verringerung in der neuralen Stammzellvorläufer Faktoren wie FGF2 und IGF-1 in der chronisch epileptischen Hippocampus im Tiermodell ^33. In Anbetracht dessen, interventionelle Strategien wie DBS, die eine Steigerung der Neurogenese im Gyrus dentatus zeigen, sind spannende Möglichkeiten für die Forschung. Diese Ergebnisse haben uns ermutigt, weiter tief in den zugrunde liegenden Mechanismus der Neurogenese nach DBS Behandlung für Epilepsie zu erkunden. Wir haben die ATN sowohl einseitig ausgerichtet (Daten nicht angegeben) als auch auf bilateraler Ebene (in repräsentative Ergebnisse) und gesehen erhöht Neurotrophin (BDNF) Ausdruck in den Ratten Gyrus dentatus. Unsere current Hypothese ist, dass die BDNF-Expression initiiert eine Genexpression Kaskade, in der Neurogenese gipfelt, die dem anti-epileptische Wirkung DBS Operation übersetzt. In diesem Artikel präsentieren wir unsere Methoden zur DBS Operation gezielt den ATN bei Ratten, gefolgt von Genexpressionsanalyse als attraktiver Ansatz, um die zugrunde liegende Mechanismus die Vorteile des DBS zu studieren.

Protocol

HINWEIS: Ethik Hinweise: Alle Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden, werden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für Tierforschung (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren) und werden von der Harvard Medical School IACUC Ausschuss genehmigt.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente werden entweder durch Autoklavieren oder durch Reinigung mit einer antiseptischen Lösung und / oder Ethanol bei Bedarf sterilisiert. Verwenden Sie möglichst sterile Einweg-Geräte wie Skalpelle, Nadel und Spritzen.
2. Decken Sie die Werkbank mit OP-Abdeckungen und stellen Sie sicher, dass es ein Biohazard Entsorgung zur Verfügung.
3. Wiegen Sie die Ratte und berechnen Anästhesie Dosis. Verwenden Sie einen Ketamin / Xylazin-Mix (Ketamin 75 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg), um die Ratten zu betäuben.
   HINWEIS: 200-250 g ist das optimale Gewicht für eine ordnungsgemäße Befestigung des Tieres in der stereotaktischen Rahmens als auch für eine genaue Ausrichtung der ATN. Isoflurane kann auch als die betäubende Mittel verwendet werden.
4. Aufziehen und sichern zwei sterilen Elektroden am Elektrodenhalter (durch Autoklavieren oder mit Ethylenoxid sterilisiert) (Abbildung 2) einer stereotaktischen Operations Rahmen und mit Hilfe eines Mikroskops (10-40x Vergrößerung), überprüfen Sie die Spitzen der Elektrode für die ordnungsgemäße Ausrichtung. Befestigen Sie die beiden Elektroden 3,0 mm.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Elektrodenspitze durch Berühren auf harten Oberflächen.

2. DBS Chirurgie

1. Injizieren Sie die Ketamin / Xylazin mischen intraperitoneal an das Tier, und bestätigen, dass das Tier eine chirurgische Ebene der Narkose erreicht (indem Sie für die Zehen Prise Reflex, Atemfrequenz und -tiefe und Ordnungsmäßigkeit der Atmung). Entfernen Sie Haare aus dem Bereich der Kopfhaut, die eingeschnitten wird und desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 3 Wechsel Peelings jedem Betadin und entweder Alkohol oder steriler Kochsalzlösung. Sichern Sie und positionieren Sie das Tier auf der stereotaktischen frame.
2. Verwenden zirkulierenden Warmwasserpolster auf Körpertemperatur des Tieres auf einem optimalen Niveau zu halten. Bewerben Auge Schmiermittel die Augen des Tieres, um vor dem Austrocknen zu schützen.
3. Verwenden Sie die folgenden stereotaktischen Koordinaten für die Ausrichtung der ATN (Anterior Thalamuskern): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm und 5,2 mm dorsoventrale ^1.
   HINWEIS: Die stereotaktischen Koordinaten werden auf der Paxinos und Watson ^(6. Auflage) Rattenhirnatlas ³⁶ basiert.
4. Einen Einschnitt in der Kopfhaut sagittal, um den Schädel zu offenbaren. Mit ein Paar von Wundhaken sichern die Kopfhaut eingeschnitten, um den Schädel freizulegen. Verwenden steriler Kochsalzlösung, um den Einschnitt zu spülen. Wenn Einschnitt zu nass, sterile Wattestäbchen trocknen. Suchen Sie die Bregma und markieren Sie mit einem schwarzen Marker. Um die Lage der Bohrlöcher von der Pfeilnaht und 1,6 mm hinter dem coron führen, stellen zwei weitere Marken auf etwa 1,5 mm mediolateral auf beiden Seitenal Naht.
5. Verwenden Sie eine Handbohrmaschine, um die Bohrlöcher zu machen. Achten Sie darauf, die Spitze des Bohrloch ist steril durch Sterilisieren mit Ethanol. Halten Sie den Bohrer bei etwa einem Winkel von 45 ° zu der Schädeloberfläche beim Bohren. Häufig zwischen den beiden Bohrlöchern übermäßigen Wärme an der Stelle jedes Bohrloch zu vermeiden.
6. Weiter Bohren bis die Dura freigelegt wird. Mit einer Nadel mit der Spitze gebogen ähnelt die Form eines "L", entfernen Sie alle Bruchstücke des Knochens, die das Einführen der Elektrode behindern würde. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der darunter liegenden Dura und / oder Hirngewebe beim Entfernen von Knochenfragmenten mit dem verbogenen Nadel.
   HINWEIS: Mit einem stumpfen Nadel oder feinem stumpfen Pinzette ist auch eine Option.
7. Fixieren den Dual-Elektroden-Anordnung an der Drehgriff des stereotaktischen Rahmen und fixieren den Griff in einem 90 ° -Winkel. Mit den Einstellungen in der stereotaktischen Rahmen, positionieren Sie den linken Elektrode genau über dem Bregma.
8. Mit dem Stereo-Taktik Anpassungen mediolateral Positionierung genau der linken Elektrode bewegen 1,5 mm an der linken Seite von Bregma, dass jetzt gibt es zwei Elektroden entlang der Kranznaht perfekt ausgerichtet, aber mit Abstand von 1,5 mm vom Bregma mediolateral.
9. Mit den anterioposterior stereotaktische Anpassungen, bewegen die Elektroden 1,6 mm hinter der Kranznaht.
10. Verwenden Sie die dorsoventrale Anpassungen, die Elektroden auf ersten Scheck zu senken, wenn die Bohrlöcher haben an der richtigen Stelle, so dass die Elektroden mit Leichtigkeit eingeführt werden gemacht, ohne sie zu berühren die Ecken und Kanten der Bohrlöcher. Wenn dem so ist, legen die Elektroden bis zu einer Tiefe von 5,2 mm von der Oberfläche des Schädels.
11. Die Elektroden über Leitungen an einen Stimulator bei 130 Hz, 2,5 V und 90 & mgr; s Pulsbreite ^1.
12. Liefern Hochfrequenz-Stimulation für eine Stunde (oder für eine gewünschte Zeitdauer nach Versuchsaufbau). Im Verlauf der Stimulation, vergessen Sie p versichernroper Anästhesietiefe regelmäßig durch Prüfen des MKSV Rückzug in Reaktion auf eine Zehe kneifen. Ergänzen Anästhesie mit etwa der Hälfte der Initialdosis zur Narkoseeinleitung. Vermeiden Sie die Kontamination des sterilen Handschuhen bei der Überprüfung der Narkosetiefe und bei Bedarf ändern. Führen Sie ein- oder beidseitige Stimulation auf der Grundlage eines experimentellen Anforderungen. Fügen Sie Steuerelemente wie Niederfrequenzstimulation (für z. B. 10 Hz) und nicht-stimulierten Tieren (Einfügen von Elektroden ohne nachfolgende Stimulation).
13. Nach Stimulation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Elektroden vorsichtig und Naht der Schnitt mit 3-0 Nähten oder mit sterilen chirurgischen Klammern.
14. Verabreichen Buprenorphin (0,05 mg / kg) subkutan als Analgesie. Überwachen Sie das Tier, bis es zur normalen Aktivität zurück und dann wieder in das Gehäuse Anlage.
15. Nach einem festgelegten Zeitraum auf der Grundlage der experimentellen Gestaltung (zum Beispiel 0, 3, 6 oder 12 Stunden nach der Operation DBS), Einschläfern das Tier mit Narkosedosis. Nach der Bestätigung der Abwesenheit von Vitalfunktionen, enthaupten das Tier.
16. Präparieren Sie das Gehirn, indem Sie zuerst die Haut mit einer Schere entfernen. Durch den Knochen entlang der Pfeilnaht mit Dissektion Schere geschnitten. Machen Sie zwei weitere Einschnitte (etwa einen Zentimeter pro Stück) durch den Knochen auf beiden Längsseiten. Mit einer Pinzette, heben Sie den teilweise abgetrennten Knochenstück aus der Oberseite des Schädels, das Gehirn zu schützen.
17. Mit einer feinen Schere oder Zange, entfernen das Gehirn aus dem Schädel und übertragen in eine Petrischale mit kaltem PBS auf Eis.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, um eine Beschädigung des Gehirns zu vermeiden und gleichzeitig die Einschnitte durch den Knochen.

3. Hippocampus Isolation

HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in diesem Abschnitt auf Eis.

1. Stellen Sie das Gehirn auf eine vorgekühlte Acrylgehirnmatrix auf Eis. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie das Gehirn koronal mit etwa 7-8 mm von der vorderen äußersten edge des Gehirns. Einen zweiten Schnitt koronal und hinter dem ersten Schnitt, so dass eine etwa 5 mm dicke Gehirnschnitt entfernt werden könnte.
2. Übertragen Sie die Hirnschnitt in eine Petrischale mit eiskaltem PBS. Mit Rasierklinge, trennen die beiden halbkugelförmigen Abschnitte und kümmern uns um festzustellen, welche Hemisphäre zu den linken und rechten Seite jeweils entspricht. Dies ist besonders wichtig bei der Ausführung einseitige Stimulationen.
3. Mit einer feinen Pinzette und Schere entfernen Hippocampus sorgfältig.
4. Flash-frieren die Hippocampus-Gewebe auf Trockeneis und lagern in -20 ° C Gefrierschrank bis bereit für die nachfolgenden RNA-Extraktionsschritte.
   HINWEIS: Für die Langzeitlagerung ist es ratsam, um Gewebe in einem -80ºC Gefriergerät.

4. RNA-Extraktion und quantitative PCR

1. Stellen Sie sicher, das Gewebe bleibt auf Trockeneis eingefroren, bis sie zur Homogenisierung.
2. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in der Kapuze.
   1. 1 ml Tri-Reagenz zu Hippocampal Gewebe in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen geben und homogenisieren, indem es zunächst Pipettieren mehrmals, bis das Gewebe in kleinere Stücke gebrochen. Weitere Homogenisierung des Gewebes durch Durchleiten durch eine Spritze mit einer 25 G-Nadel, bis es keine ununterbrochene Gewebe sichtbar. Führen Sie die Schritte der Homogenisierung auf Eis.
   2. Nach Homogenisieren des Gewebes, damit die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen, um die Zelllyse zu ermöglichen.
      HINWEIS: Nach dieser Stelle die Zellsuspension kann schnell sein, eingefroren und in -70 ° C bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert.
3. 0,2 ml Chloroform und mischen durch Vortexen für 20 Sekunden und lassen Sie die Lösung Rest bei Raumtemperatur für 15 min.
4. Zentrifugiere die Proben bei 12.000 g 15 min bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren vorsichtig die Schläuche ohne die drei getrennten Schichten, die sichtbar sein wird stören.
   HINWEIS: Die unten (rot) Phase enthält Proteine, Mitte bewölkt Phase enthält DNA und die obere klare Phase enthält RN / A.
5. Übertragen Sie die obere klare Phase (RNA) in ein frisches 1,5 ml Zentrifugenröhrchen (typischerweise 500 ul des RNA-Phase, die erhalten wird). Um dies zu 0,5 ml Isopropanol und durch Vortexen mischen. Dazu gibt man 2-3 ul Glycogen (20 mg / ml) als Träger für die RNA. Die Probe wird auf dem Tisch bei Raumtemperatur für 10 Minuten ruhen.
6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 · g für 1 Stunde bei 4 ° C. Sicherstellen, dass das RNA-Pellet an der Unterseite des Rohres sichtbar sind.
7. Überstand verwerfen und waschen Sie die RNA-Pellet durch Zugabe von 1 ml 75% Ethanol (hergestellt mit Nuclease freies Wasser). Kehren Sie die Probe mehrmals, bis das Pellet verdrängt aus dem Boden der Röhre und schwimmt in der Lösung. Zentrifugieren der Lösung bei 12.000 g für 10 Minuten bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Pellet in 75% Ethanol bei -20 ° C bis zur weiteren Schritte gespeichert werden.
8. Ermöglichen die RNA-Pellet an der Luft trocknen, indem man die Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur geöffnet. Nehmen Vorsichtsmaßnahme, um zu vermeiden, over Trocknen der Pellets, da dies ihrer Auflösung in Wasser in der nachfolgenden Stufe zu beeinträchtigen.

5. Entfernen von DNA aus dem RNA-Präparat

1. In 9 ul Nuklease-freies Wasser auf die RNA-Pellet und sicherstellen, dass das Pellet wird, bevor durch vorsichtiges Vortexen das Rohr gelöst. Um dieses Add 1 ul 10x DNase I-Puffer und 1 ul rekombinante DNase (von DNase I-Kit), mischen durch vorsichtiges Ausklopfen der Rohre, Spin kurz die Röhren und bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min.
2. Add 2 ul DNase-Inaktivierung Reagenz (von DNase I-Kit) auf die Probe und bei Raumtemperatur für 2 min und oft mischen durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen. Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min und Übertragung etwa 10 ul des klaren Überstands in ein frisches 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
3. Messen Sie RNA-Konzentration mit einem Nanodrop oder Spektralphotometer.

6. Herstellung von cDNA aus RNA

1. Fügen erforderliche Volumen thzumin enthält 1 ug RNA und bringt das Gesamtvolumen auf 8 & mgr; l durch Zugabe von Nuklease freiem Wasser. Um dieses Add 1 ul 10 mM dNTP Mix und 1 ul Zufallshexameren aus dem Superscript First Strand Synthesis Kit. Vorsichtig mischen und inkubieren bei 65 ° C für 5 min in entweder einem Wasserbad oder auf einen vorprogrammierten Thermocycler.
2. Einen Vormischung, die folgenden Reagenzien: 2 ul 10x RT-Puffer, 4 ul 25 M MgCl _{2, 2} & mgr; l 0,1 M DTT und 1 ul RNAse OUT (40 U / ul).
   HINWEIS: Volumes gelten pro Reaktion, würde Benutzer müssen entsprechend den eigenen experimentellen Anforderungen skalieren.
3. Nach Entfernung des RNA-Probe, die von 65 ° C, eingestellt das Röhrchen bei Raumtemperatur für eine Minute. In 9 ul Basislösung und bei Raumtemperatur für 2 min. 1 & mgr; l Superscript II Reverse Transkriptase (50 U / ul) und dann bei Raumtemperatur inkubiert für 10 min.
4. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 50min für die reverse Transkription auftritt.
5. Die Proben bei 70 ° C inkubieren, für 15 min, um die Reaktion zu beenden.
6. Legen Sie die Proben auf Eis kurz und fügen 1 ul RNAseH (2 U / ul) und bei 37 ° C für 20 min.
7. Die Röhrchen bei 3000 xg kurz zentrifugieren, um Spin-Down der Kondensatflüssigkeit.
   Anmerkung: Dies ist cDNA, die für die quantitative PCR verwendet wird. cDNA kann in -20 ° C Gefrierschrank bis PCR-Setup gespeichert werden. cDNA kann auch mit Nuklease-freies Wasser, bevor Sie mit PCR verdünnt werden.

7. Quantitative PCR

1. Geben Sie eine Master-Mix enthält die folgenden Reagenzien (Mengen gelten pro Reaktion): 6,3 ul 2x Sybr Green Mix, 0,6 ul der Forward Primer (10 uM), 0,6 ul Reverse Primer (10 uM) und 0,5 ul Nuklease freiem Wasser .
   HINWEIS: Primer Entwurf wurde unter Verwendung gemacht die "Pick-Primer 'Option im NCBI Nukleotid-Sequenz-Seite für das Gen von Interesse.
2. Zugabe von 10 & mgr; l Mastermix in jede Vertiefung einer 96 gut PCR Platte. In 2,5 ul cDNA früher die gut mit dem Mastermix hergestellt. Achten Sie darauf, dreifacher Ausfertigung PCR-Reaktionen für jede Probe einrichten.
3. Nach Beendigung der Zugabe von Mastermix und cDNA, umfassen die PCR-Platte mit Hilfe eines optischen Klebefolie, um die Vertiefungen abzudichten. Drehen die Platte kurz für 5 min bei 500 × g in einer Tischzentrifuge, um alle Flüssigkeit zu dem Boden des Bohrlochs zu regeln.
4. Laden Sie die PCR-Platte auf eine vorprogrammierte RT-PCR-Maschine. Verwenden Sie die in Tabelle 1 PCR-Parameter.
5. Datenanalyse: Verwenden Sie die C _t Werte aus der qPCR-Ausgang für weitere Berechnungen. Zusammen mit dem Testgens, bis die PCR-Reaktionen für die interne Kontrollgene 18S rRNA und β-Aktin (negative Kontrolle) (auf gleiche Eingangs gewährleisten). Berechnen fachen Änderungen basierend auf ΔΔCt Verfahren ^37.

Results

Die 1A und 1B zeigen die relative Expression von BDNF und GABRD relativ zum Steuer Gen β-Actin. BDNF ist ein Neurotrophin ist oft mit neuroprotektiven Wirkungen in vielen neuronalen Erkrankungen ^38-41 verbunden. Es ist daher interessant, das Expressionsprofil von BDNF in Reaktion auf die Stimulation des ATN das therapeutische Vorteile zu epileptischen Patienten ergibt analysieren. In 1A, die das Genexpressionsprofil von BDNF in den angegebenen Zeitpunkten zei...

Discussion

Nach dem Wahrzeichen Arbeit Benabid et al. Bei der Verwendung der tiefen Hirnstimulation zur Behandlung der Parkinson-Krankheit und essentiellem Tremor hat die DBS Operationstechnik mit großem Interesse den letzten zehn Jahren zu vielen neurologischen Erkrankungen ^6,10,43 Behandlung untersucht. DBS Studien Targeting verschiedenen neuroanatomischen Regionen des Gehirns Schaltungen werden derzeit von vielen Gruppen durchgeführt, um wichtige neuronalen Erkrankungen ansprechen und sind in verschiedenen P...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tiefe Hirnstimulation Chirurgie
Stereotaktischer Rahmen	Kopf Instruments	Modell 900
Bohrer	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamin	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, Beschaffung, Verwendung und Lagerung gemäß den institutionellen Regeln
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Anhang III Kontrollierte Substanz, Beschaffung, Verwendung und Lagerung gemäß den institutionellen Regeln
Chirurgische Klammern	ConMed Corporation	8035
Nahtmaterial (3-0)	Harvard Apparatur	72-3333
Spritze (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	steril, zur intraperitonealen Verabreichung in der Anästhesie
verwenden Spritze (3 ml, 25 G)	BD	309570	Steril, zur subkutanen Verabreichung von Analgesie
verwenden Nadeln	BD	305761	steril, zur Entfernung von Knochenbrüchen aus den Bohrlöchern
Ethanol	Fisher Wissenschaftliche	S25309B	Verwendung für die allgemeine Sterilisation
Gleitmittel für die Augen	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Modell 3628
DBS-Elektroden	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100 mm	Elektroden sind Platin, konzentrisches und bipolares
Betadin (Povidon-Jod)	PDI	S23125	Einweg-Tupfer, zur Sterilisation der Kopfhaut vor dem Einschnitt
Gehirndissektion und Isolierung
Acryl Nagetier Gehirn Matrix	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	175-300	www.emsdiasum.com
Rasierklinge	V W R	55411-050
Guillotine Schere	Clauss	18039	Stellen Sie für die Enthauptung sicher, dass diese Schere in sauberem und funktionsfähigem Zustand gehalten
Schere	Codman Classic	34-4098	Zur Entnahme des Gehirns aus dem Schädel
Zange	Elektronenmikroskopie Sciences	72957-06	Zur Entnahme des Gehirns aus dem Schädel und zur Handhabung während der Dissektion
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Boston Bioproducts	BM-220
RNA-Extraktion und cDNA-Vorbereitung
Tri Reagenz	Sigma	T9424	Immer in einem Abzug verwenden und bei der Handhabung eine Schutzbrille tragen; Kontakt mit der Haut vermeiden
Spritze (3 ml, 25 G)	BD	309570	Zur Homogenisierung von Gewebe verwenden
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Immer in einem Abzug verwenden und bei der Handhabung eine Schutzbrille tragen; Kontakt mit
Haut Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glykogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strang Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tisch-Mikrozentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Platten (96 Wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optische Klebefolien	Thermo Scientific	AB1170
Nukleasefreies Wasser	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Zeit PCR Maschine	Angewandte Biosysteme	7500