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Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

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DOI:

10.3791/52485

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7. März 2015

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1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Reife Adipozyten können durch Dedifferenzierung eine reichhaltige Quelle für Stammzellen darstellen, was zu einer homogenen Population von Fibroblasten-ähnlichen Zellen führt. Der Kollagenaseverdau wird verwendet, um reife Adipozyten aus menschlichem Fett zu isolieren. Das Ziel unseres Protokolls ist es, multipotente, dedifferenzierte Fettzellen aus humanen reifen Adipozyten zu gewinnen.

Zusammenfassung

Reife Adipozyten haben gezeigt, dass sie ihren Phänotyp in vitro durch eine Technik namens Deckenkultur in Fibroblasten-ähnliche Zellen umkehren. Reife Adipozyten können auch aus frischem Fettgewebe isoliert werden, um ihre Funktion und metabolischen Eigenschaften depotspezifisch zu charakterisieren. Hier beschreiben wir ein gut etabliertes Protokoll zur Isolierung reifer Adipozyten aus Fettgewebe mittels Kollagenase-Verdau und nachfolgende Schritte zur Durchführung von Deckenkulturen. Kurz gesagt, wird das Fettgewebe in einem Krebs-Ringer-Henseleit-Puffer inkubiert, der Kollagenase enthält, um die Gewebematrix zu stören. Schwimmende reife Adipozyten werden auf der Oberseite des Puffers gesammelt. Reife Zellen werden in einem T25-Kolben, der vollständig mit Medien gefüllt ist, plattiert und eine Woche lang kopfüber inkubiert. Ein alternativer 6-Well-Plattenkulturansatz ermöglicht die Charakterisierung von Adipozyten, die sich einer Dedifferenzierung unterziehen. Die Morphologie der Adipozyten ändert sich im Laufe der Zeit der Kultur drastisch. Die Immunfluoreszenz kann problemlos an Objektträgern durchgeführt werden, die in 6-Well-Platten kultiviert werden, wie die FABP4-Immunfluoreszenzfärbung zeigt. Das FABP4-Protein ist in reifen Adipozyten vorhanden, wird aber durch Dedifferenzierung der Fettzellen herunterreguliert. Die Dedifferenzierung reifer Adipozyten könnte einen neuen Weg für die Zelltherapie und das Tissue Engineering darstellen.

Einleitung

Die In-vitro-Dedifferenzierung reifer Adipozyten wird durch eine Technik namens Deckenkultur1 erreicht. Aufgrund ihrer natürlichen Tendenz, in wässrigen Lösungen zu schwimmen, haften isolierte reife Adipozyten an der Oberfläche eines umgedrehten Kolbens, der vollständig mit Kulturmedium gefüllt ist. Im Laufe weniger Tage verändern die Zellen ihre kugelförmige Morphologie und werden zu fibroblastenähnlichen Zellen. Die daraus resultierenden Zellen, die als dedifferenzierte Fettzellen (DFAT) bezeichnet werden, sind multipotent2. Forschungsartikel zur Dedifferenzierung von Adipozyten, insbesondere an menschlichen Zellen, sind begrenzt. Sie haben jedoch bereits interessante Informationen über die Multipotenz, den Zellphänotyp und die Replikationskapazität von DFAT-Zellen geliefert2. Reife Adipozyten, die aus verschiedenen Fettkompartimenten stammen, wurden erfolgreich dedifferenziert, einschließlich solcher, die aus dem menschlichen viszeralen und subkutanen Fettgewebe stammen2-4. Zusätzlich zu diesen Depots nahmen Kishimoto und Mitarbeiter Proben von Fettgewebe aus den bukkalen Fettpolstern und dedifferenzierten Adipozyten in DFAT-Zellen5. Matsumoto und seine Mitarbeiter erzeugten erfolgreich subkutane DFAT-Zellen von Patienten unterschiedlichen Alters, und die Mehrheit der Zellen wies selbst nach 10 Passagen in Kultur2 eine hohe proliferative Rate und eine Seneszenz von weniger als 6 % auf.

DFAT-Zellen wurden erfolgreich in mehrere Linien redifferenziert, darunter adiogene, osteogene, chondrogene und neurogene Linien2,3,6. Diese Zellen exprimieren mehrere embryonale Stammzellmarker wie Nanog und die vier identifizierten pluripotenten Faktoren Oct4, c-myc, Klf4 und Sox23. Sie exprimieren auch Marker, die für jeden der drei Keimblätter spezifisch sind7. Darüber hinaus ähneln DFAT-Zellen aufgrund ihrer epigenetischen Signatur den aus dem Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (BM-derived MSC)3. Unter Ausnutzung der Stammzellkapazität von DFAT-Zellen haben viele Gruppen ihr Potenzial zur Behandlung oder Verbesserung verschiedener Krankheiten untersucht8,9. Verbesserungen pathologischer Zustände, wie z. B. gestörtes Herzgewebe, Rückenmarksverletzungen und Harnröhrenschließmuskeldysfunktion, wurden mit DFAT-Zellinjektionen in Rattenmodellen der Krankheit10-12 beobachtet.

Zusätzlich zu den Stammzelleigenschaften von DFAT-Zellen könnten sie ein neues zelluläres Modell für Studien zur Adipozytenphysiologie darstellen. Zu diesem Zweck wird häufig die 3T3-L1-Zelllinie verwendet, da sich diese Zellen unter adipogener Stimulation in adhärente, lipidspeichernde Adipozyten differenzieren13. Diese Zellen stammen jedoch aus dem Gewebe von Mausembryonen13. Auch die Depotspezifität kann mit diesem Modell nicht untersucht werden und spiegelt möglicherweise nicht vollständig die Physiologie der menschlichen Adipozytenwider 14. Andere Laboratorien arbeiten mit isolierten Fettzellen aus murinen Fettdepots, aber die Fettverteilung ist bei Mäusen nicht dimorph und die anatomische Konfiguration der Bauchhöhle des Nagetiers verhindert eine direkte Extrapolation auf den Menschen15. Um Adipozyten im Rahmen der Physiopathologie der menschlichen Adipositas zu untersuchen, ist die Berücksichtigung der Körperfettverteilung und der Fettdepot-spezifischen Unterschiede unerlässlichgeworden 16. Einige Einschränkungen primärer Präadipozytenkulturen, einschließlich der Zellmengen aus Fettgewebebiopsieproben und ihrer Seneszenz nach einigen Passagen in Kultur, machten alternative Modelle erforderlich. Perrini und seine Mitarbeiter untersuchten die Depotspezifität in der Genexpression von DFAT-Zellen, die aus viszeralem und subkutanem Fett stammen, und verglichen sie mit aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) aus demselben Fettdepot. Sie zeigten, dass Unterschiede in der Genexpression und -funktion hauptsächlich zwischen den Depots als zwischen den Zelltypen zu finden sind, was darauf hindeutet, dass DFAT-Zellen physiologisch nahe an ASC aus demselben Depot sind. DFAT-Zellen könnten eine interessante Alternative zu verfügbaren Modellen für Studien zur Fettverteilung in der Pathophysiologie der menschlichen Adipositas darstellen. Darüber hinaus ist die Deckenkultur eine vielversprechende Methode, um adulte Stammzellen für Tissue Engineering-Zwecke zu gewinnen.

Hier beschreiben wir den Kollagenase-Verdau, eine weit verbreitete Technik zur Isolierung reifer Adipozyten aus den subkutanen und/oder viszeralen Fettproben17, und die nachfolgenden Schritte zur Durchführung einer Deckenkultur und zur Dedifferenzierung dieser Zellen in multipotente, fibroblastenähnliche Zellen.

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Protokoll

Ethics Statement: Das Projekt wurde von Forschungsethikkommission IUCPQ die vor der Rekrutierung von Patienten zugelassen. Für die Zwecke dieses Artikels / Video, erhalten wir Gewebe von 2 Patienten: 1) ein 62 Jahre alten männlichen Patienten mit einem BMI von 50,7 kg / m 2 und 2) eine 35-jährige Patientin mit einem BMI von 57 kg / m 2. Experimente können mit beiden Fettkompartimente geführt werden, sondern müssen eine Fettkammer für die Zwecke dieser Video beschränkt. Technische Aspekte der Video wurden mit Patienten-1 durchgeführt, und FABP4 Immunofluoreszenz wurde mit undifferenzierten Zellen von Patienten 2 durchgeführt.

1. Probenbearbeitung

  1. Frag Chirurgen Fettgewebe aus den omentalis und subkutane Fett Fächer bei der laparoskopischen Adipositaschirurgie zu sammeln.
  2. Bringen schnell adipose Proben an das Labor bei RT und sofort verarbeitet.
  3. Führen Verdauung im Labor, in einer nicht sterilen Atmosphäre. DieZellen werden schließlich zu dem Kulturraum überführt und unter sterilen Bedingungen kultiviert werden. Um Verunreinigungen zu vermeiden, bereiten KRH-Puffer mit destilliertem Wasser und filtriert, und folgen Sie durch eine Filtration (0,22 um Filter) vor dem Aufschluss. Gründlich reinigen Rohre mit Ethanol vor Transfer in die Zellkultur Haube für Kolben und Plattenherstellung.
  4. Zeigen Fettgewebe auf einem bereits gewichtet Gericht und Rekordgewicht. Fix ein kleines Stück von jeder Gewebeprobe (weniger als 1 cm 2) in 10% Formalin-Puffer bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden vor der Paraffineinbettung. Verwenden Sie diese eingebetteten Probe für die Immunhistochemie Experimente (Technik nicht gezeigt).
  5. Stellen Sie ein weiteres Stück in einem 50-ml-Tube und Flash-freeze in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei -80 ° C für weitere Studien auf ganzen Fettgewebe (zB Genexpression - Technik nicht gezeigt).

2. Kollagenaseverdau

  1. Legen Sie die übrigen Fettgewebe Stück in einem 50 ml-tuist für die Verdauung.
  2. 4 ml KRH-WB mit Collagenase (350 U / ml) ergänzt pro Gramm Probe in dem Aufschlußbehälter.
  3. Hackfleisch Fettgewebe mit einer Schere.
  4. Platzieren Hackfleisch Fettgewebe Suspension in einem Schüttler bei 37 ° C, 90 Upm maximale, für eine 45-minütige Inkubation (für 1 h).

3. Reinigung von Adipozyten und Präadipozyten

  1. Gießen Sie das durchscheinende Lösung mit wenigen Stücke von Fett durch ein 400 & mgr; M Nylon Netz in einen Kunststoffbecher.
  2. Mit Pinzette, reiben Sie die Zellpräparation auf der Nylon-Mesh und wäscht mit 5 ml KRH-WB.
  3. Die filtrierte Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen mit dem Kunststoffschlauch in ihm und einer 60 cm³-Spritze am Rohrglied befestigbar zart zu übertragen.
  4. Lassen Sie die Suspension mit reifen Fettzellen stehen für etwa 10 Minuten, so dass die Zellen an die Spitze des Puffers durch Flotation zu erreichen.
  5. Langsam absaugen Puffer am Boden des Röhrchens mit 60cc syringe Absaugung.
  6. 20 ml KRH-WB zu waschen. Wiederholen Sie ab Schritt 3.4 für 2 zusätzliche Wäschen.
  7. Sammeln Sie den Puffer, um die Adipozyten Suspension bis zu einem Endvolumen von 5 bzw. 10 ml zu bringen, abhängig von der Zellmenge. Verfolgen Sie mit den Schritten in Abschnitt 5.
  8. Wiederherstellen des Stroma-Kreisfraktion aus der mit dem 60 cm³-Spritze durch Zentrifugation (3000 rpm, RT, 5 min) zur weiteren primären Zellkultur gesammelt falls Puffer (Technik nicht gezeigt).

4. Mature Adipocyte Zellzahl

  1. Last 10 ul sanft geschüttelt Adipozyten-Suspension in einer Zählkammer (Hämozytometer). Führen Zellzahl in vierfacher Ausfertigung.
  2. Berechnung der Anzahl der isolierten reifen Zellen.

5. Mature Adipocyte Dedifferenzierung in T-25-Kolben

  1. Ein 25 cm 2 Zellkulturflasche auf das Volumen mit DMEM / F12-20% Kälberserum ¾ füllen.
  2. Nach Zellzahl, gießen 500.000 reifen Zellen in den Kolben.
  3. Der Kolben wird komplett mit einem 50 ml Röhrchen mit Medium Füllen Sie und entfernen Sie so viele Blasen wie möglich.
  4. Schrauben Sie den unbelüfteten Kappe auf den Kolben.
  5. Der Kolben wird mit Ethanol vor der Inkubation zur Vermeidung von Verunreinigungen zu säubern.
  6. Die Flasche auf den Kopf für eine Woche Inkubation ohne es zu berühren, um eine Bewegung in der Kultur, die Zelladhärenzfaktor stören könnten.
  7. Vor der Umkehr des Kolbens bei 7 Tagen nach der umgekehrten Kultur vorsichtig die Flasche zu manipulieren und entfernen Sie alle Medium im Kolben durch Aspiration, die Vermeidung abrupter Bewegungen.
  8. Fügen Sie 12 ml DMEM-F12-20% Kälberserum und pflegen Zellen mit Standardtechniken. Eine gefilterte, belüfteten Kappe kann in den Kolben gegeben werden.

6. Mature Adipocyte Dedifferenzierung in einer 6-Well-Platte

  1. Legen Sie ein Deckglas auf dem Boden jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen
  2. Fügen Sie einen ½ "Kunststoffbuchse auf der jeweils Deckglas.
  3. Füllen Vertiefungen mit 8 ml 20% Kälberserum-DMEM Medium.
  4. Setzen Sie ein Deckglas auf jedem Kunststoffbuchse.
  5. Legen Pipettenspitze zwischen dem Schieber und dem Rohr, Zellen unter dem Objektträger zu injizieren (50.000 Zellen pro Vertiefung).
  6. Platten in einem Standardzellkulturbrutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 für eine Woche.
  7. Reverse Deckglas mit anhaftenden Zellen in jeder Vertiefung, die 2 ml Medium mit 20% Kälberserum und verfolgen Kultur.
  8. Verwenden Deck mit Zellen, die eine Dedifferenzierung für mehrere Zwecke, einschließlich Immunfluoreszenz (Technik nicht gezeigt).

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Ergebnisse

Wichtige morphologische Veränderungen auftreten, um Fettzellen während der Entdifferenzierung (Abbildung 1) zu reifen. Wie in Figur 2 gezeigt ist, wurden Zellen, die eine Dedifferenzierung mit einem Anti FABP4 Antikörper zur Fluoreszenz-Analyse gefärbt. Zellen mit einem runden Morphologie äußerte die FABP4 Protein, während die Mehrheit der Fibroblasten-ähnlichen Zellen nicht. Nach Entdifferenzierung kann DFAT Zellen mit Standardverfahren für mehrere Passagen kultiviert werden. Wir sind ...

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Diskussion

Entdifferenzierung von reifen Fettzellen mit der Decke Kulturtechnik ist ein neues Konzept für die Fettgewebestammzellen aus einer kleinen Probe von einheimischen Fettgewebe erhalten. Aufgrund unserer Erfahrungen und die der anderen 2 ist ein Gramm Gewebe ausreichend, um eine 25-cm 2-Kolben Platte und eine Bevölkerung von DFAT Zellen, für die Homogenität von Poloni und Mitarbeiter 3 gezeigt zu erhalten. Adipocyte Entdifferenzierung scheint mit Zellen von jedem Spender möglich, unabhängig...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (371697-2011, AT). Die Autoren möchten sich für die Hilfe der bariatrischen Chirurgen Dr. S. Biron, F-S. bedanken. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau sowie Christine Racine und Caroline Gagnon von der IUCPQ Tissue Bank. Wir danken Herrn Jacques Cadorette von den audiovisuellen Diensten der IUCPQ für die Videodreharbeiten und -bearbeitung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RinderserumalbuminSigmaA7906
AdenosinSigmaA4036
AscorbinsäureSigmaA0278
NaClJede Marke kann verwendet werden
KClJede Marke kann verwendet werden
CaCl2Jede Marke kann verwendet werden
MgCl2Jede Marke kann verwendet werden
KH2PO4Jede Marke kann verwendet werden
HEPESJede Marke kann verwendet werden
GlukoseJede Marke kann verwendet werden
Kollagenase Typ IWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12, HEPES, kein PhenolrotGibco-Life Technologies11039-021Zu Medium hinzufügen : 20% Kälberserum, Gentamicin (50 &; Mikro; g/ml) und Fungizone (2,5 & Mikro; g/ml)
Kälberserum, Eisenzusatz, von mit Säuglingsnahrung gefütterten KälbernSigmaC8056-500 ml
1/2 In KunststoffbuchseIberville2704-CPArtikelnummer:1000120918 (Home Depot)
Flüssiger StickstoffLinde
Formalin gelöster Stoff, neutral gepuffert, 10%SIGMAHT501128
Sterile Pinzette
Sterile Schere
60 cc SpritzenBD Spritze
Kunststoffschläuche
Krebs-Ringer-Henseleit Stammpuffer (KRH)Stoffpuffer wie folgt vor: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)Geben Sie die folgenden Komponenten frisch zum KRH-Puffer: 4% Rinderserumalbumin, 5 mM Glukose, 0,1 &; Mikro; M Adenosin, 560 & Mikro; M Ascorbinsäure
KRH-WB, ergänzt mit Kollagenase350 U/ml Kollagenase Typ I,
T25, unbelüftete Kappen-GewebekulturflascheSarsted oder eine andere Marke
6-Well-GewebekulturplatteBD Falcon oder eine andere Marke
Mikroskop-Deckglas 22x22Fisherbrand12-542-B
Sterile Becher
Bereiten Sie den Typ I, ,

Referenzen

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Schlagwörter

Ceiling CultureKollagenase VerdauGewebeisolierungDedifferenzierungsprozessFABP4 ImmunfluoreszenzZellmorphologieTissue EngineeringZelltherapie

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