Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Zusammenfassung

Zebrabärbling Keratozyten migrieren in Zellschichten aus Explantaten und stellen eine in vitro-Modell für die Untersuchung der Mechanismen der kollektiven Zellmigration im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Diese Protokolle Detail ein effektiver Weg zur primären Explantatkulturen für den Einsatz in kollektive Zellmigrationsassays herzustellen.

Zusammenfassung

Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften motile dissoziierte Fisch Keratozyten aus Explantatkulturen werden seit langem verwendet, um die Mechanismen der einzelnen Zellwanderung zu untersuchen. Allerdings, wenn Explantate ansässig sind, diese Zellen zusammen bewegen sich auch, die Aufrechterhaltung viele der Funktionen, die einzelnen Keratozyten ein attraktives Modell, um die Migration zu studieren machen: schnelle Raten von Beweglichkeit, umfangreiche Aktin-reichen Lamellen mit einer senkrecht Aktin Kabel und relativ konstanter Drehzahl und Migrationsrichtung. In frühen Explantate, die rasche Umwandlung von Zellen einzeln Migration mit denen die Migration kollektiv ermöglicht die Untersuchung der Rolle der Zell-Zell-Adhäsionen bei der Bestimmung des Modus der Migration, und betont die molekularen Bindungen zwischen den beiden Betriebsarten der Migration. Zellen in späteren Explantate verlieren ihre Fähigkeit, rasch und gemeinsam wandern, wenn eine epitheliale mesenchymalen Übergang auftritt und Genen mit der Wundheilung und Entzündung verbunden sind, differentiell exprimierten. Somit kann Keratozyten Explantate als in vitro-Modell für die Reepithelialisierung die kutanen Wundheilung auftritt, und kann ein einzigartiges System zur Mechanismen kollektiver Zellmigration im Rahmen eines definierten Programms von Veränderungen der Genexpression zu studieren repräsentieren dienen. Eine Vielzahl von Mutanten und transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die Explantate von Fisch mit verschiedenen genetischen Hintergründen festgelegt werden kann. Dies ermöglicht es die Rolle von verschiedenen Proteinen innerhalb dieser Prozesse eindeutig adressiert werden. Die hier aufgeführten Protokolle beschreiben eine einfache und effektive Methode zur Festlegung dieser Explantatkulturen für den Einsatz in einer Vielzahl von Assays auf Kollektiv Zelle Migration.

Einleitung

Studium der Zellbewegung traditionell auf individuell wandernden Zellen konzentriert. Keratozyten von Fischen und Amphibien Explantate kultiviert haben sich als ein leistungsfähiges Modellsystem, um die Mechanismen der Zellbeweglichkeit Studie mit experimentellen und mathematischen Modellierung nähert ^1-6 sein. Experimentelle Arbeiten auf individuell wandernden Zellen wird durch die schnelle, leichtgängige Bewegung der Zellen unterstützt, und gleichzeitig eine gleichmäßige Form, Geschwindigkeit und Richtung. In vivo werden Zellen kollektiv bewegen häufig während Zell-Zell-Junctions, insbesondere während der Embryogenese, Wundheilung und Metastase. So ist kollektive Zellmigration eine wachsende und immer wichtigere Forschungsgebiet im Bereich der Zellmigration. Die kollektive Migration dieser Zellen wurde vor kurzem beschrieben ⁷ und es hat viele einzigartige Eigenschaften, die es ein leistungsfähiges System zur kollektiven Zellmigration in einer Wundheilung Modell untersuchen zu machen.

ove_content "> Beim Schuppen werden aus einem betäubten erwachsenen Zebrafisch gezupft bleibt etwas Epithelgewebe an der Unterseite des Umfangs angebracht ist. Wenn die Zellkulturmedium zugegeben wird, diese Epithelzellen oder Keratozyten, schnell wandern als Sammeleinheit von der Skala. Das Explantatkultur kann als epitheliale Wundheilung Modell, in dem die Zellen wandern vom Explantat wie sie es in der vorläufigen Matrix eines Wundbett um ein intaktes Epithel wiederherzustellen angesehen werden. Neuere Daten legen nahe, dass dieser ex vivo-Kultur imitiert viele Merkmale in vivo Wundheilung bei erwachsenen Zebrafisch. Wundverschlussraten ⁸ zu einer Wanderungsgeschwindigkeit ähnlich zu der in den ex-vivo-System ⁷ beobachtet übersetzen. Zusätzlich wird in einem in vivo-Wundheilungsmodell Behandlung mit Warfarin legt nahe, dass die Hämostase hat keine Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Heilung, ist während der Behandlung mit Hydrocortison zur Immunantwort verringern nicht Reepithelialisierung ⁸ verzögern . Da der Zebrafisch blutet nicht, wenn die Waage aus dem Tier entfernt wird, ist die Blutstillung nicht ein wichtiger Akteur. Obwohl wir Immunzellen im Explantate finden, haben wir nicht die Auswirkungen sie auf kollektive Zellmigration haben könnte untersucht.

Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Zebrafisch Keratozyten Explantatkulturen, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit für den Einsatz in vielen biologischen Tests gewährleistet werden kann. Diese Explantatkulturen sind aus mehreren Gründen besonders überzeugende in-vitro-Modell für gemeinsame Zellmigration. Erstens sind die Zebrafisch-Keratozyten Primärzellen innerhalb weniger Stunden nach Gründung Explantatkulturen verwendet. Deshalb wurden diese Zellen nicht die morphologischen Veränderungen der Genexpression und mit dem Durchgang von primären Zellen assoziiert ^9-13 unterzogen. Zweitens, stellt dieses System ein Modell für die Untersuchung der Reepithelialisierung in Antwort auf Verwundung ¹⁴ und, als Teil der Antwort auf Verwundung eines epithelialen mesenchymale transition Prozess (EMT) initiiert wird, wie Veränderungen in der Genexpression und der Umordnung des Cytoskeletts ^14,15 belegt. Somit ändert sich der Hintergrund in der Genexpression und der Beweglichkeit, die in unbehandelten Zellen auftreten wurden charakterisiert und einen Rahmen, um Änderungen bei der Behandlung zu interpretieren. Darüber hinaus die Fische Keratozyten und die menschliche Keratinozyten sind funktionell gleichwertig; beide sind die primären Epithelzellen der jeweiligen Arten und spielen eine Schlüsselrolle in epithelialen Wundheilung. Drittens erwachsenen Zebrafisch werden zunehmend Anerkennung als ein Modellsystem für eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen ^16-18 einschließlich Melanomen und anderen Krebs ^19-21, kutane Wundheilung ^8,14 und Geweberegeneration ^22-24.

Technische Vorteile dieses Modellsystems sind gleichermaßen überzeugend. Eine wachsende Zahl von Mutanten und transgenen Linien sind von Non-Profit, zentrale Einrichtungen. Insbesondere wird das Zebrafisch-Mutation Project (ZMP) Am Wellcome Trust Sanger Institute zielt darauf ab, einen KO-Allel in jedem Protein kodierenden Gens im Zebrafisch-Genom zu schaffen. Derzeit haben sie 11.892 Gene, etwa 45% des Genoms mutiert, mit 24.088-Allele aufweist. Darüber hinaus übernimmt ZMP Vorschläge und Knock-outs kostenlos zu generieren. Neue Methoden der Gen-Knockdown in Larven und erwachsenen Zebrafisch ^25-28 bieten Flexibilität, um die Funktion von entwicklungspolitisch wichtige Gene für die transgene Ansätze problematisch oder unmöglich zu studieren.

Durch ihre extrem schnelle Raten von Motilität von ~ 145 um / h kurz nach Gründung der Kulturen ²⁹ können Assays schnell (in der Regel in 24 Stunden oder weniger) durchgeführt werden. Wie Versuche kann schnell abgeschlossen werden und Kulturen wachsen gut bei RT mehrere der technischen Hürden mit Säugerzellmigration Assays, die Videomikroskopie vermieden verbunden. Außerdem im Zeitalter der Anzugsforschungsbudgets, zebrafish sind einfach und kostengünstig gepflegt.

Die Struktur und das Verhalten der Explantation ist komplex. Da die Fische nicht ausbluten, wenn die Waage entfernt wird, ist es unwahrscheinlich, dass viel mehr als die oberflächlichen Schichten der Epidermis mit der Waage entfernt. Keratozyten scheinen die vorherrschende Zelltyp in dem Explantat, wenn Skalen werden zunächst aus dem Fisch entfernt, da die große Mehrheit der Zellen scheinen mit einem Anti-E-Cadherin-Antikörper ¹⁴ zu färben. Darüber hinaus gibt es keine Hinweise auf Fibroblasten in der Vorkultur wie durch die Abwesenheit von Vimentin Färbung beurteilt durch Immunofluoreszenz ^14. Aber mit wiederholter Steinentfernung scheint es zahlreiche Neutrophile in der Explantation (siehe Video 1). Wir haben diese Zellen wie Neutrophile, basierend auf morphologischen Beobachtungen ihrer Größe schnell Motilität und ihre Migration aus der Zelle ausgewiesenen, wenn sie LPS ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt). Zusätzlich werden diese Zellen zu färben hell Witzh ein Antikörper gegen Neutrophilen cytosolischen Faktor sowie mit einer Vielzahl von sekundären IgG-Antikörper, was darauf hinweist, dass sie reichlich FcRs auf ihrer Oberfläche haben (Daten nicht gezeigt). Mehrere Zellschichten sind in der Explantation vorhanden. Konfokale Mikroskopie zeigt die Anwesenheit einer einzigen Schicht in der Nähe der Vorderkante, um mehr als zwei Schichten von Keratozyten nahe der Skala mit Neutrophilen sichtbar oberhalb, unterhalb und zwischen den Zellen Keratozyten Blättern.

Zu frühen Zeitpunkten, Zellen auf dem Rand des mehrschichtigen Explantat polarisieren, Initiieren kollektiven Migration Keratozyten aus dem Explantat mit anfänglichen Geschwindigkeiten von ~ 145 & mgr; m / h beträgt. Das von dem Explantat abgedeckt schnell zunimmt, was zu Zellausbreitung, Spannung in dem Blatt, und eine verringerte Vorschubgeschwindigkeit von der Vorderkante. Rapid Umwandlungen zwischen führenden und folgenden Zellen werden an der Vorderkante während der Bildung und der Schließung von spontan gebildeten Löcher in der Folie ⁷ beobachtet. Wie dieEMT-Prozess mit dem Explantat initiiert weiterhin die Blattfragmente und die Keratozyten verlieren ihre spezielle, schnelle Beweglichkeit. Genexpression und morphologischen Veränderungen, die mit EMT, Wundheilung, und Entzündungsreaktionen auftreten, innerhalb von 7 Tagen Kultur mit Explantaten erwogen fähig ca. 10 Tage ^14.

Protokoll

Dieses Protokoll entspricht den AVMA Tierschutzgrundsätze für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an Midwestern University zugelassen.

1. Vorbereitung der Anästhesie, Ausstattung, & Medien

1. Entchloren ca. 1,5 l Leitungswasser entweder mit einem kommerziellen Entchlorungsmittel (erhältlich in Zoohandlungen) oder durch stehendes Wasser für 24 Stunden. Wenn Sie drei 1 l Becher und füllen jeweils mit 500 ml entchlortes Wasser. Beschriften Sie eine für das Halten von Fisch vor jedem Verfahren und eine für die Wiederherstellung. Zum dritten Becherglas 100 ug / ml Tricaine Methansulfonat; dies wird das Becherglas, in dem Fische betäubt werden.
2. Füllen Sie eine flache Schale mit Eis, warm das Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FBS (fötales Rinderserum), 50 ug / ml Gentamycin, 100 ug / ml Kanamycin, 25 mM HEPES) auf RT und sammeln Pinzette sauber Juwelier. Saubere Pinzette durch immersingen die Tipps in 70% Ethanol und durch einen Bunsenbrenner, so dass das Ethanol zu verbrennen.
3. Entscheiden Sie, ob das Verfahren wird ohne Vergrößerung mit 2 durchgeführt werden, mit einem handelsüblichen, auf dem Tisch beleuchtete Lupe - 10-facher Vergrößerung oder Binokular (völlig abhängig von persönlicher Vorliebe).

2. Stellen Sie Explantatkulturen

1. Fangen Sie die gewünschte Anzahl von Fischen und in einen Haltebecher. Übertragen einer einzigen Fisch auf die Anästhesie-Becher; ist es am besten, um Fische einzeln zu betäuben.
2. Überwachen Sie die Auswirkungen der Narkose durch Beobachtung der Schwimmen und Kiemen Bewegung des Fisches. Als Narkosefortschreiten verlangsamt Kiemen Bewegung und die Fische werden unregelmäßig und häufig auf den Kopf zu schwimmen; betrachten Fische betäubt, sobald Kiemen Bewegung aufhört. Haben die Fische verlassen nicht für längere Zeit in der Anästhesie Bad, da dies zu den Tod der Fische führen.
3. Fisch aus der Narkose Becher und Transfer entfernenEis, indem die Fische horizontal mit dem Schwanz vor der Hand, die Pinzette. Wenn mit der Technik und wenn erfahrene mehrere Fische verwendet werden, um Explantate zu machen, in Betracht ziehen, den nächsten Fisch im Narkose Becher zu diesem Zeitpunkt.
4. Um Schuppen zu entfernen, Position Pinzette parallel zum Fisch mit Spitze am Rand der Skala. Drücken Flachseite der Pinzette leicht in die Seite des Fisches zu bewirken, dass die Skala auf dem Körper des Fisches zu erhöhen. Fassen Skala mit einer Pinzette zupfen und Ort (ohne Inversion) in Gewebekulturschale. Wiederholen Sie das Verfahren, das Entfernen maximal 12 Waagen aus einer großen Erwachsenen (6 von jeder Seite), die Vermeidung der Kiemenregion, die Seitenlinie, und Flossen.
5. Den Fisch in die stabile Becher und zu überwachen, um sicherzustellen, dass sie von den Auswirkungen der Narkose erholt. Zu diesem Zeitpunkt können die Fische zurück zu einem einzelnen Tank überführt werden. Lassen Sie den Fisch, der für mindestens 21 Tage zu erholen, um eine vollständige Skala Regeneration zu ermöglichen.
6. Abhängig von derexperimentelles Design, legen Sie bis zu 20 Waagen pro Kunststoff 35 mm Gewebekultur-behandelte Schale oder 4-6 Skalen pro Glasbodenschale. Lassen Skalen auf dem Teller vor sanft Hinzufügen von Medien, um nicht Schuppen aus der Schale lösen haften.
   HINWEIS: Mit zunehmender Erfahrung kann mehrere Fisch verarbeitet werden, bevor Medien dem ersten Schale zugegeben.
7. Fügen Sie 1,2 ml Vollmedium (siehe 1.2) in jede 35-mm-Schale.
8. Explantatkulturen vorzugsweise inkubieren bei 28 ° C in 5% CO ₂ für den gewünschten Zeitraum mit oder ohne zusätzliche Behandlung. Alternativ inkubieren Kulturen auf einem geheizten Mikroskoptisch oder in einem Live-Zellkulturkammer für Videomikroskopie.

3. Hellfeld und Videomikroskopie

1. Position Schalen mit Zellschichten auf den Mikroskoptisch und zunächst mit dem Fokus 4X Objektiv.
   HINWEIS: Höhere Vergrßerungen können verwendet werden, je nach dem Experiment. Kennzeichnung die Positionjede Zellschicht und / oder Orientierung der Schale auf der Bühne erleichtert die Aufnahme von Bildern über die Zeit, wobei die Blätter in etwa gleicher Ausrichtung.
2. Gerichte aus dem Inkubator und fotografieren zu verschiedenen Zeitpunkten zu entfernen, nach jeder Versuchsprotokoll und legen Sie wieder in den Inkubator, wenn nur Standbilder werden über die Versuchszeitrahmen benötigt.
3. Bei der Durchführung von Videomikroskopie, achten Sie auf die folgenden:
   1. Positionieren der Skala / Schwellenzellschicht im Sichtfeld, so dass die Migration von Zellschicht in dem Sichtfeld für die Dauer des Video bleibt.
      Hinweis: Dies kann einige Erfahrung in der Beobachtung, wie Zellen wandern unter dem Maßstab zu nehmen. Für kurze Videos, ist dies weniger ein Problem als für längere Videos.
   2. Bei kürzeren Zeitrahmen, Inkubation bei RT. Bei längeren Zeitrahmen (18 + h), mit einem beheizten Stufe oder eine Inkubationskammer auf Temperatur zu halten, pH-Gleichgewicht, und das Verdampfen des Kultur m minimierenedium.

4. Fixierung für Immunfluoreszenz-Mikroskopie

1. Vorbereiten und pre-warmen alle Lösungen auf 28 ° C. Um Keratozyten unter Fluoreszenz anzuzeigen, Explantatkulturen wachsen wie oben mit Glasboden-35-mm-Gewebekulturschalen beschrieben. Alternativ können Sie auch Glaskammer gleitet.
2. Hinzufügen von 0,8 ml 4% Paraformaldehyd in 1,1 x PBS zu jeder Schale. Den Kulturmedien herausgezogen haben. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen.
3. Hinzufügen von 0,8 ml 4% Paraformaldehyd in 1,1 x PBS zu jeder Schale. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen.
4. Sofern nicht mit externen Liganden oder externen Epitope permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS 1X. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen.
5. 0,5 ml von 1% BSA in 1 × PBS und Inkubation für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C).
   HINWEIS: Je nach Versuchsbedingungen phalloidin kann in diesem Schritt zugegeben werden.
6. Nach der Inkubation zum Ansaugen der Lösung zu entfernen und fahren Sie mit Antikörperfärbung. Alternativ speichern die Kulturschalen durch Zugabe von mindestens 1 bis 2 ml 1% BSA in 1 × PBS für 3-4 Wochen bei 4 ° C.

5. Immunfluoreszenz-Protokoll

1. Bereiten primären und sekundären Antikörper-Lösungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
   HINWEIS: Wenn die Empfehlungen des Herstellers verfügbar sind, ein guter Ausgangsverdünnung von primären Antikörpern (in 1% BSA in 1 × PBS) 1: 500 für polyklonale und 1: 1000 für monoklonale Antikörper; ein guter Ausgangsverdünnung für Sekundärantikörper 1: 1.000. Passen Sie diese Verdünnungen der ursprünglichen Bestand des Herstellers vorliegt höher, wenn das Signal schwach ist, geringer, wenn das Signal stark und Hintergrund ist ein Problem.
2. Saugen Sie das 1% BSA in 1x PBS-Lösung. 0,5 ml der primären Antikörperlösung, Inkubation für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C).
3. Entfernen Sie den primären Antikörperlösung, legen Sie in eine saubere und etikettiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.
   ANMERKUNG: Dies ermöglicht die Wiederverwendung des primären Antikörpers, wenn nötig.
4. Mit 1x PBS 5-mal, das Entfernen und Verwerfen des PBS nach jeder Wäsche - Waschen Sie die Teller 3.
5. 0,5 ml der sekundären Antikörper-Lösung. Wenn gewünscht, fügen fluoreszenzmarkierten Phalloidin (nach beliebiger Hersteller empfohlenen Konzentration) bei diesem Schritt. Inkubieren für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C).
   HINWEIS: Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Phalloidin erlaubt die Visualisierung von Aktin-Filamenten; Wir haben gefunden, daß 488-markiertem Phalloidin funktioniert am besten in unserer Zebrabärbling Keratozyten, aber auch andere Fluorophore verwendet werden.
6. Entfernen und entsorgen Sie die sekundäre Antikörperlösung.
7. Mit 1x PBS 5-mal, das Entfernen und Verwerfen des PBS nach jeder Wäsche - Waschen Sie die Teller 3.
   HINWEIS: Das Gericht kann gespeichert werden, von Licht bedeckt, bei 4 ° C, wenn nicht view sofort; stellen Sie sicher, 1x PBS wird vor dem Speichern, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen, aber warm auf RT in die Schale gegeben (20 - 30 min), und nehmen Sie die PBS kurz vor Sie mit dem nächsten Schritt.
8. Wenn Sie bereit sind, zu beobachten, fügen Sie 2-3 Tropfen einer Einschlussmittel, mit oder ohne DAPI, abhängig von den experimentellen Anforderungen, in die Schüssel und lassen Sie sich für 10 min bei RT.
   HINWEIS: Wir verwenden ein handelsübliches, Glycerinbasis Eindeckmedium mit DAPI, aber auch andere Befestigungsmittel können angewendet werden. Zulassen 10 min für das Fixiermittel in der Schale sitzen, erleichtert die Entfernung des Deckglases aus dem Boden der Schale.
9. Nach der Inkubation drücken Sie leicht auf die Seiten der Schale zu lösen und entfernen Sie das Deckglas. Fügen Sie einen zusätzlichen Tropfen Eindeckmittel auf einen Objektträger und legen Sie das Deckglas, Zellen nach unten, auf die Folie.
   HINWEIS: Betrachten Abdichtung der Deckglas auf den Objektträger mit klarem Nagellack, wenn der Schieber muss länger als 1 gehalten werden - 2 Tagen.
10. Beachten Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop.
    HINWEIS: Die meisten unserer Bilder wurden mit einem 40X oder 63X Objektiv unter Ölimmersion genommen, aber die spezifischen verwendeten Objektivlinse wird auf dem Versuchsprotokoll ab.

Ergebnisse

Wie in Figur 1 dargestellt ist, können Blätter von Keratozyten Migration aus unter der Skala innerhalb von Stunden nach Errichtung der Explantatkultur beachten. Gelegentlich kann ein individuell Migration Keratozyten, die aus dem gemeinsam Migration Blatt weggebrochen wurde, einzuhalten ist. Zusätzlich, da das Explantat von einem Fisch, der zuvor gezupft worden hergestellt ist, gibt es reichlich Neutrophilen migrieren durch die Folie. Bei längeren Kulturzeiträume, die Keratozyten Blatt Fragmente als Zel...

Diskussion

Der entscheidende Schritt für den Erfolg der Keratozyten Explantatkultur wird kann die Waage in die Kulturschale für etwa 2 haften - 3 Minuten vor der Zugabe von dem Kulturmedium. Etwa 75% der Schuppen haften und wachsen Blätter (die Anzahl der Kulturen für jedes Experiment etabliert müssen entsprechend angepasst werden). Keratozyten Blätter sind nicht an jeder Waage aus dem Fisch herausgenommen und in der Kultur aus verschiedenen Gründen getätigt. Zuerst DAPI-Färbung von Explantaten auf, dass einige Skalen haben wenige...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35 mm Kulturschalen mit Glasboden (Poly-D-Lysin-beschichtet)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	mit einer Dicke von 1,5 mm eignet sich am besten zum Entfernen von Deckgläsern. 14 mm Durchmesser bietet mehr Kulturfläche.
Swiss Jewelers Style Pinzette, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	Wir finden, dass schmale, feine Pinzetten am besten für die Entfernung von Zunder geeignet sind.