Semi-High Throughput Screening für potentielle Dürre-Toleranz in Kopfsalat ( Lactuca sativa) Keimplasmasammlungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine große Keimplasmasammlung des Blattgemüsesalats (Lactuca sativa L.) auf Trockenheitstoleranz zu untersuchen, um einen kleinen Kandidatenpool von Salat für physiologische, molekulare und genetische Studien zur Identifizierung der zugrunde liegenden Trockenheitstoleranzmerkmale zusammen mit Züchtungsprogrammen zu identifizieren.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, mit der eine große Ansammlung des Keimplasmas des grünen Blattgemüsesalats (Lactuca sativa L.) auf wahrscheinliche Trockenheitstoleranzmerkmale untersucht wurde. Die Verfügbarkeit von Frischwasser für die landwirtschaftliche Nutzung ist sowohl in den Vereinigten Staaten als auch in vielen Regionen der Welt ein wachsendes Problem. Kurzfristige Dürreereignisse zusammen mit regulatorischen Eingriffen in die Regulierung der Wasserverfügbarkeit in Verbindung mit der drohenden Gefahr langfristiger Klimaveränderungen, die in vielen wichtigen landwirtschaftlichen Regionen zu geringeren Niederschlägen führen können, haben die Notwendigkeit erhöht, die Entwicklung von Kulturen zu beschleunigen, die an eine verbesserte Wassernutzungseffizienz angepasst sind, um die Produktion in den kommenden Jahren zu erhalten oder auszuweiten. Dieses Protokoll ist nicht als Schritt-für-Schritt-Anleitung gedacht, um auf physiologischer oder molekularer Ebene Merkmale der Trockentoleranz von Salat zu identifizieren, sondern es handelt sich um eine Methode, die durch das Screening von Tausenden verschiedener Salatsorten entwickelt und verfeinert wurde. Die Art dieses Screenings basiert zum Teil auf den optimierten Messungen, die sich nur auf drei Wasserstressindikatoren konzentrieren: den relativen Wassergehalt der Blätter, die Welke und das unterschiedliche Pflanzenwachstum nach Trockenstress. Der Zweck des schnellen Screenings einer großen Keimplasmasammlung besteht darin, den Kandidatenpool so weit einzugrenzen, dass intensivere physiologische, molekulare und genetische Methoden angewendet werden können, um spezifische dürretolerante Merkmale entweder im Labor oder im Feld zu identifizieren. Kandidaten können auch direkt in Zuchtprogramme aufgenommen werden, um Trockentoleranzmerkmale zu erzeugen.

Einleitung

Die Verfügbarkeit von Wasser für die Bewässerung ist in weiten Teilen der Vereinigten Staaten und weltweit seit Jahrzehnten ein Problem, aber die Erforschung der Reaktion auf Dürrestress, zusammen mit anderen abiotischen Stressfaktoren, ist der Arbeit in den Bereichen Krankheits- und Insektenresistenz auf industrieller, akademischer und staatlicher Ebene weitgehend aufgrund mangelnder Finanzierung hinterherhinkt. Die Verfügbarkeit von Wasser für die Landwirtschaft war auf der Ebene der politischen Entscheidungsträger in der Vergangenheit nur ein nachträglicher Gedanke. In jüngster Zeit ist aufgrund mehrerer schwerer Dürren in wichtigen landwirtschaftlichen Produktionsregionen sowohl in den Vereinigten Staaten als auch in Australien^1,2 die Verfügbarkeit von Süßwasser sowohl auf nationaler als auch auf internationaler Ebene ins Rampenlicht gerückt, was dazu führte, dass viel mehr Ressourcen in die Forschung zur Entwicklung trockenheitstoleranter Sorten der wichtigsten Getreidekulturen gerichtet wurden. Diese Verschiebung des Schwerpunkts hin zur Entwicklung dürretoleranter Hauptkulturen ist zwar von Vorteil, aber wie in vielen Bereichen der Pflanzenforschung sind Spezialkulturen weitgehend auf der Strecke geblieben.

Eine schwere Dürre schränkt derzeit die Gemüseproduktion in Kalifornien ein, dem größten Anbaugebiet für Salat (Lactuca sativa L.) in den Vereinigten Staaten³. Diese kurzfristigen Wettermuster in Verbindung mit gesetzgeberischen und gerichtlichen Maßnahmen sowie der langfristige Klimawandel^4,5 haben dazu geführt, dass in vielen der produktivsten Regionen Kaliforniens weniger Wasser für die Landwirtschaft zur Verfügung steht. Die Salatproduktion in Kalifornien stellt eine 1,5-Milliarden-Dollar-Industrie dar, die fast 80 % der Salatproduktion in den Vereinigten Staaten ausmacht³. Blattgemüse hat einen hohen Wassergehalt der Blätter, und insbesondere Salat hat ein flaches Wurzelsystem^6,7, das die Pflanze anfällig für Wasserstress macht. Wie bei allen Kulturen wird auch bei Salat die Entwicklung trockenheitstoleranter Sorten immer wichtiger, da die Frischwasserversorgung für die Bewässerung immer enger wird⁸.

Dieses Protokoll legt eine Methode dar, mit der ein erstes Screening an einer großen Sammlung von Salatkeimplasma durchgeführt wurde, um einen Pool von potenziell dürretoleranten Kandidatenlinien für die Verwendung in physiologischen, molekularen und genetischen Studien zur Identifizierung spezifischer Trockenheitstoleranzmerkmale zu identifizieren. Diese Kandidaten können auch direkt als Quellen für Trockentoleranz in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um die Wassernutzungseffizienz in kommerziellen Sorten zu verbessern. Dieses Protokoll wurde speziell entwickelt, um die Herausforderungen zu bewältigen, die sich im Rahmen eines Screenings einer umfangreichen Keimplasmasammlung ergeben, insbesondere Fragen der Platzverfügbarkeit und des Arbeitsaufwands. Außerdem wurde das Protokoll, wie es vorgestellt wurde, für die Verwendung in Salat entwickelt, wurde aber erfolgreich für die Verwendung beim Screening einer Keimplasmasammlung von Spinat (Spinacia oleracea) auf potenzielle Trockenheitstoleranz angepasst und könnte einfach modifiziert werden, um jede Blattgemüsepflanze zu screenen.

Eine wichtige Überlegung vor der Initiierung eines Dürretoleranz-Screenings ist zu verstehen, was diese Methode ist und was nicht. Dieses Protokoll soll eine schnelle Methode darstellen, mit der ein großer Keimplasmapool schnell und effizient auf eine überschaubare Anzahl von Keimplasmakandidaten eingegrenzt werden kann, um sie in gezielteren und gründlicheren Studien zur Identifizierung individueller Toleranzmerkmale zu verwenden. Dieses Protokoll setzt die Pflanzen einem schnell induzierten starken Wasserstress aus, im Gegensatz zu einem natürlicheren, langsam induzierten moderaten Dauertrockenstress, der unter Feldbedingungen zu beobachten wäre. Die Art der Reaktion, die in der Pflanze während dieser beiden Arten von Wasserstressereignissen (schnelle Dehydrierung versus natürliche Trockenheit) induziert wird, ist nicht identisch⁹, was dazu führen könnte, dass einige Materialien von zukünftigen Versuchen ausgeschlossen werden. Diese beiden Stressereignisse sind jedoch nicht ohne Überschneidungen¹⁰ und dieses Protokoll sollte als wirksamer Weg dienen, um potenziell dürretolerantes Keimplasma zu identifizieren, das in einer großen Sammlung enthalten ist. Dieses Protokoll allein sollte nicht als ausreichend angesehen werden, um mit hoher Sicherheit Keimplasma zu identifizieren, das eine dauerhafte Trockenheitstoleranz unter Wasserstressbedingungen auf dem Feld aufweist, aber es stellt einen bedeutenden Fortschritt beim schnellen Screening von grünem Blattgemüse auf potenzielle Trockentoleranzmerkmale dar.

Protokoll

1. Das Einpflanzen

1. Füllen Steckfächer (128 Zelle; 28 x 54 cm mit Zellen 3 cm im Quadrat und 5 cm tief) mit Stecker Erde-Mischung. Um eine gleichmäßige Befüllung der Zellen helfen komprimieren Boden in jedes Fach mit einem leeren Steckfach.
2. Pflanzensalatsaatgut ¼ Zoll in der Tiefe 2-3 Samen pro Zelle. Pflanzen alle experimentellen Linien in replizierten Tabletts, um sowohl eine Dürre gestresst und Steuersatz für die Dürre-Studie.
3. Zeigen Steckfächer in eine Bodenwanne ohne Löcher.
4. Wasser-Schalen und Deckel mit umgekehrten Schale oder Plastikhaube. Die Keimung erfolgt in der Regel in 48 bis 72 Stunden. Nach der Keimung nehmen Sie den Deckel und ziehen Tabletts in Gewächshaus.
   Hinweis: Dieses Protokoll kann auch in Klimakammern durchgeführt werden.

2. Wachstum und Pflanzenpflege

1. Wasserschalen je nach Bedarf 1 bis 4 Wochen nach der Keimung, normalerweise ist 2-3 mal pro Woche, indem untere Fach und so Boden zu gesättigten (~ 1 h) Strahlen geworden, um für längere Zeit zu sitzens in Wasser, da dies negative Auswirkungen auf die Pflanzengesundheit und die Wurzelentwicklung und kann die Trockenheit Bildschirm auswirken.
2. Befruchten Schalen einmal wöchentlich mit einem kommerziellen löslichen 20-20-20 Düngemittel mit einer Rate von 1,5 TL / gal gemischt.
3. Dünne Tabletts auf eine Pflanze pro Zelle 1-2 Wochen nach der Keimung.

3. Initiieren Trockenstress-

1. Wenn die Pflanzen vier Wochen alten separaten Kabelpritschen in 2 Gruppen. Vorbehaltlich einer Gruppe in hohem Wasserstress. Verwenden Sie die anderen Fächer sowie bewässert Kontrollen. Gießen Sie die Kontrollgruppe, wie in Schritt 2.1 während des gesamten Versuchs. Bei der Einleitung der Trockenstress suspend Düngen Sie alle Fächer für den Rest des Experiments.
2. Die experimentelle Dürreperiode erfolgt über eine Woche. Auf der ersten Tag des Trockenstress-Studie (Tag 0) fuellen unteren Böden mit Wasser und lassen Sie den Boden in den Steckfächer, sich vollständig gesättigt, dann lassen Sie das Wasser aus Trays. Tränken des Bodens unmittelbar vor der Einleitung der ter Stressperiode wird dazu beitragen, eine Variation der Bodenfeuchte zwischen einzelnen Zellen in den Steckfächer zu minimieren.

4. Durchführung der Grundtrockenstress-Bildschirm mit zu messenden Parameter

Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben, wie die drei physiologische Messungen, die im Laufe der Dürre Bildschirm aufgezeichnet werden, während Tabelle 1 gibt einen Zeitplan der durchgeführten Messungen an jedem Tag der Dürre-Stress-Testzeitraum zu sammeln.

1. Messen Sie das Blatt Relative Wassergehalt (RWC) an den Tagen 0, 2, 4 der Studie.
   1. Clip eine Salatpflanze aus dem Fach, und entfernen Sie 2 Blätter.
   2. Lochen 3 Scheiben von jedem Blatt mit einem # 9 Korkbohrer (~ 1,6 cm Durchmesser). Kombinieren Blatt Schläge als eine Probe.
   3. Wiegen Sie die Blattscheiben, das ist das Frischgewicht (FW) Wert für das RWC Berechnung verwendet, und legen Sie die Scheiben in einer Petrischale.
   4. Fügen Sie gerade genug destilliertes Wasser auf die Platte, um alleow alle Blattscheiben zu schweben. Dies ist auf die Blattscheiben vollständig hydratisieren turgid Gewichte für RWC Analyse zu sammeln. Ermöglichen, dass die Blattscheiben für 24 h bei RT schweben.
   5. Entfernen Sie die nun vollständig hydratisiert Blattscheiben von den Platten und vorsichtig das Äußere der Blattscheiben mit Papiertüchern trocknen vor dem Wiegen die Scheiben. Notieren Sie diese Gewichte als prall Gewicht (TW) für das RWC Berechnung.
   6. Ort Blattscheiben auf einem Papiertuch oder Laborfilterpapier-Rondelle in eine offene Petrischale und trocken im Brutschrank bei 55 ° C für 24 Stunden.
      ANMERKUNG: Das Papier verhindert, daß die Blattscheiben von während des Trocknens auf die Petrischale anhaften.
   7. Wiegen trockene Blattscheiben und Aufzeichnung als Trockengewicht (DW) für RWC Berechnung.
   8. Berechnen RWC mit Weatherley-Formel, wie Smart und Bingham ^11,12 beschrieben.
      RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
      FW = Frischgewicht, TW = prall Gewicht, DW = Trockengewicht
   9. Wiederholen Sie Schritt 4.1 für jede Keimplasma und Behandlung in der Studie.
2. Notieren Sie die Anlage willst einmal täglich Beginn an Tag 1 des Trockenstress-Studie und endet, wenn 100% der Pflanzen sind verwelkt, normalerweise Tag 4 oder 5.
3. Erholungsphase und Wachstumsdifferenz
   1. An Tag 6 Abschluss der Dürre-Stress-Periode und die gestressten Pflanzen geben Sie die Erholungsphase der Studie. Füllen Sie die unteren Böden mit Wasser und lassen Sie die Dürre spannten Fächer für 24 Stunden einweichen vor dem Fortsetzen des Standardbewässerungsplan, Schritt 2.1, wie die Kontrollschalen.
   2. Lassen Sie alle Pflanzen um 10 Tage zu erholen.
   3. Bei 10 Tage nach der Dürre-Stress zu ernten die gesamte oberirdische Teil jeder Anlage und notieren Sie die Frischgewicht.

Ergebnisse

Bei der Durchführung einer großen Bildschirm, um eine Bevölkerung durch die gewünschte experimentelle Merkmal zu trennen, im Falle dieses Protokolls Dürre-Stress-Reaktion, die erzeugt werden, entsprechend von sehr variiert werden Daten betonen anfällig für wahrscheinlich trockentoleranten und alle Punkte dazwischen. Abbildung 1 enthält Graphen, die die Art der Ergebnisse, die von diesem Protokoll erwartet werden kann. Vertreter von drei verschiedenen Sorten Salat-Typen (romaine (cos), crisphead und Butt...

Diskussion

Überlegungen der Probennummer für Bildschirm.

Die Anzahl der Proben erforderlich ist von der gewünschten Verwendung der Daten aus diesem Bildschirm erfolgen. Bei Veröffentlichung hochwertige Ergebnisse gewünscht werden, wird empfohlen, 3 Einzelanlagen (3 biologischen Replikaten) aus jeder Zeile zu ernten, und führen Sie ein Minimum 2 Experimentwiederholungen angemessene Punkte für Qualität der statistischen Analyse zu geben. Wenn das gewünschte Ergebnis ist einfach, schnell ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Steckdosenschublade 128	T.O. Plastics Hummert International	11-8595-1	Die Steckdoseneinschubkassette jeder Marke funktioniert, aber verwenden Sie für alle Versuche die gleiche Art von Steckdosen.
unteres Tablett (Display-Tablett)	T.O. Plastics Hummert International	11-3305-1
Steck-/Pflanzmischung (Sunshine Mix #5)	Sunshine Hummert International	10-0467-1	muss eine andere Mischung ersetzt werden, wenn dieses Protokoll an eine andere Kultur angepasst wird. Sunshine Mix #4 wurde in Spinatversuchen verwendet.
Dünger (20-20-20)	Jack's: Professioneller wasserlöslicher Dünger Hummert International	07-5915-1	Jeder Dünger kann verwendet werden, passen Sie den Typ nach Bedarf an, um dieses Protokoll an die spezifischen Pflanzenbedürfnisse anzupassen.