Manipulation und In-vitro- Ausbau der Xenopus laevis Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Summary

Wir beschreiben Methoden zur Manipulation unreifer Eizellen von Xenopus laevis, zur In-vitro-Reifung von Eizellen zu Eizellen und zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Dieses Protokoll ermöglicht den Abbau einiger mütterlicher Proteine und die Überexpression von Genen von Interesse während der Befruchtung und ist daher wertvoll, um die Rolle spezifischer Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Abstract

Amphibieneier wurden häufig verwendet, um die Embryonalentwicklung zu untersuchen. Die frühe Embryonalentwicklung wird durch maternal gespeicherte Faktoren angetrieben, die sich während der Oogenese ansammeln. Um die Rolle solcher mütterlichen Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen, ist es wünschenswert, ihre Funktionen von Beginn der Embryonalentwicklung an zu manipulieren. Konventionelle Wege der Geninterferenz werden durch die Injektion von Antisense-Oligonukleotiden (Oligos) oder mRNA in befruchtete Eizellen erreicht, die eine Unter- bzw. Überexpression spezifischer Proteine ermöglichen. Diese Methoden benötigen jedoch in der Regel mehr als mehrere Stunden, bis die Proteinexpression beeinflusst ist, so dass die Interferenz der Genfunktionen in den frühen Embryonalstadien nicht wirksam ist. Hier stellen wir ein experimentelles System vor, in dem die Expressionsniveaus von maternalen Proteinen vor der Befruchtung verändert werden können. Xenopus laevis Eizellen, die aus Eierstöcken gewonnen werden, werden durch Inkubation mit Enzymen defollikuliert. Antisense-Oligos oder mRNAs werden im Stadium des Keimvesikels (GV) in defollikulierte Eizellen injiziert. Diese Eizellen werden in vitro im Metaphase-II-Stadium (MII) zu Eizellen gereift, gefolgt von einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI). Auf diese Weise können bis zu 10% der ICSI-Embryonen das schwimmende Kaulquappenstadium erreichen, was funktionelle Tests für spezifische Gen-Knockdowns oder Überexpression ermöglicht. Dieser Ansatz kann ein nützlicher Weg sein, um die Rolle maternal gespeicherter Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Introduction

Xenopus laevis ist eine weit verbreitete, leistungsfähige Modellorganismus, um die Entwicklung ¹ zu untersuchen. Dies liegt daran, Xenopus Eiern ungewöhnlich groß sind (ungefähr 1,2-1,4 mm, im Vergleich zu Säugetier-Gegenstücke etwa 0,1 mm) und reichlich vorhanden. Eier enthalten mütterlich synthetisiert und gespeichert Komponenten, die genug, um die embryonale Entwicklung bis Mitte Blastula Übergang fahren sind (MBT, in der Phase 8-8,5 auftretenden mit 4.000-8.000 Zellen). MBT wird durch zygotischen Genom-Aktivierung, die dann produziert embryonalen Genprodukten Weiterentwicklung direkt verbunden.

Zahlreiche Studien zielte darauf ab, mütterliche Faktoren wichtig für die Entwicklung zu identifizieren. Viele Untersuchungen beruhen auf der Injektion von Antisense-Oligonukleotide (Oligos) mit Morpholino-Oligonukleotide in befruchtete Embryonen, wobei Abbau der mütterlichen Proteine ​​können im Gastrula-Stadium ^2-4 einzuhalten. Alternativ werden mRNAs befruchteten em injiziertbryonen um Genfunktionen zu stören oder zu Schicksale überexprimiert Proteine ​​zu verfolgen. Jedoch ist die Injektion in die Ein-Zell Embryonen normalerweise nicht beeinflusst Expressionsniveaus von mütterlichen Proteine ​​bei den sehr frühen embryonalen Stadien vor MBT.

Heasman und Wylie gründete die Host-Übertragungsverfahren, um dieses Problem zu überwinden, ^5. In ihrer Methode werden manuell defollikuliert Oozyten, die mit Antisense-Oligos injiziert und in Wirts Weibchen ⁶ übertragen. Proteine ​​werden vor der Befruchtung herunterreguliert, so dass die Rollen von regulierte Proteine ​​in frühen embryonalen Entwicklung untersucht werden können. Das mütterliche Abreicherungsverfahren führte zur Identifizierung von mehreren einzigartigen Entwicklungsrollen mütterlicher Proteine, wie in ⁷ überprüft.

In diesem Bericht werden wir ausführlich unsere neu entwickelte Methode, bei der mütterliche Erschöpfung oder Überexpression von mRNA vor der Befruchtung wird ohne manuelle defolliculation und Host-Übertragungs erreicht8. Hand defolliculation erfordert viel Zeit und Host-Übertragungs braucht oft geschickte Techniken und die spezifische Lizenz für Tierchirurgie, wodurch die häufige Verwendung von mütterlichem Erschöpfung Verfahren behindern. Defolliculation und Host-Übertragungs durch enzymatische defolliculation ^9,10 und intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) ^{von 11 bis 13} ersetzt sind. ICSI, Eier wurde ursprünglich zur transgenen Fröschen ¹² zu produzieren. Sperma und embryonalen Kerne wurden in in vitro gereiften Eizellen Amphibien ^11,14,15 transplantiert. Hier zeigen wir unsere Schritt-für-Schritt-Methode, um Spermien in vitro gereiften Eizellen, die waren zu injizieren mit Antisense-Oligos oder pre-mRNA injiziert.

Protocol

HINWEIS: Bei allen Experimenten mit Fröschen wurde folgenden Anforderungen des britischen Innenministeriums durchgeführt.

1. Herstellung von Xenopus laevis-Oozyten

1. Etwa eine Woche vor der Eizellenentnahme, injizieren weiblichen Frösche mit 150 U von Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) für Pre-Priming unter Verwendung von 1 ml sterile Spritze mit einer 27 G-Nadel. Die Injektion erfolgt subkutan in Rücken Lymphsack getan.
   HINWEIS: Es ist optimal, um Frösche, die keine Eier haben für eine lange Zeit (zumindest mehr als die Hälfte Jahr) oder die nie gelegt Eier zuvor.
2. Shop vorgrundierte Frösche in einem Wasserbehälter bei 18 ° C im Licht gesteuert Raum aufgestellt (von 7.00 bis 19.00 Uhr: auf, von 19.00 Uhr bis 07.00 Uhr: aus).
3. Am Tag der Eizellenentnahme, Vorbereitung 1 l 1x Geändert Barths Lösung (MBS) von 10x MBS Lager durch Verdünnen mit doppelt destilliertem Wasser (ddH ₂ O), und fügen Sie Penicillin und Streptomycin in einer Endkonzentration von 10 ug / mljeweils (MBS + PS). 10x MBS Lager besteht aus 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 24 mM NaHCO _3, 8,2 mM MgSO ₄ · 7H ₂ O, 3,3 mM Ca (NO _{3) 2} · 4H ₂ O, 4,1 mM CaCl ₂ · 6H ₂ O, 100 mM HEPES, pH 7,5.
4. Anesthetize eine vorgrundierte Frosch durch subkutane Injektion von 120 mg (in 400 ul) Tricaine methansulfonat (MS222). Halten Sie das eingespritzte Frosch in einem kleinen Tank mit Wasser.
5. Nach 10 Minuten, überprüfen Sie den narkotisierten Frosch, indem Sie sie über sich seitdem erfolgreich narkotisierten Frösche nicht darauf reagieren. Wenn Anästhesie ist unvollständig, fügen Eis in den Behälter und warten Sie weitere 10 min.
6. Nehmen Sie den Frosch aus dem kleinen Tank und in Rückenlage auf einem feuchten Wischtuch.
7. Mit einer Pinzette und eine kleine chirurgische Scheren, halten Sie die Haut und machen einen kleinen Schnitt (2 cm) im unteren Teil des Bauches, lateral der Mittellinie. Machen Sie eine weitere Schnitt auf der anderen Seite.
8. Nach dem Schneiden der Haut, heben Sie die Muskelschicht with Pinzette und machen den Schnitt in der Muskelschicht.
9. Achten Sie auf die Eierstöcke nach der Muskelschicht wird geschnitten und ziehen Sie den Eierstock aus der Einschnitte mit einer Pinzette.
10. Über extrahiert Eierstock zu einer 50 ml Tube mit MBS-Lösung.
    HINWEIS: Versuchen Sie, so viel wie möglich von Eierstock beiden Einschnitte zu sammeln.
11. Schlachten die weibliche Frosch durch Ausbluten, gefolgt von Einfrieren für spätere Entsorgung.
12. MBS + PS Spülen Sie die extrahierten Fruchtknoten ein paar Mal, bis das Blut abgewaschen. Dann überweisen Sie den Eierstock zu einer 9 cm Petrischale mit MBS + PS
    HINWEIS: Überprüfen Sie die Qualität der Oozyten unter einem Binokular an dieser Stelle. Wenn Eizellen sind offenbar schlechte Qualität, wie Oozyten mit ungleichmäßiger Pigmentierung im Tier Hälfte (1A), nicht weiter zu verarbeiten müssen und eine neue Eierstock statt zu erhalten. Im Idealfall sollte Oozyten gleichermaßen pigmentierten Tierhälften haben und etwa gleich große.
13. Necken Sie den Eierstock in kleine Stücke(1-2 cm ²⁾ und sammeln Sie 5 ml von Eizellen in einem neuen 50-ml-Tube.
14. MBS + PS Spülen 5 ml der zerrissenen Eierstock ein paar Mal und fügen MBS + PS bis 15 ml.
15. In 7 Einheiten des Enzyms für defolliculation zum Eierstock-Suspension (siehe Materialliste).
    HINWEIS: Rekonstituieren Sie lyophilisierte Enzym mit 10 ml ddH ₂ O (28 Einheiten / ml). Stellen Sie die Durchstechflasche für 30 Minuten auf Eis unter gelegentlichem leichtem Schwenken. Aliquoten 250 ul und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
16. Inkubieren Sie den Eierstock Stück mit dem Enzym für 1 Stunde unter leichtem Schütteln auf dem Schüttler (Geschwindigkeit bei 15 REV / min, das entspricht etwa 0.014 · g).
    HINWEIS: Für eine nahezu vollständige Entfernung von Follikelzellen, 2 h bis 2 h 15 min Inkubation mit dem Enzym normalerweise nicht erforderlich. Längere Inkubationszeiten für Eizelle Kerntransfer Experiment ¹⁶ benötigt.
17. Nach 1 Stunde Inkubation, nehmen Sie eine kleine Anzahl von behandelten Oozyten (Eizellen 10-20) und in ein 6 cm Petrischale mit MBS + PS Überprüfen Sie die extent defolliculation unter einem Binokular. Wenn Oozyten sind voneinander getrennt und zumindest teilweise defollikuliert (1B), unmittelbar an der nächsten Haltestelle Reaktion (Schritt 18) fort. Wenn Eizellen noch stark von Follikelzellen umgeben, Inkubation für eine zusätzliche 15 Minuten bei maximal.
18. Viel MBS + PS hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie den Wasch für das 10-fache.
    HINWEIS: In MBS + PS durch Gießen an der Wand eines 50 ml-Röhrchen, aber nicht direkt an Oozyten. Nach Aussetzung der MBS + PS, neigen kleine unreife Eizellen, an der Spitze der Waschpuffer schweben und entsorgen wie kleine schwebende Oozyten.
19. Nach dem Waschen, Transfer in ein 9 cm Petrischale mit MBS + PS
    HINWEIS: Von dieser Schritt vorwärts, halten Eizellen bei 16-18 ° C so weit wie möglich. Dies kann durch Halten des Oozyten enthaltenden Schale auf einem temperaturgesteuerten Stufe erfolgen.
20. Wählen Stufe VI Oozyten nach Dumont Klassifikationfür die nachfolgende Verwendung und Übertragung auf einen neuen 9-cm-Petrischale gegeben, MBS + PS Oocyte Übertragung kann durch die Verwendung einer Glaspipette mit einer geeigneten Spitzengröße (größer als die Oozyte Größe) ausgeführt werden.
    HINWEIS: Gute Qualität Oozyten sollte eine gleichmäßig pigmentierte Tierhalbkugel mit klaren Kontrast zwischen dem Tier Hemisphäre und der pflanzlichen Hemisphäre haben, und etwa gleich dimensioniert sein (Abbildung 1C). Stufe VI Oozyten stellen ausgewachsene Oozyten, die Progesteron reagieren können (Eizelle Durchmesser beträgt etwa 1,2 bis 1,4 mm).

2. Injektion Antisense-Oligonucleotiden oder mRNA in Oozyten

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt sollte bei 16-18 ° C auf einem Mikroskoptisch mit temperaturgeregelten Umlaufwasser oder auf einer Kunststoff-Box mit Eis gefüllt ausgestattet erfolgen.

1. Übertragen 200-300 ausgewählt Oozyten in eine neue 9 cm Petrischale mit MBS + PS gefüllt, wobei die Mikroinjektion durchgeführt.
   HINWEIS: each Zustand, 200-300 Eizellen werden normalerweise verwendet. Insgesamt werden ca. 1000 Oozyten in einem Experiment verwendet.
2. Zur Herstellung Injektion von Antisense-Oligos oder mRNA, werfen Sie die Metall-Kolben einer Mikroinjektor.
3. Füllen Sie eine Glaskapillare mit Mineralöl mit Spritze und setzen Sie die Glaskapillare mit Öl auf den Metall-Kolben Mikroinjektor gefüllt.
   ANMERKUNG: Eine Glaskapillare durch Pipettenziehvorrichtung gezogen. Diese Nadeln werden in einer Box ohne Beschädigung Spitzen gehalten.
4. Schneiden Sie die Spitze der Nadel mit kleinen chirurgische Schere unter dem Mikroskop von dem Ziel als Durchmesser Spitze zur Injektion möglichst klein.
   HINWEIS: Die Nadelspitze kann unter Verwendung einer Mikroschmiede oder Mikro beveler geschärft werden. Um die Nadel in einem Winkel von 25 ° abgeschrägt verbessert die Fähigkeit des Eindringens in die Eizelle Wand.
5. Setzen Sie einen kleinen Streifen von Parafilm auf der Bühne von einem Binokular und Ausgeben einer 3 ul Tropfen der Antisense-Oligo oder mRNA-Lösung.
6. Bewegen Sie den tip der Injektionsnadel in den kleinen Tröpfchen der Lösung und füllt die Nadel mit dem zu injizierenden Lösung.
   HINWEIS: Wenn die Spitze der Injektionsnadel zu klein ist, sollten Luftblasen an der Spitze des Metallkolben angezeigt. Dann machen Sie eine größere Spitze an der Injektionsnadel, bis dies nicht der Fall.
7. Markieren Sie die Injektionsnadel ca. 0,5 mm von der Spitze. Diese Markierung wird als Indikator für die Injektionstiefe verwendet.
8. Setzen Sie die Spitze der Nadel in eine Eizelle entlang der Äquatorgrenze durch mit dem Ziel, den Mittelpunkt der Eizelle (unter dem Keimbläschen) unter leichtem Halten der gegenüberliegenden Seite der Eizelle an der Einspritzstelle mit einer Pinzette zur Verhinderung von unerwünschten Eizelle Bewegung während der Injektion .
   HINWEIS: Finden Sie die Fläche frei von Follikelzellen (1B) und führen Sie die Nadel von der Stelle, da selbst eine feine Nadel kann nicht oft eine Schicht von Follikelzellen eindringen.
9. Werfen 4,6 ng / nl 4.6 oder 9.2 ng / nl 9.2 von antisense Oligos, oder einen geeigneten Volumen von mRNA (250 pg bis 13,8 ng) durch mit dem Fußschalter. Einzelheiten der Antisense-Oligo-Herstellung sind in der ⁷ beschrieben.
10. Übertragen Sie die injizierten Oozyten in eine 6 cm Petrischale mit MBS + PS mit 0,1% BSA ergänzt gefüllt (Oocyte Inkubationsmedium, sterilisieren die Lösung mit dem 0,45 um Porenfilter).
11. Die Eizellen Inkubation bei 16 ° C oder 18 ° C für 1-2 Tage.
    HINWEIS: injizierten Oocyten können in-vitro-Reifung mehrere Stunden nach der Injektion unterzogen, in welchem ​​Fall der Injektion von 4,6 ng Antisense-Oligos zu bevorzugen. Eine allgemeine Regel ist, dass je kürzer die Inkubationszeit ist, je größer die nachfolgende Embryonalentwicklung.

3. In-vitro-Maturation (IVM) von Eizellen

1. Am Abend der Eizellreifung Experiment holen Progesteron-Stammlösung (30 mM in Ethanol) von -80 ° C Gefrierschrank und Niederschläge lösen sich bei Raum temtemperatur mit gelegentlichen Wirbel.
   HINWEIS: Der Progesteron Lager ist normalerweise bei Raumtemperatur für 30 min bis 1 h belassen.
2. In 5 ul des Progesteron Lager in 50 ml MBS + PS (Reifungsmedium; die endgültige Konzentration von Progesteron bei 3 uM) und schütteln Sie auf dem Schüttler für 30 Minuten, um Progesteron in der Lösung gleich zu verteilen.
3. Bereiten Agarose-beschichtete 6 cm Schalen für in-vitro-Reifung Behandlung.
   1. 1 g Agarose in 50 ml 1x MBS ohne Magnesium und Calcium.
   2. Agarose aufzulösen durch Erhitzen in der Mikrowelle.
   3. Muß eine geringe Volumen der Agaroselösung bis 6 cm-Schalen, um die Unterseite der Teller abzudecken.
   4. Wartezeit von mindestens 30 Minuten bis zur Verfestigung.
   HINWEIS: Agarose-Beschichtung verhindert Anhaften von Eizellen zu Gerichten. Sobald in vitro gereiften Eizellen fest an Geschirr angebracht ist es am wahrscheinlichsten, dass Oozyten werden von den Stimuli aktiviert werden, dass sie beim Ablösen von dis zu empfangenhes.
4. Gießen Sie 5-8 ml Reifung Medium an Agarose-beschichtete Platten und übertragen 200-300 Oozyten in je 6 cm Schalen.
   HINWEIS: Versuchen Sie, Oozyten, die mit einer minimalen Menge von Eizelle Inkubationsmedium übertragen.
5. Inkubieren für 16 Stunden bei 16 ° C.
   HINWEIS: Zum Beispiel beginnen die Behandlung um 5 Uhr und schliessen um 9 Uhr am nächsten Tag.

4. Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)

1. Gefrorenes Sperma Stoffaufbereitung
   HINWEIS: Die folgenden Spermienvorbereitung vor dem Beginn der Eizellreifung Experiment durchgeführt werden, und Gefriersperma Aktien werden bei -80 ° C für ICSI gehalten.
   1. Sammeln Sie die Hoden eines männlichen Frosch durch folgende Schritte 1.4 bis 1.11, außer für das Ziehen Fett und Hoden aus der Einschnitte mit einer Pinzette und entfernen Hoden aus dem Fett.
   2. In 1x Marc modifiziertem Ringers (MMR, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO _4, 2 mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH 7,4) waschen Hoden.
   3. Entfernen Sie Fett eind Blutgefäße durch Walzen der gewaschenen Hoden auf eine saubere, Tissue-Papier, und dann durch die Beseitigung der verbleibenden Blutgefäße mit einer Pinzette.
   4. Platzieren jeder Hodens in einer 3,5-cm-Petrischale gegeben, die 1 ml 1x MMR.
   5. Schneiden in Längsrichtung mit einer feinen Schere und reißen in kleine Stücke mit einer Pinzette, bis keine großen Stücke bleiben.
   6. Pipette nach oben und unten unter Verwendung von 1 ml-Kunststoffspitze, deren Ende abgeschnitten, und die Last 1 ml des zerkleinerten testis Lösung in einen Glashomogenisator.
   7. Homogenisieren ihnen von 2-3 Schlägen und dann gießen Sie die Lösung auf eine 50 um Porenfilter auf der Spitze eines 15 ml-Zentrifugenröhrchen befestigt. Lassen Sie die Lösung durch den Filter gehen.
   8. Wiederholen Sie Schritt 4.1.7 durch Resuspendieren des Restschnitt Testis in 1 ml 1x MMR. Schließlich, waschen Sie den Homogenisator ein paar Mal mit 1x MMR und geben es durch den Filter.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.5 für die anderen Hoden und Schwimmbad zwei Hoden in eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen 4.1.8.
   10. Drehen Sie die Zellen bei 800 × g bei 46; C für 20 min.
   11. Überstand verwerfen und Resuspendieren der pelletierten Zellen in 2 ml 1x MMR. Übertragen Sie dann in ein neues Röhrchen.
       HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keine sichtbaren Blutzellen vorhanden sind.
   12. Bereiten Sie einen Stufengradienten in einem 14 ml ultra-klare Zentrifugenröhrchen. Gegenzug: 4 ml 30% Iodixanol. Zweite untere Schicht: 1 ml 20% Iodixanol. Drittes Unterschicht: 5 ml 12% Iodixanol. Deckschicht: Hoden-Zellen in 2 ml 1x MMR. Überlagern die Gradienten sehr vorsichtig mit einem 1 ml Pipettenspitze (überlagern sich langsam nicht die Bodenphase zu stören).
       HINWEIS: Nur eine Schicht von 30% Iodixanol sollte auch zur Isolierung nur Spermien zu arbeiten.
   13. Spin in SW40 Rotor mit Ultrazentrifuge bei 10.000 × g bei 4 ° C für 15 Minuten (Verzögerung ohne Pause).
   14. Entfernen Sie vorsichtig das Rohr von der Ultrazentrifuge. Bestätigen einer Grenzfläche zwischen jeder Schicht des Gradienten und das Pellet an der Unterseite.
   15. Sammeln Sie die Spermienfraktion aus dem Pellet.
   16. Resuspendieren der Spermien pellassen Sie in 1x MMR für Auswaschen Iodixanol. Spin bei 800 × g bei 4 ° C für 20 min.
       HINWEIS: Wenn viel Sperma noch in der Suspension verbleiben nach dem Spin, Re-Spin der Überstand bei 3220 × g bei 4 ° C für 20 min und bündeln die pelle Spermien.
   17. Überstand verwerfen und resuspendieren Spermienpellet in 1 ml 1x Nuclear Vorbereitung Buffer (NPB; 250 mM Saccharose, 0,5 mM Spermidin Trihydrochlorid, 0,2 mM Spermin Tetrahydrochlorid, 1 mM EDTA, 15 mM HEPES, pH 7,7) ^13. Übertragen Sie dann in ein Eppendorf-Röhrchen.
   18. Zugeben von 50 ul 10 mg / ml Lösung in Digitonin 1x NPB (resuspendieren Digitonin Pulver in DMSO mit 50 mg / ml und gefrier Aliquots bei -80 ° C. Vor Gebrauch verdünnt das 50 mg / ml Aliquots auf 10 mg / ml mit 1x NPB. verwendet 10 mg / ml Digitonin können eingefroren und bei -20 ° C und wiederverwendet), um 1 ml der Spermienlösung gelagert werden.
   19. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
   20. Überprüfen Sie eine Permeabilisierung Rate durch DAPI-Färbung (0,3 ug / ml DAPI als final Konzentration). Wenn weniger als 95% der Zellen durchlässig gemacht werden, Inkubation etwas länger.
       Anmerkung: Manchmal, wenn zu viele Spermien gleichzeitig (insbesondere wenn die Spermien aus verschiedenen Hoden gesammelt) inkubiert, ist es schwierig, zu permeabilisieren, wobei in diesem Fall kann es notwendig sein, eine zusätzliche kleine Menge Digitonin hinzuzufügen; zum Beispiel, wenn 20% der Spermien nicht permeabilisiert zusätzliche 20 ul Digitonin zugesetzt.
   21. Stoppen Permeabilisierung durch Zugabe von 10% BSA 3% Endkonzentration.
   22. Dreh die Zellen bei 4 ° C.
       HINWEIS: Versuchen Sie, so wenig Zentrifugationsgeschwindigkeit wie möglich, indem Sie mit 100 xg für 5 min. Wenn nicht ausreichend ist, erhöhen die Geschwindigkeit und / oder Zeit.
   23. Die Zellen werden mit 0,3% BSA in 1x NPB und zentrifugieren mit der gleichen Geschwindigkeit wie in Schritt 4.1.22. Inzwischen bereiten die Samenlagerungspuffer (SSB; 2 ml 2x NPB, 120 ul 10% BSA, 1,2 ml autoklaviert Glycerol, 680 & mgr; l H ₂ O).
   24. Fügen Sie 500 ul der SSB auf die Spermienpelletieren. Mehrmals Pipette auf und ab, um mit einem Schnitt Spitze, um nicht die Zellen schädigen resuspendieren.
   25. Während einer Nacht bei 4 ° C stehen gelassen.
   26. Pipettieren Sie die Zellen nach oben und unten mehrmals mit einem cut Spitze.
   27. Verdünnen Sie ein paar Mikroliter 10-mal in 1x MMR oder in 1x PBS, um die Zellen mit Zählkammer zählen.
   28. Frieren Sie als Aliquots bei 30.000 Spermien / ul (oder höher), die direkt bei -80 ° C und bei -80 ° C in einem einzigen Aliquots.
2. ICSI in vitro gereiften Eizellen
   HINWEIS: Alle Prozesse, die Eizellen sollte bei 16-18 ° C durchgeführt werden.
   1. Bereiten Sie eine Glaspipette für die Übertragung von gereiften Eizellen.
      HINWEIS: Die Glaspipette muss breit genug, um Eizellen ohne zu quetschen zubringen.
   2. Sechzehn Stunden nach dem Umzug Eizellen an den Progesteronhaltigen Medium, Übertragung gereiften Eizellen in eine 6 cm Agarose-beschichtete Schale mit MBS + PS zum Waschen gefüllt.
      Hinweis: Es ist wichtig, merfallene Obligationen Eizellen müssen äußerst vorsichtig behandelt werden. Grobe Behandlung von Oozyten kann spontane Aktivierung vor Spermieninjektion zu induzieren.
   3. Graf gereiften Eizellen durch die Bestätigung des Auftreten von weißen Flecken, die das Keimbläschen Aufteilung (Abbildung 2) impliziert. Wenn die Reifungsrate weniger als 80% beträgt, ist es unwahrscheinlich, dass die ausreichend Zahl der überlebenden Embryonen für weitere Analysen zu erhalten.
      HINWEIS: Verbleibende Follikel Zellen werden nach der Eizellreifung geschält (Abbildung 2).
   4. Über Oozyten von MBS Waschen auf einen neuen Agarose-beschichtete 6 cm Schale mit Injektionsmittel gefüllt (Bereiten Sie 500 ml: 30 g Ficoll (6%), 20 ml 10x MMR und 500 ul 1,000x PS Lager).
   5. Für mindestens 30 min vor Beginn ICSI inkubieren.
   6. Richten Sie die Mikroinjektor wie in Schritten von 2,2 bis 2,4 beschrieben.
      HINWEIS: Die Düsengröße der Injektionsnadel wird durch Befolgen des in Schritt 2.6 beschriebenen Verfahren so gering wie möglich gehalten wird. Der Durchmesserder Nadel 20-40 um. Um Fase die Nadelspitze, wie in Schritt 2.4 beschrieben könnten effiziente Injektion zu ermöglichen.
   7. Fetch das Sperma aliquoten und verdünnt das Spermiensuspension in Verdünnungspuffer Sperm (SDB; 250 mM Saccharose, 75 mM KCl, 0,5 mM Spermidin, 0,2 mM Spermin, 200 uM HEPES pH 7,5).
      HINWEIS: Die Verdünnung kann in Abhängigkeit von einer Nadel und so weiter variiert werden. Verdünnen Sie 120-mal der 30.000 Spermien / ul Lager als ersten Versuch und bei Bedarf weiter anpassen.
   8. Setzen Sie einen kleinen Streifen von Parafilm auf der Bühne von einem Binokular. Mischen Sie Spermieninjektion Lösung durch Pipettieren und verzichten einige ul Tropfen der Samenlösung.
   9. Saugen verdünnt Spermiensuspension in die Nadel injizieren 4,6 nl in 10 aufeinanderfolgenden Tropfen, die 0,3 & mgr; g / ml DAPI auf einem Objektträger, und schnell zählen die Anzahl der Spermien pro Injektion auf einem Fluoreszenzmikroskop geliefert.
      HINWEIS: Richten Sie 1-2 Spermien pro Injektion. Bei Bedarf verdünnen Spermieninjektion Lösung mehrund überprüfen Sie die Anzahl der Spermien pro Injektion wieder bis zum Erreichen einer gewünschten Konzentration.
   10. Werfen Sie die Test-Injektionslösung und füllen Sie eine neue Spermieninjektion Lösung mit einer geeigneten Konzentration.
   11. Spritzen Sie 4,6 nl Spermien Lösung auf 100 gereiften Eizellen.
       HINWEIS: Es ist wichtig, kontinuierlich Injizieren Sie die Lösung. Bestimmen Sie zuerst die Zeit zum Auswerfen 4.6 nl (in der Regel 1-2 sec) erforderlich. Wiederholen Sie den folgenden Prozess; spritzen in eine Eizelle, warten Sie ein paar Sekunden, entfernen Sie eine Nadel und Mock-Injektion in Injektionslösung, warten Sie ein paar Sekunden, spritzen in eine Eizelle. Dieses kontinuierliche Injektion verhindert auch Blockierung der Nadelspitze. Alternativ kann das Verfahren unter Verwendung einer Pumpe ¹³ verwendet werden.
   12. Nach ca. 100 Injektionen, werfen Sie die verbleibenden Spermien-Lösung und erneut füllen die Spermien-Lösung (die gleiche Spermien Lösung, aber Pipette auf und ab vor der Ausgabe).
       HINWEIS: Wenn die Nadel nicht gut saugen Sperma Lösung, schneiden Sie die Spitze der Notwendigkeitle. Wenn dies nicht die Situation zu verbessern, bereiten eine neue Nadel.
   13. Wiederholen Sie den Einspritzvorgang, bis alle Eizellen injiziert werden.
       HINWEIS: Wenn die Eizelle Qualität ist gut und die Injektion erfolgreich ist, wird Kontraktion der injizierten Oozyten innerhalb von 20 Minuten der Einspritzzeit zu sehen.
   14. Verschieben Sie die injiziert Gerichte auf 16 ° C oder 18   ° C Inkubator.
   15. 4-5 Stunden nach der Injektion, überprüfen Sie die Spaltungsrate von ICSI-Embryonen.
       HINWEIS: Die Spaltung Furchen dieser Embryonen dürfen nicht so klar wie die des normalen befruchteten Embryonen sein. Einige Embryonen zeigen auch abnorme Spaltungen, die von mehreren Spermieninjektion verursacht werden könnten.
   16. Übertragungs gespalten Embryonen einschließlich abnormal gespalten Embryonen Inkubationsmedium (Bereiten 500 ml: 20 g Ficoll (4%), 5 ml 10x MMR und 500 ul 1,000x PS stock).
   17. Embryonen entweder in 16 inkubieren   ° C oder 18 ° C-Inkubator über Nacht.
   18. Am nächsten Morgen, Transfer embryos bis 0,1 x MMR und zählen lebenden Embryonen.
   19. Im Durchschnitt können etwa 10% der Samenzellen injizierten Oozyten zum Schwimm Kaulquappenstadium (3A) zu entwickeln.

Results

Embryonalentwicklung ICSI-Embryonen unter Verwendung von in vitro gereiften Eizellen wurde (3A) untersucht. Reifungsgeschwindigkeiten von GV-Oozyten, um den MII Stufe sind variabel und hängt weitgehend von der Qualität der Oozyten. In guten Experimente fast 100% der GV-Oozyten reagieren auf Progesteron und zeigen Anzeichen von Eizellreifung, zuletzt als Eier am MII Stadium. Alle gereiften Eizellen wurden ICSI (7 ohne Oligo-injizierten Oozyten 3A, n = 13 für die Steuerung verwürfelten oligo-injizierten Oocyten und n =) unterzogen und etwa 25% der injizierten Eier abgespalten. Etwa 60% oder 80% des gespaltenen Embryonen aus Steuer oligo-injizierten Oozyten oder nicht injizierten Oozyten erzeugt jeweils erreichte die Blastula / Gastrulastadium. Unter den Blastula / Gastrula Embryonen waren von guter Qualität (fast keine Anzeichen von anomaler Spaltung und Apoptose) etwa die Hälfte der Embryonen in Oligo-Proben injiziert, während 82% der Blastula / Gastrula Embryonen waren von guter Qualität in non-injizierten Proben (3A). Schließlich, 41% und 11% der gespaltenen Embryonen in Oligo-injizierten Proben erreichten die Muskelreaktionen und die Schwimm Kaulquappe Stufen eingesetzt werden, wobei 60% und 29% der gespaltenen Embryonen nicht injizierten Proben war (3A). Diese ICSI-Embryonen werden die Mischung aus normalen und abnormalen Embryonen (3B). Einige von ihnen Metamorphose und zu entwickeln, um Frösche ⁸ reifen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Injektion von Antisense-Oligonukleotide in GV-Oozyten, gefolgt von IVM und ICSI, ermöglicht eine effiziente frühen Embryonalentwicklung. Obwohl die Injektion von Antisense-Oligos selbst abnimmt Embryonalentwicklung, sind wir immer noch in der Lage, genug Embryonen für viele experimentelle Zwecke wie etwa die Überprüfung Entwicklungsraten zu erhalten, RT-PCR, Western-Blot und so weiter.

Feige ure 1: Typische Beispiele für Xenopus laevis Oozyten von guter Qualität oder schlechte Qualität für in-vitro-Reifung Experimente. (A) Ein Beispiel für eine schlechte Qualität Oozyten. Beispielsweise werden Oozyten zeigt fleckige Pigmentierung nicht für nachfolgende Experimente verwendet. Jede Xenopus laevis etwa 1,2-1,4 mm im Durchmesser. (B) Ein teilweise defollikuliert Eizelle. Die rechte Hälfte der Eizelle durch Follikelzellen, die durch das Vorhandensein der Blutgefäße erkennen kann abgedeckt. Ein Pfeil zeigt einen Bereich frei von Follikel-Zellen und in der die Injektionsnadel injiziert wird. (C) Ein Beispiel für gute Qualität Oozyten, die gleich große sind und zeigen, gleichmäßig pigmentierte Tierhalbkugeln mit klaren Kontrast zwischen dem Tier Hemisphäre und der pflanzlichen Hemisphäre.

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Abbildung 2:. Xenopus laevis Oozyten vor und nach der Reifung Nach Eizellreifung, an der Spitze der Tierhälften und Follikelzellen erscheinen klare weiße Flecken sind abgezogen. Jede Xenopus laevis Oozyten ist etwa 1 mm im Durchmesser.

Abbildung 3: Entwicklung der ICSI-Embryonen aus in vitro gereiften Eizellen produziert. (A) Entwicklung von ICSI-Embryonen auf jeder Stufe zusammengefasst. Oocyten injiziert mit Steuer verwürfelten Antisense-Oligonukleotide (Oligo Steuereinspritzung) oder ohne Injektion (non-Injektion), gefolgt von IVM und ICSI. Die entsprechende Anzahl von Embryonen in jeder Stufe oberhalb der Balken dargestellt. Mittelwert ± SEM dargestellt. N = 4-13 unabhängigen Experimenten / verschiedene females. (B) Beispiele für überlebende ICSI-Embryonen. Diese Schwanzknospen-Embryonen wurden in einem Experiment, bei dem etwa 200 Oozyten wurden als Ausgangsmaterial verwendet wird produziert.

Discussion

Wir hier ausführlich eine neue Methode, um mütterliche Faktoren zum Abbau oder exogene Faktoren vor der Befruchtung überexprimieren. Dieses System erfordert zwei Mikroinjektionen, sondern überspringt die Operation von Fröschen, in der Host-Übertragungsmethode ^7,17 verwendet. Es ist optimal, um den Frosch Operation Schritt im Hinblick auf die Pflege der Tiere zu entfernen. Darüber hinaus haben wir nicht zu berücksichtigen, für die Qualität der Gast weiblichen Frösche für die Transferexperimente zu nehmen, was bedeutet, dass wir von einem biologischen Faktor, der den Erfolg der Experimente betrifft loszuwerden. Daher in diesem System die Qualität der Eizellen von PMSG grundiert Frösche erhalten ist ein wichtiger Faktor, der biologischen Schlüssel für erfolgreiche Experimente ist. Die Qualität der Eizellen nach der Entnahme der Eierstöcke oder nach defolliculation beurteilt werden. Wenn irgendeine Abnormalität in diesen Phasen beobachtet wird, ist es optimal, einen weiteren Ovar von neuen Frosches sammeln. Ein weiterer Punkt, wenn man die Qualität der Oozyten zu überprüfen, ist nach Eizellreifung. Wenn weniger als 80% der progesteronE-behandelten Oozyten zeigen Anzeichen von Reife, können Sie nicht in der Lage, die genug Anzahl von Embryonen für weitere Analysen zu erhalten. Die Verwendung von enzymatischen defolliculation statt manuell defolliculation ist auch ein weiterer Vorteil der Verwendung dieses Systems, um die Arbeit für defolliculation reduzieren. Jedoch ist es immer noch möglich, dass eine manuelle defolliculation kann eine besser als der enzymatischen Behandlung.

Wie in 3 gezeigt, fast 10% der in vitro gereiften Eizellen können die Schwimm Kaulquappenstadium erreichen. Diese Daten werden aus 13 unabhängigen Experimenten einschließlich der in ⁸ und neue Injektion Versuche berichtet gesammelt. Host-Übertragungsmethode benötigt 75-150 Oozyten in jeder Behandlung zur Gewinnung von aussagekräftigen Daten, da 30-60% der übertragenen Oozyten können die Neurulastadium ¹⁷ zu erreichen. Unsere Methode beginnt normalerweise mit 200-300 Oozyten in jeder Versuchsgruppe seit etwa 40-60% der gespalten Embryonen können die zu erreichenMuskelreaktion Bühne. Diese Daten legen nahe, dass beide Methoden unterstützt eine angemessene Entwicklungsrate. Bisher haben wir erhalten 10 Leben Frösche von Steuer mRNA injiziert und Kontrollantisense-Oligo-injizierten Oozyten mit dieser Technik, was darauf hinweist, dass dieser Ansatz unterstützt die Entwicklung durch Metamorphose.

Unsere Oozyte manipulations ICSI Verfahren bietet die Möglichkeit, die Rolle der mütterliche Faktoren in sehr frühen embryonalen Entwicklung zu testen, kurz nach der Befruchtung. Darüber hinaus kann die Überexpression von Chromatin modifizierenden Faktoren vor der Befruchtung ermöglichen es, mütterlichen Chromatin vor der Befruchtung für das Verständnis für die Entwicklung notwendige mütterliche Chromatinzustände umzugestalten. Diese Strategie kann auch gut mit aktuellen Gen-Editing-Systeme wie TALENs (TALEN) ^18,19 und CRISPR / CAS9 ^20,21 da diese schon vor der Befruchtung ausgedrückt werden zu arbeiten. Daher hat unser neuer Ansatz eine potential, für viele Anwendungen in der Zukunft verwendet werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG)	MSD Animal Health	Vm 01708/4309	PMSG-Intervet 5000iu Pulver und Lösungsmittel zur Herstellung einer Injektionslösung
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz (MS222)	Sigma	A5040	Für die Anästhesie
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	Für die Defollikation von Eizellen. Lagern bei -20  °C.
Drummond Nanoject	Drummond Scientific Company	3-000-205/206	Für Mikroinjektionsglaskapillaren
	Alpha Laboratorien	7" Drummond #3-000-203-G/XL	Für Mikroinjektion
Mikropipettenabzieher	SUTTER Instrument	Modell D-97	Für Mikroinjektionen
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500	Für in vitro Reifung und ICSI
14 ml ultraklares Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter United Kingdom Ltd	344060	Für die Spermienreinigung
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)	Sigma	D1556	Für die Spermienreinigung
Digitonin	Sigma	D141	Reagenz für die Zellpermeabilisierung
Shaker	Hybaid	HB-SHK-1	Für die Eizelldefollikulation
Präpariermikroskop (Stereozoommikroskop)	ZEISS	Semi SV6	Für die Eizellentnahme und Mikroinjektion
50 μ m Porenfilter	CellTrics	04-0042-2317	Für die Spermienreinigung
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100XP	Für die Spermienreinigung
50 ml Zentrifugenröhrchen	Cellstar Greiner Bio-One	227261 oder 210261	Eizellentnahme und Defollikulationsreaktion
15 ml Zentrifugenröhrchen	FALCON	352097	Für die Spermienreinigung
90 mm Petri Gericht	Thermo Scientific	101VR20/C
griffige Zellkulturschale, 60 Zoll x  15 mm	FALCON	353004
Easy-Grip Zellkulturschale, 35 Zoll x  15 mm	FALCON	351008