Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Оценка бактериального вторжения сердечных клеток в культуре и колонизации сердца у инфицированных мышей с использованием листерий моноцитогенов

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

Листерии моноцитогенов вызывает инфекции плода у беременных женщин и менингит в восприимчивых популяциях. Субпопуляции бактерий могут колонизировать сердечную ткань, вызывая миокардит у пациентов и лабораторных животных. Здесь мы представляем протокол, который описывает, как оценить L. monocytogenes сердечной клетки вторжения в пробирке и сердечной колонизации у инфицированных животных.

Abstract

Listeria monocytogenes является грамположительным внутриклеточным патогеном, который способен вызывать серьезные инвазивные инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, пожилых людей и беременных женщин. Наиболее распространенными проявлениями листериоза у людей являются менингит, энцефалит и аборты плода. Значительное, но гораздо менее документально продолжение инвазивных L. monocytogenes инфекции включает в себя сердце. Уровень смертности от сердечно-сосудистых заболеваний может быть до 35%, несмотря на лечение, однако очень мало известно о L. monocytogenes колонизации сердечной ткани и ее результатных патологий. Кроме того, в последнее время стало очевидно, что субпопуляции L. monocytogenes имеют повышенную способность вторгаться и расти в сердечной ткани. Этот протокол подробно описывает в пробирке и in vivo методы, которые могут быть использованы для оценки кардиотропизма Изолятов L. monocytogenes. Представлены методы заражения крысиных миобластов H9c2 в культуре тканей, а также для определения бактериальной колонизации сердец инфицированных мышей. Эти методы полезны не только для выявления штаммов с потенциалом колонизации сердечной ткани у инфицированных животных, но также могут способствовать выявлению бактериальных генных продуктов, которые служат для повышения вторжения сердечной клетки и / или диск изменения в патологии сердца. Эти методы также обеспечивают прямое сравнение кардиотропизма между несколькими штаммами L. monocytogenes.

Introduction

Листерия моноцитогенов является грамположительных внутриклеточных патогенов, способных вызвать тяжелые заболевания в восприимчивых групп населения, в том числе пожилых людей, беременных женщин, людей с ВИЧ / СПИДом, и лиц, получающиххимиотерапию 1. Инфекция в этих популяциях часто является результатом еды загрязненных пищевых продуктов, и большинство инфекций связаны с крупномасштабными вспышкамипищевого происхождения 2,3. У людей и других млекопитающих, L. monocytogenes способен транслокации через эпителианую границу тонкой кишки, после чего транспортируется впечень 4,5. Модели животных предполагают, что попадает бактерий репликации в кишечном вилли и транзита в печень через портал вены или распространяется через мезентериотических лимфатических узлов в кровоток, что приводит к гематогенного распространения в печени иселезенки 6,7. В печени и селезенке бактерия способна опоясыть поглощение как в профессиональные фагоциты, так и в резидентные паренхимальные клетки, и быстро устанавливает инфекции в этих органах. По мере увеличения бактериальной нагрузки, многочисленные бактерии рассредоточены обратно в кровь, где они способны дальнейшей колонизации восприимчивых тканей, включая центральную нервную систему и плаценту (где присутствует). Колонизация этих участков исключает наиболее распространенные проявления листериоза у людей, включая менингит, энцефалит и аборт плода2.

Выбранные субпопуляции L. monocytogenes были недавно показано, что повышенная способность вторгаться и размножаться в сердечной ткани8. Проявления сердечного вмешательства разнообразны, и варьируются от эндокардита и перикардита, до фульминантного миокардита в комплекте снарушениями проводимости 9-13. Общее число случаев сердечного заболевания L. monocytogenes в год является низким, но может быть меньше, так как этот аспект инфекции, как правило, не хорошо признается. Колонизация сердца патогенными микроорганизмами часто требует предрасположенности хозяина, такой как уже существующие клапанные повреждения или искусственные клапаны сердца. Есть, однако, изоляты L. monocytogenes, которые были определены, которые отличаются своей способностью колонизировать сердца инфицированных животных при отсутствии каких-либо сердечных повреждений и / илианомалий 8.

В этом описаны методы in vitro и in vivo для оценки бактериальной колонизации сердечной ткани у инфицированных животных с использованием нашествия анализов в культуре тканей, а также инфекций живых животных. Эти методы оказались полезными не только для выявления штаммов с потенциалом колонизации сердечной ткани у инфицированных животных, но также должны быть полезны для выявления бактериальных генных продуктов, которые служат для повышения вторжения сердечной клетки и / или привести к изменениям в патологии сердца. Эти методы облегчают сравнение кардиотропизма между несколькими штаммами. Для описанных здесь методов L. monocytogenes 10403S используется в качестве хорошо изученного представителя недиотропного штамма, а клинический изолят 07PF0776 используется в качестве репрезентативного примера кардиотропного штамма. Эти два штамма были выбраны для обеспечения сравнения для бактериального вторжения сердечных клеток в пробирке и колонизации сердца инфицированных мышей in vivo. Изолят 07PF0776 является клиническим изолятом, восстановленным после промежуточного абсцесса, который вызвал смертельную аритмию у ВИЧ-инфицированногопациента 8. L. monocytogenes изолирует может варьироваться в их вирулентности потенциал, и, учитывая склонность к Listeria заразить людей с иммуносупрессией и беременных женщин, лица в этих популяциях должны проявлять осторожность при оценке различных клинических изолятов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Условия хранения и культуры для штаммов L. monocytogenes

  1. Подготовь твердые средства путем autoclaving агар вливания мозга-сердца (BHI) и заливки расплавленных средств в плиты Петри. Разрешить пластины высохнуть на ночь при комнатной температуре, а затем снова на ночь при температуре 37 градусов по Цельсию.
  2. Используя стерильную петлю, получить небольшой образец L. monocytogenes либо из ранее сделанных запасов морозильной камеры (бактерии приостановлено в 20% глицерол в жидком смилах BHI, хранящихся при -80 градусов по Цельсию) или от агар пластины, содержащей колонии ранее ударил для изоляции.
  3. Используя асептический метод, полоса образца для одной колонии изоляции. Будьте уверены, чтобы стерилизовать петлю между поперечными полосами, чтобы предотвратить избыток переноски и обеспечить изоляцию отдельных колоний штамма оценивается. Инкубировать пластину (ы) на ночь при 37 градусов по Цельсию.
  4. Используя стерильную петлю, удалите одну колонию изолята и прививки 2 мл бульона BHI (без агара) в 14 мл полистирола трубки.
  5. Для анализов и инфекций, инкубировать бульон культуры статично (без встряхивания) на ночь в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Для чулок культурных изолятов, инкубировать бульон культуры при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 180-200 об / мин на ночь. Культуры могут быть снабжены путем добавления глицерола к окончательной концентрации 20% и хранения запечатанных труб при -80 градусов по Цельсию на неопределенный срок.

2. Хранение и культивирование условий H9c2 сердечной миобласт-как клетки

  1. Покупка или получение замороженных запасов клеток H9c2, а также модифицированного орла Dubelco's Medium (DMEM), содержащего высоко глюкозу и пируват, фетальную сыворотку из крупного рогатого скота (FBS), L-глутамин (Glut) и пенициллин-стрептомицин-глютамин смеси (PSG).  FBS, Glut и PSG должны быть снабжены при -20 градусов по Цельсию, в то время как DMEM может храниться при 4 градусах Цельсия. Полезно aliquot FBS в 50 мл конических труб до замораживания.
  2. В ламинарном капюшоне потока, оттепель две алициты FBS. Добавьте одну алициту в одну бутылку DMEM 500 мл, сделав смесь FBS/DMEM 10%. Для этого добавьте 6 мл glut и запасте полученным раствором при 4 градусах Цельсия. Это решение можно пометить как "DMEM без антибиотиков". (ДМЭМ -Аб)
  3. К второй бутылке 500 мл DMEM, добавьте другие 50 мл aliquot FBS. К этому решению добавьте 6 мл PSG и бульон при 4 градусах Цельсия. Это решение можно обозначить как "DMEM с антибиотиками". (ДМЭМ ЗАБ)
  4. Находясь в ламинарном капюшоне, удалите 10 мл DMEM Ab и поместите в колбу культуры ткани 25 мл.
  5. Оставив колбу в ламинарный капюшон, удалите замороженный алицит клеток H9c2 из хранилища в жидком азоте и быстро поместите трубку в водяную баню 37 градусов по Цельсию до тех пор, пока культура не разморозится.
  6. Спрей трубки с 70% этанола для дезинфекции, а затем вернуться к капоту. Работая быстро, чтобы свести к минимуму время ячейки в концентрированном DMSO, добавьте полную алициту ячеек к 10 мл DMEM Ab.  Это разбавляет DMSO достаточно для жизнеспособности и приверженности клеток на ночь.
  7. Поместите колбу в инкубатор культуры тканей при 37 градусах Цельсия, 5% C02и 95% влажности за ночь.
  8. На следующее утро проверьте слой ячейки, чтобы обеспечить соблюдение. Клетки, вероятно, будет между 80-100% слияния к этому времени.
  9. В капюшоне ткани-культуры, удалить средства массовой информации, содержащиеся в колбе с помощью вакуума, оставляя только клетки в колбе.
  10. Добавить примерно 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в клетки и скалы осторожно в течение примерно 3 сек.
  11. Инвертировать колбу так, что трипсин решение больше не в контакте с монослой, и удалить трипсин вакуумом.
  12. Добавьте в клетки вторую 2 мл алицита трипсина и переместите колбу в перевернутый микроскоп. Наблюдайте за клетками, нежно качая колбу, чтобы монослой рассеяться.
  13. После того, как монослой рассеивается, немедленно вернуться к ткани культуры капот и добавить 4 мл DMEM Ab к клеточной подвеске.
  14. Удалите 2 мл части клеточной суспензии, и добавить его в 50 мл ткани культуры колбу, содержащую 23 мл DMEM Ab. Рок колбу осторожно, а затем поместить его в ткани культуры инкубатора в условиях, перечисленных в шаге 2.5.
  15. Проверяйте клетки ежедневно, пока они не достигнут примерно 80% слияния (примерно 2,0-4,0 х 105 клеток на мл). Очень важно, чтобы клетки не стали слишком стеченными, так как они могут различаться в скелетные мышцы миотрубов, когда голодали FBS в течение длительныхпериодов времени 14, и эта дифференциация может изменить бактериальное вторжение.  Внимательно следите за клетками и начните с новой трубки клеток, если культура становится стеченной.
  16. Как только клетки достигают 80% слияния, они могут быть либо проходят в другой 50 мл колбы, как только что описано, или подготовлены к вторжению анализа.

3. Подготовка ячеек H9c2 к вторжению

  1. В капюшоне культуры ткани, удалите средства массовой информации из 50 мл колбы клеток H9c2, которые достигли 80% слияния с помощью вакуумного аспирации.
  2. Добавьте 4 мл раствора трипсина-ЭДТА в монослой и немедленно удалите с помощью вакуумного аспирации.
  3. Добавьте еще 4 мл порции 0,25% трипсина-ЭДТА в колбу и переместите колбу в перевернутый микроскоп, чтобы наблюдать дисперсию монослой.
  4. После того, как клетки разошлись, вернуться к капоту и добавить 4 мл DMEM-Ab в клетки. Трубопроводирование раствора вверх и вниз обеспечивает полное удаление клеток из нижней части колбы.
  5. После повторного сложения монослой, удалить все подвески и поместить его в 50 мл конической трубки.
  6. Удалите 20-ю часть этой подвески и подсчитайте количество клеток на миллилитр с помощью гемоцитометра.
  7. Как только концентрация клеток в растворе будет определена, отрегулируйте концентрацию до 2,25 х 104 клеток/мл, добавив соответствующий объем клеточного раствора в свежий DMEM -Ab. Общий объем скорректированного раствора должен быть 25 мл.
  8. Находясь в капюшоне, стерилизовать стеклянные крышки, окунув их в 90% этанола и кратко проходя каждый coverslip через пламя. Добавить каждый coverslip к отдельным хорошо 24-хорошо ткани культуры обработанной пластины сразу после того, как она стерилизована.
  9. После того, как все скважины имеют индивидуальный coverslip, использовать 25 мл пипетки, чтобы добавить 1 мл разбавленного раствора клеток для каждого из скважин в пластине, и нажмите каждый coverslip вниз с стерильной иглой.
  10. Проверьте каждый хорошо с помощью перевернутого микроскопа, чтобы обеспечить аналогичное количество клеток в каждой хорошо. Положите 24 хорошо пластины в инкубаторе культуры тканей на ночь при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 и 95% влажности.
  11. На следующее утро, просматривать каждый колодец, чтобы убедиться, что coverslips имеют сопоставимое количество приверженцев миобластов и что крышки не плавают в колодец.

4. Подготовка штаммов L. monocytogenes для анализа вторжения

ПРИМЕЧАНИЕ: Все лабораторные работы проводятся в соответствии с руководящими принципами CDC Biosafety Level 2.

  1. После подготовки 24-хорошо пластины для анализа, использовать стерилизованную петлю, чтобы удалить одиночные колонии штаммов, которые будут рассмотрены на бактериальное вторжение и привить каждый в отдельных 14 мл труб, содержащих 2 мл бульона BHI.
  2. Поместите привитые трубки в инкубатор 37 градусов по Цельсию, наклоненный на 45 градусов, и инкубировать статично (без тряски) на ночь.
  3. На следующее утро, удалить культуру трубки из инкубатора и вихря кратко обеспечить равномерное приостановление бактерий.
  4. Измерьте оптическую плотность культуры с помощью спектрофотометра на длине волны 600 нм. Убедитесь в том, чтобы обнулить спектрофотометр с помощью стерильного бульона BHI перед чтением оптической плотности.
  5. Для L. monocytogenes,оптическая плотность напрямую связана с концентрацией бактерий на мл, так что плотность 1.000 й 1.0 x 109 CFU в мл.
  6. Рассчитайте количество культуры, необходимое для заражения 2,25 х10 4 ячеек с 2,25 х10 6 (МВД No 100).
  7. Удалите необходимое количество культуры и поместите его в 1,5 мл центрифуги трубки.
  8. Спин культуры на 19000 х г в течение 3 минут, а затем отказаться от супернатанта. Нажмите на открытый конец трубки против бумажного полотенца, чтобы удалить излишки средств массовой информации застрял на губе трубки.
  9. Повторное распределение бактерий в 1 мл стерильных PBS, и вихрь для обеспечения достаточного смешивания. Эта смесь должна содержать примерно 2,25 х 106 CFU на 20 уль (1,125 х 108 CFU/ml).

5. Выполнение анализа вторжения

  1. За день до вторжения проявите 24-колодец пластины клеток H9c2, как описано в разделе 3, а также привить стерильный бульон BHI с желаемым штаммом (ы) Листерии, как описано в разделе 4.
  2. Используя протокол в разделе 4, подготовь для вторжения культуры штаммов, которые будут оцениваться на основе ПБГ. Примечание: Инфекционный титр может быть оценен на данный момент путем покрытия разбавления каждого образца на твердых средств массовой информации и перечисления колоний после ночной инкубации.
  3. Загрузите не менее 20 уль раствора PBS-бактерий в отдельные скважины пластины из 24 скважин. Обратите внимание, что по крайней мере три отдельных скважин необходимы для каждого штамма для того, чтобы получить результаты в тройной, так что до 8 штаммов могут быть оценены в тандеме.
  4. После загрузки скважин с бактериями, осторожно рок пластины для поощрения однородного распространения каждого образца в колодец, и место 24-хорошо пластины обратно в инкубатор в течение 45 мин инкубации при 37 градусов по Цельсию и 95% влажности, с 5% CO2.
  5. Во время этой инкубации, подготовить aliquot DMEM - Ab (раздел 2) путем простого удаления 25 мл DMEM-Ab и поместить его в 50 мл сокола трубки (или эквивалент).
  6. Добавьте гентамицин в 25 мл DMEM -Ab aliquot в концентрацию 15 ug/ml (7,5 уль раствора бульона 50 мг/мл). Поместите раствор DMEM -Ab «Gent» в водную баню 37 градусов по Цельсию в течение 45-минутной инкубации.
  7. Aliquot 25 мл PBS в 50 мл соколиной трубки и место в 37 градусов по Цельсию водяной бани во время 45 мин инкубации.
  8. После того, как 45 мин инкубации завершена, удалить 24-хорошо пластины и поместить его в капюшон. Удалите средства массовой информации, содержащие бактерии из каждой хорошо вакуумной аспирации, изменение стеклянных труб советы между различными штаммами.
  9. Добавьте приблизительно 1 мл PBS к каждому хорошо для того чтобы смыть свободно-adherent бактерии от поверхности клеток, после этого извлекаем PBS используя аспирации вакуума.
  10. После полного удаления PBS, добавьте 1 мл DMEM-Ab Gent к каждой хорошо. Гентамицин будет убивать только те бактерии, которые остаются за пределами клеток, таким образом, те, которые внутриклеточных останется жизнеспособным.
  11. Поместите 24-хорошо пластины обратно в инкубатор и позволяют инкубировать в течение дополнительного часа.
  12. В течение часа инкубации, подготовить 14 мл полипропиленные трубки, добавив 1 мл стерильных ddH2 0к каждой трубке. Одна трубка будет необходима для каждого крышки, так что для одной пластины 24-хорошо, подготовить 24 трубки в общей сложности.
  13. После часовой инкубации снимите 24-хорошую пластину из инкубатора и поместите ее в капот вместе с трубками, подготовленными в шаге 5.12.
  14. Используя стерильные пинцеты, удалите каждый крышку из своего соответствующего хорошо и поместите его сразу в отдельной трубке. Не забудьте окунуть пинцет в этанол и пламя их между каждым coverslip для того, чтобы предотвратить загрязнение.
  15. После того, как все крышки были удалены и помещены в отдельные трубки, отбросить 24-хорошо пластины.
  16. Вернуться на скамейку и вихрь каждой трубки в течение 5-10 сек.
  17. Удалите часть из каждой трубки и поместите каждый образец в отдельный колодец пластины 96-колодец, а затем последовательно разбавить каждый образец с помощью 1:10 разбавления до 1:1000 разбавления.
  18. Используя довоенные и сухие пластины LB, пятно пластины каждого из серии разбавления на агар пластин. Многоканальный пипетка может быть использована для пластины 5-10 х л пятна из каждой серии разбавления образца.
  19. Также удалите 20 образцов хл из каждого неразбавленного хорошо и пятно пластины это количество непосредственно на LB агар на отдельной пластине из серии разбавления. (Этот больший объем может быть использован для перечисления плохо инвазивных штаммов).
  20. После того, как все образцы были обнаружены, отбросьте 14 мл трубок, содержащих крышки. Parafilm 96-хорошо пластины и поместите его в морозильную камеру при -80 градусов по Цельсию для покрытия, если это необходимо.
  21. Дайте пятнам полностью высохнуть. Этот процесс значительно ускоряется, помещая пластины в капот и снимая крышки.
  22. После того, как пятна высохт, поместите тарелки в инкубатор 37 градусов по Цельсию на ночь.
  23. На следующее утро подсчитайте количество колоний в каждом месте серии разбавления, для которых можно легко оценить числа колоний (от примерно 5 до 50 колоний)(рисунок 1),и используйте серию для расчета количества бактериальных на крышку для каждого оцениваемого штамма.

6. Подготовка штаммов L. monocytogenes для мышиных инфекций

  1. В ночь перед инфекцией, использовать стерилизованную петлю, чтобы удалить одиночные колонии штаммов желаемого и привить каждый в отдельных 14 мл трубок, содержащих 2 мл бульона BHI.
  2. Поместите привитые трубки в инкубатор 37 градусов по Цельсию, наклоненный на 45 градусов, и инкубировать статично (без тряски) на ночь.
  3. На следующее утро, удалить культуру трубки из инкубатора и вихря кратко обеспечить равномерное приостановление бактерий.
  4. Измерьте оптическую плотность культуры с помощью спектрофотометра на длине волны 600 нм. Убедитесь в том, чтобы обнулить спектрофотометр с помощью стерильного бульона BHI перед чтением оптической плотности. (Для L. monocytogenes,оптическая плотность напрямую связана с концентрацией бактерий на мл, таким образом, что плотность 1,000 и 1,0 х 109 CFU на мл)
  5. Рассчитайте количество культуры, необходимое для заражения каждого животного. Инъекции обычно содержат 200 мкл PBS с 10000 CFU индивидуального штамма, что приводит к желаемой концентрации 5,00 х 104 CFU/ml.
  6. Удалите 5 мкл aliquot каждого окончательного разбавления и распространение пластины его непосредственно на LB агар.  Инкубация на ночь при 37 градусов по Цельсию, чтобы подтвердить концентрацию, используемую для прививки.
  7. Ввись каждую подвеску CFU в течение 1 часа после разбавления (см. ниже).

7. Инокулирование L. monocytogenes в мышей через инъекции хвоста вены и оценки бактериального бремени в печени, селезенки и сердца

Примечание: Все работы на животных выполняются в соответствии с руководящими принципами CDC Biosafety Level 2.  Мыши, как правило, приказал одну неделю вперед и в клетке вместе с 5 животных в клетку. Мышам разрешается акклиматизироваться к новой лабораторной среде за четыре дня до инъекции. В этих экспериментах использовались 6-8-недельные самки мышей швейцарского веб-Уэбстера, которые были помещены в клетку в барьерной среде и питались неограниченной диетой.

  1. Подготовка одной клетке мышей в то время, удалив крышку и продукты питания / воды бункеров, и размещение клетки под тепловой лампой в течение пяти минут. Этот процесс позволяет расширить вены хвоста, что облегчает операции по инъекциям.
  2. Удалите одно животное и поместите его в упряжь (или соколиную трубку с отрезанием конца), чтобы сдержать животное во время инъекции.
  3. Очистите место инъекции с помощью спиртовой прокладки и дайте спирту испариться. Это не только очищает участок, но и еще больше расширяет хвостовую вену.
  4. Используя шприц 1 мл, оснащенный иглой калибра 27,5 мл, аккуратно ввишайте мышь с 200 л желаемой культуры в хвостовую вену.
  5. Используйте марлю, чтобы остановить кровотечение, которое может произойти в результате инъекции, и поместить животное в свежую клетку.
  6. Повторите этот процесс для оставшихся животных и штаммов. Не забудьте обозначить каждую клетку животных с напряжением они получили.
  7. Проверьте на животных ежедневно, удаление и жертвуя любыми животными, которые, как представляется, в больных.  Если у животных нет признаков болезни, позвольте инфекциям продолжаться в течение 72 часов, прежде чем жертвовать всеми животными.
  8. Чтобы принести в жертву, используйте CO2 анестезии из источника в бутылках, пока все дыхание остановилось, а затем использовать шейки вывиха для того, чтобы гарантировать, что животное мертво.
  9. После жертвоприношения, переместить животных в ткань культуры капюшон для вскрытия.
  10. Используя блок вскрытия, прикрепите каждую ногу животного большими иглами и распылите животное 70% этанолом, пока оно не насытит.
  11. Вырезать кожу живота и грудной клетки назад с помощью Y-образный разрез, который простирается от вагинального открытия до процесса xiphoid, прогрессирует затем до подмыги каждой руки.
  12. Оттяните кожу и удалите иглы с каждой ноги, чтобы держать вскрытие открытым.
  13. Аккуратно прорежьте брюшной полышко, обнажая кишечник, желудок, печень и селезенку.
  14. Сначала разрезая печеночной вены и корональной связки в верхней части печени, начинают удалять печень. Дополнительные связки, которые будут удалены находятся под печенью, соединяя его с первой секции тонкой кишки, а также мускулатуры спины.
  15. Поместите печень в 5 мл стерильного ddH2 0в 50 мл соколиной трубки.
  16. Затем удалите селезенку, изолировав ее и аккуратно отрезав сосуды и связки. Селезенка будет удалена легче, чем печень. Поместите селезенку в отдельную соколиную трубку, содержащую 5 мл стерильного ddH20.
  17. Найдите диафрагму и аккуратно разрезать вдоль грудной клетки для того, чтобы визуализировать грудную клетку. Прорезать процесс xiphoid и грудины до уровня шеи для того, чтобы открыть грудную клетку, подвергая сердце и легкие.
  18. Используя типсы, аккуратно схватите сердце за вершину и поднимите его так, чтобы аорты и легочные сосуды были в напряжении. Вырежьте эти сосуды, чтобы освободить сердце.
  19. Поместите сердце в 50 мл соколиной трубки, содержащей 5 мл стерильного ddH20.
  20. Отбросьте тушу мыши и повторите этот процесс для каждого животного, используя чистые соколиные трубки, содержащие 5 мл стерильного ddH20 для каждого органа удалены.
  21. После того, как все органы были удалены, очистить рабочую станцию и вернуться на скамейку.
  22. Подготовь набор из 5 трубок, которые будут использоваться для очистки и стерилизации гомогенизатора для каждого набора органов от пяти мышей(т.е. одна 5 трубка, установленная для 5 печени, 5 трубок для 5 селезенки и 5 трубок для 5 сердец). Четыре из каждой из трубок должны быть заполнены 30 мл стерильных ddH20, и один должен быть заполнен 30 мл 90% EtOH.
  23. Используя TissueMaster (или эквивалентный гомогенизатор), окуните гомогенизатор (во время бега) в трубки, подготовленные в шаге 7.21, чтобы очистить зонд:
  24. Труба 1 (ddH2O)
    5 сек в трубе 2 (ddH2O)
    5 сек в трубе 3 (EtOH)
    5 сек в трубе 4 (ddH2O)
    5 сек в трубе 5 (ddH2O)
  25. Гомогенизировать одну печень с помощью гомогенизатора, по крайней мере 2 мин, или до тех пор, пока видимые части органа остаются. Используйте пинцет, чтобы удалить любые крупные обломки из зонда.
  26. Повторите процесс очистки, описанный в шаге 7.22
  27. Повторите процесс гомогенизации для других печени, убедившись, что мыть зонд между каждой печени, используя процесс, описанный в шаге 7.22.
  28. После того, как все печени полностью гомогенизированы, отбросить мыть трубки (1-5) для печени.
  29. Повторите гомогенизировать / чистый процесс для селезенки и сердца, а также, убедившись, что использовать новый набор мытья труб для каждой серии органов. Если в какой-то момент мыть трубки становятся мутными, отбросить их и заменить новыми трубками, чтобы закончить серию.
  30. После того, как все органы были гомогенизированы, сделать последний цикл очистки на гомогенизатор и высушить его хорошо для хранения.
  31. Поместите приблизительно 200 мкл каждого органа в отдельный колодец пластины из 96 колодец.
  32. Выполните серийные разбавления на образцах органов путем разбавления 1:10 в серии до 1:10,000 разбавления (печень и селезенка) или до 1:1000 разбавления (сердце).
  33. Пятно пластины разбавления серии на предварительно разогретый агар LB. Также удалите 20 уль каждого неразбавленного органа и пластины на отдельные пластины LB агар для того, чтобы перечислить CFU из плохо колонизированных органов.
  34. Отбросьте соколиные трубки, содержащие гомогенизированные органы, и оберните пластины 96-колодец, содержащие серию разбавления с парафильмом и поместите его в морозильную камеру при -80 градусов по Цельсию.
  35. Дайте пятнам высохнуть. Этот процесс ускорился путем размещения пластин в капюшоне и снятия крышки.
  36. После того, как пятна высохт, поместите тарелки в инкубатор 37 градусов по Цельсию на ночь.
  37. Подсчитайте количество колоний в каждом месте на следующее утро и используйте серию разбавления для расчета общего количества бактерий на орган.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выбранные изоляты L. monocytogenes демонстрируют усиленное вторжение сердечных клеток в клеточной культуре и в мышиных моделях инфекции. Рисунок 1 показывает пример того, как бактериальные колонии могут появиться после точечного покрытия суспензий на агар-медиа. Этот метод позволяет точно оценить CFUs в образце без использования большого количества агар-медиа пластин. На рисунке 2 показан пример анализа, основанного на культуре тканей, сравнивая способность штамма 10403S вторгаться в клетки сердца с способностью штамма 07PF0776. Более чем в два раза больше 07PF0776 бактериальных CFU могут быть извлечены из инфицированных H9c2 сердечных клеток после лечения гентамицина по сравнению с клетками, инфицированными 10403S. Различия от 2 до 4 раз обычно наблюдаются для кардиотропных штаммов с помощью этого анализа. На рисунке 3 показан пример восстановления бактерий из печени, селезенки и сердца инфицированных мышей в течение 3 дней после заражения. Инфекция мышей кардиотропным штаммом 07PF0776 или штаммом 10403S приводит к сопоставимому количеству бактерий, восстановленных из печени и селезенки инфицированных мышей, однако мыши, инфицированные 07PF0776, с большей вероятностью дают обнаруживаемое количество бактерий из сердца и проявляют большую бактериальную нагрузку в этом органе.

Figure 1
Рисунок 1: Пример метода точечного покрытия для определения бактериальных CFUs. Клетки H9c2, выращенные на стеклянных крышках и зараженные L. monocytogenes, были облиты лизами, а подвески последовательно разбавлялись с помощью разбавления 1:10 до разбавления 1:1000 (левая панель). Многоканальный пипетка была использована для трубы 10 уль от каждой хорошо непосредственно на пластину Агар LB, и пластина была инкубирована на ночь при 37 градусов по Цельсию (правая панель). Количество бактерий на крышку оценивается путем подсчета бактериальных CFU, связанных с соответствующим разбавления.

Figure 2
Рисунок 2: L. monocytogenes штамм 07PF0776 экспонатов расширенного вторжения сердечных клеток в культуре тканей. Анализы вторжения проводились в клетках H9c2 с использованием МВД No 100. График изображает среднее число внутриклеточных бактериальных CFUs восстановленных q/- SE из клеток, инфицированных 10403S (черный) по сравнению с кардиотропным штаммом 07PF0776 (синий). Указывает на значение p <0.01.

Figure 3
Рисунок 3: L. monocytogenes штамм 07PF0776 экспонатов расширенного вторжения в сердце в мышиных моделей инфекции. Зверь был привит 10000 CFU через хвостовую вену. Инфекции были разрешены для прогресса в течение 72 часов, после чего животные были принесены в жертву и печени, селезенки и сердца были собраны и обработаны для определения бактериальных CFU на орган. Твердые круги представляют CFU, полученный от отдельных мышей, со средним значением для всех животных в группе, указанной строкой q/- SE. Процентные значения указывают на количество животных, содержащих обнаруживаемые бактериальные CFU в сердце. указывает на значение p <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L. monocytogenes является широко распространенным и хорошо охарактеризованным патогеном человека, способным вызывать ряд различных проявлений заболевания15. Бактерия была ранее описана за его способность транслокировать через барьеры, такие как гемовно-мозговой барьер и плацентарный фетальный барьеры, для того, чтобы достичь и колонизировать центральную нервную систему и развивающихся плодов, соответственно. Способность организма колонизировать эти ткани часто дополняется способностью in vitro вторгаться в представительные клетки в культуре, которые составляют органы, против которые направлены. Например, вторжение эпителиальных клеток в хороидное сплетение было связано со способностью организма колонизировать ЦНС16; иvillous trophoblast explants были использованы для того чтобы представить материнск-фетальный барьер17. В этом протоколе были описаны методы, которые полезны для оценки бактериального вторжения клеток сердца в культуру, а также для сравнения бактериальной колонизации сердца для отдельных изолятов относительно колонизации печени и селезенки.

Этот протокол содержит ряд критических шагов, но среди наиболее важных являются те, которые связаны с использованием правильного бактериального CFU либо для инфекции клеток культуры тканей, выращенных на coverslips или инфекции животных. Если бактериальное число CFU неправильно контролируется между различными колодцами и животными, то прямые сравнения между образцами не могут быть сделаны. Важно, чтобы дважды проверить разбавления серии, используемые для создания инокулы путем прямого покрытия окончательного разбавления на пластинах средств массовой информации, с тем чтобы гарантировать, что бактериальный номер CFU была точно оценена.

Клетки H9c2, используемые в этих анализах, получены из нижней половины 13-дневного эмбрионального крысиного сердца, которое включало в основном желудочковойткани 18. Клетки размножаются как мононуклеированные миобласты и по достижении слияния в тканях культуры колбы или блюда начинают формировать многонуклеарные трубчатые структуры. Клетки имеют время генерации приблизительно 30 часов18. Сыворотка голодания клеток H9c2 была связана с дифференциацией клеток в скелетные мышечные клетки, в то время как лечение миобластов с 10 nM всетранс ретинойной кислоты был связан с дифференциацией миобласта в сердечныхмиоцитов 14. Этот протокол был сосредоточен на L. monocytogenes myoblast вторжения клеток, однако H9c2 клеточной линии является универсальной клеточной линии, которые могут быть использованы для расследования последствий контролируемой дифференциации клеток на бактериальное вторжение.

Штамм L. monocytogenes 07PF0776 был первоначально изолирован от ВИЧ-инфицированного пациента, у которого был нерацитируемый асистолический арест из-за инвазивной инфекции L. monocytogenes сердца 8. Последующий анализ этого штамма в моделях мышиной инфекции показал, что он имеет повышенную способность к целевой и вторгнуться в сердечную ткань. Ограниченный анализ дополнительных случайных изолятов L. monocytogenes позволяет предположить, что поднаселения бактериальных изолятов способны инфицировать сердца мышей при отсутствии каких-либо предварительных повреждений сердечной ткани или сердечных клапанов8. Интересно, что два из наиболее характерных штаммов L. monocytogenes, 10403S и EGD, оказались бедными колонизаторами сердечных клеток и тканей. Секвенирование генома изолята 07PF0776 не выявило присутствия каких-либо новых островов патогенности и не предоставило доказательств уникальных генныхкластеров 19; это говорит о том, что 07PF0776 нацелен на сердечные клетки для вторжения путем модификации существующего арсенала генных продуктов вирулентности. Предварительный гистохимический анализ показывает, что 07PF0776 образует абсцессы в инфицированных сердцах мышей, которые кажутся похожими на абсцесс, наблюдаемый в первоначальном инфицированном пациенте человека (данные не показаны). Вопрос о том, вызывают ли другие кардиотропные изоляты L. monocytogenes аналогичное образование абсцесса сердца, еще предстоит определить.

Представленные здесь анализы могут быть легко изменены для облегчения изучения различных аспектов инфекции. Индивидуальные coverslips могут быть зафиксированы и окрашены для света или флуоресценции основе микроскопии, ткани культуры инкубации раз может быть увеличена для измерения и сравнения бактерий внутриклеточных темпов роста, тканей и органов могут быть парафин встроенных и обработанных для микроскопического исследования для изучения абсцесс формирования и бактериального распределения на клеточном уровне. При оценке уровней бактериального вторжения клеток культуры тканей или колонизации тканей-хозяина, Есть ограничения с точки зрения минимального количества бактерий каждый анализ может обнаружить. Анализы вторжения in vitro имеют более низкий предел обнаружения приблизительно 300 CFU в крышку. Корректировка объема воды, используемой для вихря coverslips может повысить обнаружение низкого числа бактерий, с объемами лиза клеток, как низко как 500 мкл доказать полезным для обнаружения плохо инвазивных штаммов. Coverslips можно кратко окунуть в стерильную воду для того чтобы извлечь сверхнормативный gentamicin до лиза клеток хозяина в более малых томах. Уровни объема до 5 мл или более могут быть использованы для правильного перечисления высокоинвазивных штаммов. У животных, орган гомогенаты могут быть получены в объемах 5 мл или 10 мл ddH2 0, сболее низкими объемами полезно для обнаружения более низких уровней бактерий, и более высокие объемы, чтобы лучше перечислить сильно колонизированных органов. Минимальный диапазон обнаружения инфицированных органов составляет около 100 CFU. Если органы последовательно колонизированы на высоких уровнях, рассмотреть вопрос об использовании большего объема воды (10 мл) и выполнения более разбавления в 96-хорошо пластины.

Описанные методы могут быть применены к органам и тканям за пределами сердца. Вторжение анализы и мыши инфекций, таких как они были использованы для оценки колонизации во множестве сайтов, в том числе плаценты, мозга, желчного пузыря, печени и кишечника. Изменения протоколов, описанных выше, также могут быть сделаны для того, чтобы вместить гиперинвазивные и/или гипервирулятивные штаммы, и замена клеток сердца другими типами клеток может быть сделана для оценки фенотипов вторжения в местах за пределами сердечно-сосудистой системы. Поскольку различные типы клеток изменили восприимчивость к вторжению L. monocytogenes, для точного иявления данных из анализов может потребоваться корректировка параметров, таких как МВД и инкубационной времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не сообщают о конкурирующих финансовых интересах.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Службы общественного здравоохранения AI41816 и AI099339 (N.E.F.) и F31AI094886-01 (P.D.M.) от NIAID. Содержание является исключительно обязанностью авторов и не обязательно отражает официальную точки зрения источников финансирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).

Tags

Инфекция Выпуск 99 Бактериальный патогенез внутриклеточный патоген тканевой тропизм бактериальная нашествие сердечная инфекция листериоз
Оценка бактериального вторжения сердечных клеток в культуре и колонизации сердца у инфицированных мышей с <em>использованием листерий моноцитогенов</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMullen, P. D., Freitag, N. E.… More

McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter