Experimentelle Bewertung der Maus Sociability einer automatisierten Bildverarbeitung Ansatz

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode Maus Kontaktfreudigkeit zu quantifizieren. Die Mäuse werden auf Video aufgezeichnet, wie sie in einem speziellen Käfig bewegen und interagieren. Filmverarbeitung ermöglicht die automatisierte Quantifizierung von Gesellschaftlichkeit mit ausgezeichneter Genauigkeit und Zuverlässigkeit.

Zusammenfassung

Maus ist das bevorzugte Modellorganismus für Medikamente entwickelt, zu erhöhen Kontaktfreudigkeit zu testen. Wir stellen eine Methode Maus Kontaktfreudigkeit zu quantifizieren, in dem die Testmaus in einem standardisierten Gerät gestellt wird und relevante Verhaltensweisen werden in drei verschiedenen Sitzungen beurteilt (die so genannte Session I, II und III).

Das Gerät verfügt über drei Fächer (siehe Abbildung 1), die linken und rechten Kammern eine umgekehrte Schale enthalten , die eine Maus aufnehmen kann ( "Stimulus Maus" genannt).

In Sitzungs I, wird der Test der Maus in den Käfig gegeben und seine Beweglichkeit wird durch die Anzahl von Übergängen, die zwischen Kammern gekennzeichnet. In Session II wird ein Stimulus Maus unter einer der invertierten Tassen und die Kontaktfreudigkeit der Test Maus wird durch die Höhe der Zeit , es verbringt in der Nähe der Tasse gegen den leeren umgekehrten Schale enthält die beiliegende Stimulus Maus quantifiziert platziert. In Session III werden die umgekehrten Becher entfernt ein d beide Mäuse frei interagieren. Die Geselligkeit der Test Maus in der Sitzung III wird durch die Anzahl der sozialen Ansätze quantifiziert es der Reiz Maus macht zu und durch die Anzahl der Zeiten vermeidet es einen sozialen Ansatz durch den Reiz der Maus.

Die automatisierte Auswertung des Films erkennt die Nase des Testmaus, die die Bestimmung aller beschriebenen Kontaktfreudigkeit Maßnahmen in der Sitzung I und II ermöglicht (in der Sitzung III werden Ansätze automatisch identifiziert, aber klassifiziert manuell). Um die Nase, das Bild eines leeren Käfig finden wird digital von jedem Frame des Films abgezogen und das resultierende Bild wird digitalisiert die Maus Pixel zu identifizieren. Die Maus Schwanz wird automatisch entfernt und die beiden am weitesten entfernten Punkte der verbleibenden Maus bestimmt werden; diese sind in der Nähe der Nase und der Basis des Schwanzes. Durch die Analyse der Bewegung der Maus und der Kontinuität Argumente wird die Nase identifiziert.

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Abbildung 1. Bewertung der Sociability Während drei Sitzungen Session I (oben):.. Akklimatisierung von Test Maus in den Käfig Session II (Mitte). Test - Maus frei im Käfig bewegt , während der Reiz Maus in einer umgekehrten Schale eingeschlossen ist Session III (unten): Beide Test Maus und Stimulus-Maus erlaubt frei miteinander und interagieren zu bewegen.

Einleitung

Impaired Kontaktfreudigkeit ist eine der primären Symptom - Domänen in einer Reihe von Störungen der neurologischen Entwicklung, einschließlich Autismus - Spektrum - Störungen (ASD) ^1,2. Es schränkt die Fähigkeit der Patienten , Beziehungen zu entwickeln und stark beeinflusst Patienten, Familien und Betreuer ^2,3.

In dem Bemühen, besser den Mechanismus verstehen beeinträchtigt Kontaktfreudigkeit zugrunde liegenden und zu entwickeln Behandlungen wurden mehrere Mausmodelle ^1,4-9 untersucht. Ein solcher Stamm ist der Balb / c - Maus, ein Inzuchtstamm , die auffallend niedrige Kontaktfreudigkeit zeigt, ähnlich Funktionen bei Patienten mit ASD5 ^8-12 gesehen. Zum Beispiel zeigt die Balb / c - Maus eine niedrigere Frequenz der sozialen Ansätzen und einer in der Regel negativen Antwort auf die sozialen Ansätze durch einen Reiz Maus (zB soziale Vermeidung) als der Schweizer Webster Komparator Stamm ^10.

Um zu testen, ob eine vorgeschlagene Behandlung ist effective bei der Steigerung sind Kontaktfreudigkeit, objektive Maßnahmen erforderlich. Eine weithin akzeptierte Rahmen ist die Geselligkeit in einem standardisierten Gerät zu analysieren , die drei Fächer hat (siehe Abbildung 1).

Die linke und rechte Kammern enthalten jeweils einen invertierten Draht Tasse, die eine sozial ausgeprägten Reiz Maus beherbergt. Der Test Maus ist für drei Intervallen von 10 min (Sitzungen I-III) in das Gerät freigesetzt; Sitzung I beurteilt die Bewegungsaktivität der Test Maus, während Sitzungen II und III verschiedene Aspekte des Geselligkeits-Test Maus beurteilen.

In Session I, wird der Test Maus an das Gerät akklimatisieren. In dieser Sitzung, die die Anzahl von Übergängen der Test Maus zwischen den verschiedenen Abteilen ermöglicht wird gemessen. Wichtig erhalten, Kontaktfreudigkeit Maßnahmen in der Standard-Drei-Kammer-Gerät auf die Bewegungsaktivität abhängig sind, und reduziert die Bewegungsaktivität kann Interpretation von soci vermengenFähigkeit, Daten.

In Session II wird die Test Maus frei bewegen und ein Reiz Maus wird unter einer der invertierten Tassen platziert (ausgeglichen). Die Stimulus-Mäuse sind 4 Wochen alte männliche ICR outbred Mäuse, Alter und Geschlecht abgestimmt auf die Testmäuse. Der Reiz der Maus wird in einer umgekehrten Schale in der Seite bezeichnet als Sozialraum eingeschlossen ist, und eine leere umgekehrten Schale ist in der Seiten bezeichnet als nonsocial Fach gelegt. In Session II wird die Kontaktfreudigkeit des Test Maus durch einen Vergleich der Zeit , es in der Nähe des "sozialen" Inverted Cup verbringt quantifiziert (weniger als 2 cm entfernt) gegen die Zeit, in der Nähe des "nonsocial" Inverted Cup, und durch die Zeit verbringt sie verbringt im Sozialraum gegen die Zeit, in der nonsocial Raum verbringt. Swiss Webster Komparator Mäuse verbringen deutlich mehr Zeit im sozialen Raum und in der Nähe der sozialen umgekehrten Schale im Vergleich zu Balb / c-Mäusen, die keine signifikante Präferenz für die soziale zeigenInverted Cup oder die soziale Fach ^12.

In Session III, Test und Stimulus Mäuse sind erlaubt, frei zu interagieren (invertiert Tassen werden entfernt). Maßnahmen der Geselligkeit, Stereotypien Verhaltensweisen und Übergänge zwischen den Kammern werden zuverlässig in der dritten 10 min Sitzung der freien Interaktion zwischen Test und Stimulus Mäusen erhalten und analysiert. In diesem Bericht wird die Kontaktfreudigkeit der Test Maus über zwei Maßnahmen quantifiziert: 1) die Anzahl der sozialen Ansätze es in Richtung der Reiz Maus macht, wo eine soziale Ansatz als vorwärts definiert (Nase zuerst) in Richtung der Reiz Maus, so dass die Nase weniger als 2 cm entfernt von der Stimulus-Maus; 2) die Anzahl der Vermeidungen sozialer Ansätze durch den Stimulus Maus. Der Test Maus gilt als Ansatz zu vermeiden, wenn es dreht oder bewegt sich von der Stimulus Maus weg, oder wenn es vorübergehend außer Betrieb ( "Einfrieren Verhalten") nach dem Stimulus Maus zu bewegen hat den Test der Maus angefahren. BALB /c - Mäuse zeigen eine Abnahme der Zahl der sozialen Ansätze gemacht gegenüber dem Stimulus - Maus und eine Erhöhung der Zahl der negativen Reaktionen auf soziale Ansätze durch den Reiz der Maus im Vergleich zum Swiss - Webster - Komparator - Stamm ^10.

Die Auswertung der Verhaltens Filme wurde traditionell manuell durchgeführt worden, dh durch den Film (möglicherweise mit reduzierter Geschwindigkeit) sorgfältig zu beobachten und Stoppuhren für die Zeit , die Maus verbringt in einem bestimmten Fach oder in der Nähe eines der invertierten Becher ¹⁰ zu aktivieren. Dieses Verfahren erfordert wiederholt des Films beobachtet und ist daher sehr zeitraubend. Außerdem wird die Genauigkeit durch die Rater die Reaktionszeit für die Stoppuhr-Messungen und die Fähigkeit zu erkennen, beschränkt, ob die Maus innerhalb von 2 cm von der umgekehrten Schale ist. In den letzten Arbeiten, zwei Verbindungen (D-Serin und D-Cycloserin) haben bei der Wiederherstellung Umgänglichkeit in BALB / c - Mäuse ^9,10,12 wirksam erwiesen. Es ist bekannt, dass beide Komponenten moduEnde der NMDA - Rezeptor, der bekannt ist , eine zentrale Rolle im Sozialverhalten ^2,12 zu spielen. NMDA-Rezeptor-Aktivität in einer Vielzahl von wohldefinierten Weise, und das Potential für einen Durchbruch in ASD-Behandlung Eine große Reihe von Verbindungen ist bekannt, zu modulieren, macht die beschleunigte Bewertung dieser Verbindungen eine Priorität und eine schnelle automatische Methode zur Auswertung sehr wünschenswert.

Nachstehend wird ein automatisches Analyseverfahren für die Beurteilung der Maus Soziabilität entwickelt. Es verwendet Bildverarbeitungsverfahren auf alle Rahmen der Maus Filme der Position der Maus oder Mäuse zu identifizieren. In Sitzungen I und II, sie erkennt weiter Nasenposition und verwendet sie Soziabilität Maßnahmen zu berechnen. In Session III, erkennt er automatisch alle Ansätze, aber manuelle Klassifizierung (soziale Ansatz, soziale Vermeidung oder andere) erforderlich.

Protokoll

Das Protokoll für die Vereinfachung der Erläuterung wurde in 2 Teile geteilt: 1) Versuchsdurchführung und 2) Automatisierte Analyse. Alle Tiere wurden nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren ¹⁵ behandelt, und alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Experimentelles Verfahren

1. Stellen Sie den Käfig, der eine schwarze entspiegelte Plexiglas rechteckigen Kasten (52 x 25 x 23 cm ³⁾ gliedert sich in drei Abteilungen: sozial, nonsocial und einem neutralen Mittelfach (Abbildung 1). Platzieren Sie invertiert Draht Tassen in jeder der Stirnfächer während der Sitzungen I und II (siehe unten) und beherbergen die Reiz Maus während Sitzung II.
2. Stellen Sie die Kamera in einer solchen Weise auf, dass der Käfig um das Sichtfeld ausfüllt. Da Beleuchtung mit Mausverhalten stören können, eine Leuchtdichte von nicht mehr als 3,5 Lux in den Käfig halten, aus dem indirekten Licht, das voneine Glühlampe und in Richtung nach oben auf dem Käfigboden gemessen. Verwenden Sie auch eine Infrarot-Lichtquelle, die Mäuse nicht wahrnehmen kann, aber die Kamera erfassen kann. Notieren Sie alle Filme in 720 x 480 Standard-Definition.
3. Nehmen Sie ein einzelnes Bild von einem leeren Käfig für die spätere Bildverarbeitung (die "Referenzrahmen" genannt) und als Graustufenbild zu speichern.
4. Session I: Einführung Test Maus in den Käfig und Wellen Hand über den Käfig, die den Beginn der Sitzung (vgl Automatisierte Analyse). Nehmen Sie Film für 10 min. Am Ende der 10 Minuten, legen Sie die Maus wieder in seine ursprüngliche Käfig.
5. Session II: die Reiz Maus unter einer der invertierten Tassen Put (ausgeglichen).
6. Verwenden Sie die "Social links" oder "Social rechts", um zu wählen, ob der Reiz Maus auf der linken Seite in der umgekehrten Schale ist oder in der umgekehrten Schale auf der rechten Seite.
   HINWEIS: Die umgekehrte Tasse mit dem Reiz der Maus wird die "soziale Tasse" genannt, während die andereKelch ist der "nonsocial Tasse". Das Fach, in dem die soziale Tasse ist die soziale Fach, das Fach mit dem nonsocial Kelch ist der nonsocial Fach, und das mittlere Fach ist das "neutrale Fach" genannt befindet.
7. Führen Sie den Test Maus in den Käfig. Welle der Hand über den Käfig den Beginn der Sitzung anzuzeigen. Nehmen Sie Film für 10 min. Wichtig ist, halten Mäuse in der Geselligkeits Gerät vor der invertierten Tassen Entfernen Session III zu beginnen.
8. Session III: Entfernen Sie die invertierten Tassen, lassen Sie die beiden Mäuse und erlauben Mäuse die Test und Stimulus miteinander zu interagieren frei. Welle der Hand über den Käfig den Beginn der Sitzung anzuzeigen. Nehmen Sie Film für 10 min. Am Ende der 10 Minuten, legte beide Mäuse zurück in ihre jeweiligen Käfige.

2. Automatisierte Analyse

HINWEIS: Die Befehle in Abschnitt 2 werden über eine grafische Benutzeroberfläche ausgegeben (siehe Abbildung 2) , die conKontrollen unserer Software. Hier erklären wir den Schritt-für-Schritt-Verarbeitung, die unsere Software ermöglicht; die Software ist auch in der Lage, die Analyse im Batch-Modus ohne Benutzereingabe durchgeführt wird.

1. Für jeden Film, führen Sie die folgenden Verarbeitungsschritte:
   1. Last Film (klicken Load).
   2. Wählen Käfig-Konfiguration, die das Analyseprogramm die Position des Käfigs Grenzen, Kompartimentgrenzen und Tasse Standorten erzählt. Wählen Sie eine der vier gespeicherten Konfigurationen oder manuell alle Koordinaten einzustellen.
      HINWEIS: Die Konfiguration in der Regel nicht ändert von einem Experiment zum nächsten und somit wiederverwendet werden können.
   3. Für jedes Bild des Films, führen Sie die folgenden Verarbeitungsschritte (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Wandeln Sie den Rahmen, indem Sie auf die "Graustufen", um in Graustufen.
      2. Digital subtrahieren Sie den Graustufen- Referenzrahmen (siehe Schritt 1.3), indem Sie auf den "subtrahieren" -Taste. HINWEIS: Das Ziel dieses Schrittes ist die Pixel va zu machenLues des Rahmens sehr nahe überall auf Null mit Ausnahme der Mausposition.
      3. Binarisieren den Rahmen, indem alle Pixel unter einem bestimmten Schwellenwert zu schwarz Einstellung, alle Pixel über diesem Niveau auf weiß (klicken Sie auf den "Binarisieren" -Button).
         Hinweis: Die Idee ist, dass, da die Maus Pixel im Allgemeinen höhere Werte aufweisen als die übrigen Pixel, wird die Maus Pixel weiß und alle anderen Pixel schwarz. Der optimale Schwellenwert ist abhängig von den Lichtverhältnissen und kann durch die Beurteilung der Maus Form über einen Film bestimmt werden. Wenn die Schwelle zu niedrig gewählt wird, erscheint die Maus zu groß, und Pixeln, die weiß gefärbt sein, nicht an der Maus gehören kann. Wenn der Schwellenwert zu hoch ist, wird die Maus klein und in getrennte Stücke zerfallen kann. In den aufgenommenen Filmen war die optimale Schwelle immer zwischen 20 und 35 (auf einer Skala von 0 bis 255).
      4. Erodieren ¹³ das binärisierte Bild e - mal, dann ¹³ 2e mal aufzuweiten, dann erode wieder e mal, indem Sie die Taste "Erod / Dil" drücken.
         Hinweis: Der Zweck dieser Prozedur ist es, den Schwanz zu entfernen. Für die Auflösung (720 x 480), die verwendet wurde, e = 3 unter allen Umständen gearbeitet.
         Hinweis: Die Software automatisch auf das Vorhandensein einer Hand in das Bild überprüft (während der Aufnahme von Filmen, die Hände werden durch das Bild, winkte den Beginn einer Sitzung, um anzuzeigen). Wenn eine Hand vorhanden ist, wird es ungewöhnlich viele weiße Pixel in dem binärisierten Frame weil die Hand viel größer als eine Maus ist. Die Bedingung für das Vorhandensein einer Hand ist, dass es mehr als 10.000 weißen Pixeln in dem binärisierten Frame. Die Software bestimmt die Anfänge der Sitzungen I, II und III, durch die Frame-Bereich Erfassung, in der Handbewegungen auftreten.
2. In Sitzungen I und II, gehen Sie wie folgt:
   1. Ermitteln Sie die größte zusammenhängende Komponente des Satzes von weißen Pixeln (Klicken Sie auf "LComp"). Hinweis: Der Zweck of ist dieser Schritt zu weißen Pixeln zu beseitigen , die an die Maus nicht gehören, beispielsweise durch die Bewegung der Maus in Stimulus - Sitzung II verursacht. Das größte zusammenhängende Komponente ist in fast allen Frames, die die Maus.
   2. Bestimmen Sie die beiden am weitesten entfernten weißen Pixeln, indem Sie auf "Suchen Ends" (die "Enden" der Maus genannt).
      Hinweis: Die Software stellt die Kontinuität der beiden Enden, das heißt für jedes der Enden in dem ersten Rahmen , an dem der Enden in den nachfolgenden Rahmen sie gehören. Die allgemeine Idee ist, dass, da Frames mit hoher Geschwindigkeit aufgezeichnet werden, können die Enden nicht weit von einem Rahmen zum nächsten fahren, so daß für die korrekte Fortsetzung der Enden von einem Rahmen zum nächsten ist die, die die Summe der Abstände minimiert, dass die Enden bewegen. Siehe die Diskussion für mehr Details.
   3. Bestimmen Sie, welche Ende der Maus die Nase ist.
      1. Bestimmen Sie die Richtung, in der eine Maus bewegt sich durch die Beobachtung, wie der Schwerpunkt (COG)Änderungen von Rahmen (die Bewegung des COG ist die Bewegung der Summe aller Maus Pixel) zu gestalten.
         Hinweis: Die COG eines Satzes von Pixeln p _1, ..., p _n mit den Koordinaten x _1, .., ist x _n definiert durch:
         
         Mäuse in der Regel bewegen sich nach vorne (dh in Richtung ihrer Nase). In einem Abschnitt von mehreren hundert Bildern, ist es immer sehr hohes Vertrauen in den Kopf / Schwanz-Erkennung.
         Hinweis: Die Software automatisch, auf das der detektierten bestimmt endet die Maus bewegt; Dieses Ende ist als die Nase und markiert mit einem roten Kreis in dem Film identifiziert. Wenn die erfasste Nase mit einem roten Kreis in jedem Frame markiert ist, kann der Anwender die Qualität der Erkennung überprüfen.
3. In Session III, gehen Sie wie folgt:
   1. Erkennen beiden größten Komponenten von weißen Pixeln.
      1. Wenn beide sind von akzeptabler Größe für UhrOuse und ihre Schwerpunkte (COG) sind kompatibel mit den Maus COGs des vorherigen Rahmens, betrachten Sie diese beiden Komponenten, die beiden Mäuse.
      2. Betrachten Maus akzeptable Größen, wenn sie sich nicht um mehr als 20% seit dem vorherigen Rahmen geändert haben, und betrachten COGs von zwei aufeinanderfolgenden Frames als kompatibel, wenn ihre Differenz nicht größer als der Abstand ist eine Maus in der Zeit zwischen den Rahmen bewegen kann (dieser Abstand folgt aus der maximalen Mausgeschwindigkeit, die als Teil der Vorbereitungen einer Versuchsreihe durch die Analyse der Bewegung von mehreren einzelnen Mäusen (wie in Einheiten I und II) bestimmt werden kann.
         Hinweis: Wenn die beiden größten Komponenten nicht akzeptable Größen für eine Maus sind, oder die Zähne sind zu verschieden von denen in dem vorhergehenden Rahmen, die Software automatisch erhöht die Binärumwandlungsschwelle bis die beiden größten Komponenten annehmbarer Größe sind und deren COGs sind kompatibel mit diejenigen des vorherigen Rahmens.
   2. Klicken Sie auf die Test-Maus indas erste Bild. Verwenden Sie die Analyse in 2.3.1 sowohl Test- und Stimulus Maus in jedem Rahmen der Sitzung III zu identifizieren.
   3. Identifizieren Sie die Frames in der Sitzung III, in dem die eine Maus sozial den anderen Ansätzen. Hinweis: Die Software diesen Schritt implementiert, indem sie automatisch überprüft, dass der Abstand zwischen den Mäusen weniger als die typische Wechselwirkungsabstand von Mäusen (wir verwenden 2 cm).
   4. Wenn die Software ein kurzes Segment des Films mit dem erkannten Annäherung an den Benutzer spielt, klicken Sie auf eine Schaltfläche, um anzuzeigen, ob dieser Ansatz durch die Test Maus, soziale Vermeidung durch den Test Maus oder weder als soziale Ansatz qualifiziert.
      Hinweis: Schritt 2.3.4 kann automatisiert werden, wenn bekannt ist, welche Maus ist die Test-Maus. Da diese Information verloren geht, wenn die Mäuse einander zu nahe kommen (oder klettern auf der jeweils anderen), und da wir einen Weg gefunden, noch nicht haben, um die Mäuse in einer Art und Weise kennzeichnen, die zuverlässig durch unsere Software erkannt werden kann und tut Auswirkungen auf ihr Verhalten nicht, haben wir kehrten zumanuelle Klassifizierung für jetzt.
4. Zur Auswertung verarbeitet Filme, Last Film mit Load-Taste.
   1. Klicken Sie auf Start Session 1 den ersten Frame der Session angezeigt werden 1 (oder Start Session 2 den ersten Frame der Session 2 anzuzeigen).
   2. Klicken Sie auf Play / Stop zu spielen und zu stoppen Filme.
      Hinweis: Die verarbeiteten Filme Maus mit dem Kopf angezeigt werden und Schwanz mit verschiedenfarbigen Kreisen markiert. Alle Kontaktfreudigkeit Maßnahmen werden auf dem Bildschirm angezeigt und aktualisiert, wenn der Film abgespielt wird.
   3. Export Kontaktfreudigkeit Daten im Excel-Format von "Export" klicken.
   4. Klicken Sie auf "Compile Daten" alle Daten aller Filme zu kompilieren in einem Ordner in eine Datei einzelne Excel.

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt einen Farbrahmen eines Verhaltens Film mit einem leeren Käfig. Die Maus hat in den Käfig eingeführt bisher noch nicht. Die Position der Schalen, (soziale und nonsocial) und die Kompartimentgrenzen überlagert werden. Der Farbrahmen von leeren Käfig ist auf 8 Bit - Graustufen umgewandelt , wie in Abbildung 4 und verwendet als Referenzrahmen gezeigt. Der Referenzrahmen wird von jedem anderen Bild des aufgenommenen Film abgezogen.

Abbil...

Diskussion

Durch die Kombination von Mäusen und automatischen Filmanalyse videotaping haben wir eine erschwingliche, zuverlässige Hochdurchsatz-Screening-Technik erstellt.

Die Genauigkeit der automatisierten Analyse wurde für mehr als 100 Filme mit den Ergebnissen der manuellen Analyse verglichen. In der überwiegenden Mehrzahl von Rahmen (> 99%) von Vollbildern wird die Nase der Maus mit guter Präzision identifiziert. Die meisten der (wenigen) Fehldetektionen haben keine Auswirkungen auf die Kontakt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Plexiglaskäfig	Norva Plastics, Norfolk, VA	Sonderanfertigung	Abmessungen und Layout im Manuskript beschrieben, können je nach Bedarf angepasst werden. Verwenden Sie entspiegeltes Plexiglas zur Erleichterung der Bildverarbeitung
Drahttassen	Küche plus	315	Verwenden Sie eine zur Unterbringung der Stimulusmaus, eine leere
Videokamera	SONY	HDR-PJ790	Kann durch jede Kamera ersetzt werden mit Vergleichbaren Spezifikationen
OpenCV (Bildverarbeitungsbibliothek)	Willow Garage	N/A	Es kann jede moderne Bildbearbeitungsbibliothek verwendet werden.