Summary
Dupuytren hastalığı (GG) avucunun bir fibroproliferatif hastalıktır. Burada, biz üç-boyutlu (3D) kültür sistemi DD kültür rezeksiyon örneklerinde bir protokol mevcut. Bu tür kısa vadeli kültür sistemi 3D yapı korunması ve fibrotik doku moleküler özelliklerini tanır.
Introduction
Dupuytren hastalığı (DD), benign fibroproliferatif hastalık nedeniyle avucunun içinde nodüller ve kord oluşumuna parmakların fleksiyonu kalıcı olur. Hastalık yayılmış Kuzey Avrupa Kafkasyalılar arasında özellikle yüksek olmasına rağmen, hastalığın altta yatan genetik nedenleri 1 bilinmemektedir. DD temel özelliği, tendon ve el ve parmakların avuç derisi arasındaki boşluğu işgal zor bir fibröz doku oluşturan hücre dışı matriks (ECM) proteinleri (örneğin, kolajen), aşırı üretim sürekli ince hareketleri kesintiye el 2, 3. Hastalığın nüks fibrozis 1, 4 nedeni olarak altta yatan genetik değişiklikler göstermektedir. Etkili bir tedavi doğrudan hücresel ve moleküler düzeyde kontrol edilemeyen fibrotik mekanizmaları hedef olabilir.
Fibrozis Bizim son çalışma gelişmesine bizi açmıştıruyuşturucu testi potansiyeli ile insan fibrotik doku kısa vadeli kültürünü tanır yeni 3D kültür sistemi. Bu sistem 2B fibroblast kültürleri sınırlayıcı yaklaşımı aşmak ve fibrozis 5 aracılık TGFβ yolu aktivasyonu ekson atlama elde kısmi aşağı düzenlenmesi için bir rol, tanımlamak için yardımcı olmuştur.
Biz DD hastaların ex vivo insan rezeksiyon örnekleri miyofibroblastlar arasındaki etkileşimi ve çevresindeki ECM 5, 6 çalışma kültürüne bir yöntem geliştirdik. DD bağ dokusu fibrozis çalışma yanı sıra diğer fibrotik hastalıklar, cerrahi eksize histopatolojik analizi dayanır Numuneler, doku ve primer kültürlerinde ya da hücre sıralama prosedürlerin kuruluşundan fibroblastların izolasyonu. Onlar deneyci tarafından hastalık özelliklerine veya terapötik müdahale eksojen manipülasyon izin vermez çünkü bu yaklaşımlar oldukça statik bulunmaktadır. Ek olarak, birincil cell kültürleri kültür koşullarına uyum ve gen ifadesi özellikleri hatta erken geçişleri sırasında, her pasajda üzerine esasen in vivo durumdan farklı eğilimi (geçit 3 arasında ve 6) 7, 8. Biz atık cerrahi malzeme korumak başarmış hastaya özgü özellikleri ve bunların anti-fibrotik veya iltihap-önleyici ilaç bileşimlerinin tarama izin veren bir zaman süresi için ex vivo kültür koşulları.
Sistem DD fibroblastlar gibi diğer hücre tipleri 9 kültürlenmesi, önceden görüldüğü gibi, bağlantı üzerine doku değişimini önlemek, böylece, orta değil plastik doku teması sağlayan bir nitroselüloz zar üzerine dayanır. DD dokulardaki bu proteinlerin, büyük miktarlarda üretim için herhangi kolajen jel veya başka bir ECM protein alt-tabakası, gereklidir. Bu yerli ECM mikroçevresinin ve ciro günah bakımı için avantajlıdırce matriks substrat doku yapısının ve fonksiyonunun 10, 11 arasında önemli bir regülatör bulunmaktadır. Örneğin, bu gibi fibronektin, laminin ve kolajen gibi ECM proteinlerinin yanı Benzer epitel hücreleri 12 apikal-bazal polaritesi için gösterilen fibroblast ön-arka polarite, 13 etkileyebilir . Polarize hücreler, hücre göçü ve gen ekspresyonu, örneğin, zar üzerinde α1β1 integrini erişilebilirlik bir 14 kolajen tip hücre yapışmasını etkilediği tespit dışı moleküllerin asimetrik dağılımına sahiptir. Bu 3D modeli temel amacı yerli mikroçevreyi korumak için olduğundan, hiçbir yapay ECM matris substrat kullanılmıştır.
Özet olarak: reseksiyon örneklerinden eşit steril bir ortamda kesilir ve nitrocellular zarlar üzerine yerleştirilir. Enjeksiyon yoluyla yönetilmektedir tedavi gerekiyorsa onlar membranın yerleştirilmiş sonra dokular enjekte edilir. Tedavi inj ile idare edilecek gerektirmiyorsaection daha sonra, bileşik (% 1 fetal buzağı serumu (FCS),% 1 penisilin-streptomisin (P / S), Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)) kültür ortamına ilave edilir. Daha önce tarif edildiği gibi 5 kültürleri,% 30 sukroz çözeltisi ile işlenmiş doku% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde sabitlenir ve bundan sonra on gün kadar, OCT bileşiği içine gömülmüş ve -80 ° C'de saklandı tutulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, insan araştırma etik kurul LUMC ve AMC yönergeleri takip eder.
1. Cerrahi Prosedür ve Doku Koleksiyonu
Not: Dupuytren kontraktürü cerrahi eksizyon için çeşitli teknikler mevcut olmasına rağmen, mevcut altın standart kısmi fasiyektomi 15 olduğunu. Hastaların çoğu günübirlik cerrahi kliniğinde tedavi edilir.
- Hasta ve anesteziyoloji tercihlerine ve hastanın komorbidite göre genel veya bölgesel anestezi altında ameliyat gerçekleştirin. Bu düşünceler, bu yazının kapsamı dışındadır. Bundan önce anestezi tatmin edici doğrulamak için keskin bir nesne ile cilde temas, insizyon. Kansız bir alanda cerrahi görselleştirme kolaylaştırmak için bir turnike kullanın.
- Steril hazırlıyor ve draping sonra, bir kalem ile beklenen kesi işaretleyiniz. Ya uzunlamasına o büyüteç büyütme altında bir neşter ile cilt insizyonr ek kontraktürlerini önlemek için zikzak kesiler kullanarak ve aynı zamanda yeterli pozlama için izin vermek.
- Makas diseksiyon kullanarak, altta yatan sözleşmeli fasya Palmaris cilt ve cilt altı tabaka ücretsiz. Belirlemek ve hastalıklı kord orta hatta doğru yerinden çünkü parmak nörovasküler demeti korumak. Fibröz doku (nodül ve / veya kordon) özetlenen sonra, bir neşter kullanılarak keskin ve bölgesel (subtotal) o tüketim. Hematom oluşumunu önlemek için işlem sonunda turnike kontrol altında titiz hemostaz gerçekleştirin.
- Cildi kapatmak için, cildin kısmi uzatma elde etmek için ek Z-plasti kullanın.
- Bu çalışmalar fibrotik kablosu, hastalığın en aktif ve hücresel kısmının sadece nodül bölümünü kullanın. Cerrah makroskopik kimlik gerçekleştirmek var. avucunun izole nodüller genellikle öncüleri veya kordon ama onlar genellikle belirtilere neden yok gibi neredeyse hiç, rezeke edilir.Biz rezeksiyon olanlar sözleşmeli parmak bir kordon parçası olan nodüller. Handpalm (Şekil 1A) kordların sert kalın kısmı bu nodüller belirleyin.
- Cerrah doku kaldırdığında, hemen% 10 FCS ve% 1 (P / S) ile takviye edilmiş DMEM ortamı içeren 50 ml'lik bir tüpe steril pensler kullanılarak transfer. Islak buz (4 ° C) bir kutu, bu ortam içinde 2 saatlik bir süre için doku tutulur (örneğin, hücre kültürü tesisine işlem odasından doku nakli).
- Bir sonraki aşama için hazırlarken, ıslak buz (4 ° C) örnekleri tutun. Malzemeler ve hücre kültür odası içinde Preparasyon 10-20 dakika gerektirir.
Araçların, Kültür Orta ve Kültür Ekler 2. Hazırlık
Not: özellikle belirtilmedikçe tüm işlemler, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- DMEM Hazırlama 500 mi,% 10 FCS ve% 1 (P / S) ve filtre s ile desteklenmişterilize. 37 ° C'de orta Prewarm.
- Otoklav forseps, eğri kanatlı Mayo makası, bir çift (uzunluk olarak 150-170 mm) bir steril kap içinde, bir Metzenbaum makas saklayın.
- Laminer akış altında, bir steril 12-yuvalı kültür plakası açın. 12-çukurlu bir tablaya (Şekil 1B, alt panel) her çukuruna bir kültürü eki (0.45 mikron gözenek büyüklüğü, 12 mm çap) koyun.
- Ekin zar üzerinde doğrudan 600 çukuruna pipetle önceden ısıtılmış (37 ° C), kültür ortamı ul olup 12 oyuklu plaka doldurun. Inkübatör (37 ° C,% 5 CO2) (Şekil 1B, üst panel) içine plaka koyun.
- Seçenek olarak ise, bir 24-çukurlu plaka kullanabilir ve ortam 300 ul ekle ile sabitleştirilir. menisküs tabaka sıvı ve membran elemanın alt kısmı arasında meydana getirildiği zaman oyuk başına ortamının hacmi en uygunudur.
Not: kuyunun altındaki orta nitroselüloz Membr boyunca yayılırŞekil 1B (alt panel) şemalarda gösterildiği gibi ane menisküs tabakası oluştu.
- Seçenek olarak ise, bir 24-çukurlu plaka kullanabilir ve ortam 300 ul ekle ile sabitleştirilir. menisküs tabaka sıvı ve membran elemanın alt kısmı arasında meydana getirildiği zaman oyuk başına ortamının hacmi en uygunudur.
3. Doku Hazırlama ve Ex Vivo Doku Kültürü Kurulumu
Not: özellikle belirtilmedikçe tüm işlemler, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- 100 mm Petri tabağına 50 mi borusundan kablosunun nodül parçası aktarın ve önceden ısıtılmış (37 ° C) ortam 10 ml ekleyin. Doku Bütün işlem boyunca sıvı ile temas halinde olduğundan emin olun.
- Metzenbaum makas kullanarak perinodular yağ tabakası çıkarın. Yağ dokusu atın. Forseps ve kavisli uçlu makas kullanımı ile, enine küçük parçalar halinde doku (200 um maksimum kalınlığı) kesildi.
- Laminer kaput içine inkübatör 12-plaka aktarın. Ekin membran (ıslak) şeffaf olduğundan ve bu nedenle ortam maddesi ile temas içinde olan kontrol edin.
- Forseps kullanmadikkatle (doku üzerinde gerginlik geçerli değildir) dış katmanı dokunarak bir doku parçası kaldırın. Doku hava orta interfazda kalır böylece hücre kültürü ucun membran üzerine bir doku parçası yerleştirin. Kültür aynı insert iki doku parçalarının maksimum / kuyu.
- Doku gibi dokusu o orta uzunlamasına temas, membranın üzerine düz olarak yerleştirilir ne membran kapalı yüzer ne de tam orta ile kaplıdır emin olun. Hava kabarcıkları kaçının.
Not: Bu aşamada, büyüme faktörleri ya da ortam ilgi inhibitörlerinin ilave edilmesi de mümkündür; Örneğin, tekrarlamalı ve / veya konsantrasyon eğrisindeki test bileşikleri (A, B, C, D, E). Deney düzgün kurulduktan emin olmak için, normal büyüme koşullarında dokusunun en az 2 kontrol (işlenmemiş) adet mevcuttur. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 3-7 gün için dokular inkübe edin. - Aşırı ekspresyonu ise Lentiviral veya adenoviral yapı ile ya doku enfekte veya e yıkmakbir gen-faiz ihtiyacı xperiments (Şekil 2) yapılması için kullanılır. Forseps kullanarak 35 mm çanak içine 12-plaka bir doku parçası aktarın.
- Yüksek titre virüsü 10 ul maksimum bir hacme sahip kullanın.
- 50 ul PBS seçilmiş virüs 10 ul ihtiva eden yüklü bir ensülin şırınga ile, bir teşhir mikroskopu altında enjeksiyon yapın. Doku merkezine dik iğne yerleştirin.
- Yavaş yavaş şırınga içerik enjekte edilir. Doğrudan iğneyi geri etmeyin. Doku delme, iğne diğer taraftan geçmesi ancak (doku merkezi etrafında) dokusu kendi içinde iğne korumak izin vermeyin.
- 12 oyuklu bir plakaya geri doku transferi kültürü plakası yakın ve inkübatör içine yerleştirin (37 ° C,% 5 CO2).
4. Tüm montaj İmmünofloresan Boyama ve 3D İmar
Not: Tüm yanlısıözellikle belirtilmedikçe prosedürlerinin oda sıcaklığında yapılır. Aşağıda açıklanan tüm montaj immün ve görüntüleme için protokol diğer dokularda 16-19 için kullanılan önceden bildirilen yöntemlerden bir uyarlamasıdır. Tamponlar ve malzeme Tablo 1 ve Malzeme Listesi açıklanmaktadır.
- PBS içeren 2 ml mikrosantrifüj tüplerine kültür plaka transfer dokuları. Dönen bir platform üzerinde PBS çözeltisi 5 dakika boyunca yıkama 2x. Dönen bir platform üzerinde 4 ° C 'de% 4 tamponlu PFA (2 ml mikrosantrifüj tüplerine doku başına 1.5 ml solüsyon), O / N dokuları düzeltildi.
- PFA çıkarın ve 5 dakika her biri için PBS içinde 3x yıkayın.
- Dönüşlü bir platform üstünde oda sıcaklığında 2 saat boyunca% 25 metanol çözeltisi içine daldırma ile dokuların dihidrat. Dönüşlü bir platform üstünde oda sıcaklığında 2 saat süre ile, her çözeltinin bir batırılmış doku ile yavaş yavaş metanol yüzdesi (% 50,% 75,% 100) artış.
- 4 ° C'de DMSO 3 hafta / metanol solüsyonu (permeabilizasyon aşaması) Transfer dokulardaha önce tarif edildiği 18.
Not: Bu aşamada, dokular -20 ° C'de% 100 metanol içinde uzun süreli saklanabilir. - Prosedürü 16, 17 boyanma ile devam; yavaş yavaş dokular (% 75 -50% -25% -0% metanol serisi) rehydrate. Sürekli ajitasyon altında 4 ° C'de oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat süre ile, her rehidrasyon aşamasını gerçekleştirir.
- 4 ° C'de% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 20 DMSO O / N içeren PBS içinde primer antikorlar ile inkübe edin. Anti-α düz kas aktini: PBS ticari stokları kullanarak aşağıdaki oranlarda antikorlar kullanın: (1 500, fare), anti-kollajen tip I (1: 500, keçi), tip III (1, anti-kollajen: 500, keçi).
- 4 ° C'de (değişim PBS solüsyonu 3-4 kez) 48 saat süre ile, PBS içinde iyice yıkayın.
- 1 ile uygun bir ikincil antikor (Alexa 555, anti-fare, Alexa 488, anti-keçi) seyreltin PBS,% 1 (BSA) ve% 20 DMSO ihtiva eden 250 dilüsyon. 4 ° C 'de O / N inkübe edin.
- 4 ° C'de 48 saat süre ile, PBS içinde iyice yıkayın76 C ve nükleer karşı-kuluçkalanması-PRO-3 1 sulandırılmış, son yıkama adımında PBS içinde 500.
Not: Bu-PRO-3 (He-Ne 633 nm lazer çizgi ile) bir uzak-kırmızı ışık DNA boya ve diğer kanallar ile aynı anda görüntülenmesi için bir araya getirilmektedir; Bu durumda kolajen tip I / III tipi kolajen (488 nm), α düz kas aktin (555 nm), TO-Pro-3 (647 nm) yıkanmıştır. - Bir metanol serisi (% 25 -50,% -75%) yavaş yavaş doku kurutmak için dokuların transfer; sabit bir ajitasyon altında 4 ° C'de oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat süre ile, her dehidrasyon adımı gerçekleştirmek.
- Polipropilen tüplere Transfer dokular. Temizle metilsalisilat dokular (kimyasal başlık altında kolu) 18 ya da alternatif kullanım BABB çözümü 19 olarak. Dokular şeffaf hale gelene kadar sabit bir ajitasyon altında oda sıcaklığında inkübe edin. Dağı slayt ve sert seti montaj orta (Şekil 1C, üst panel) ile kapatılmış bir lamel arasında.
- Bir ters konfokal mikro Image örnekleriyüksek NA 63x ve / veya 100X yağ daldırma hedefler (Şekil 1C) ile donatılmış kapsamı.
- Mikroskop üreticisi tarafından sağlanan temizleme solüsyonu ile merceğini temizleyin.
- Objektif lens petrol bir damla uygulayın. Numune üzerinde mikroskop sahnede ve odak numune ile slayt yerleştirin.
- Lazer hatları 488 nm, 514 nm ve 633 nm ile üç-kanal floresan eşzamanlı görüntüleme için mikroskop yapılandırmaları ayarlayın.
- Tek XY görüntüleri veya birden odak düzlemi görüntüleri (Z yığını) (Şekil 3A) edinin. 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirmek için Z yığını artan genişliği kullanın. Yüksek çözünürlüklü görüntü, düşük tarama hızı, ortalama taramalar (≥ 3) sayısını kullanın ve 1.024 x 1.024 piksel çözünürlükte 16-bit görüntüleri elde elde etmek için.
- Z yığını elde edilen görüntüleri analiz: İlk adlandırmak ve görüntü dosyası (xyz) kaydedin. Konfokal mikroskop yazılım programı kullanılarak, maksimum yoğunluk proje yapılandırmaBir 3D içine Z yığını görüntüleri ction görüntüsünü yeniden.
- "Görsellik" ve "3D Projeksiyon" altında tıklayın "Süreç Araçlar", xyz dosyasını seçin. Projeksiyonu (ya da floresan sinyal doymuş ise "Ortalama") yönteminde "Maximum" girin. Tek bir projeksiyon X, Y ve Z Uçakları değiştirmek, ve projeksiyon aleti (Şekil 3B, r1) geçerli değildir için.
- Görüntüleme amacıyla animasyon (konfokal yazılımı) ile 3D projeksiyon oluşturmak için Z yığın görüntüleri kullanın. Xyz dosyasını seçin, Süreç Araçları, "Görsellik" ve "3D Projeksiyon" altında tıklayın.
- "Film Oluştur" butonuna tıklayın. Derece Başlat Rotasyon açısını girin (örneğin, film, Y ekseni başlangıç noktası olarak 0 °) ve "Set Başlat" üzerine tıklayın. Son filmi noktasına (örneğin, 180 ° veya 360 gibi derece End Rotasyon açısı (Y ekseni) girin6; ve) bir tam dönüş için "Set End" üzerine tıklayın.
- Çıkıntının (ya da flüoresan sinyal doymuş olması halinde "Ortalama") 'in bir yöntemi olarak "Maksimum" seçin. 3D rekonstrüksiyon rotasyon için "Çerçeveler sayısı" girin (örneğin, 20 dönmeler veya daha yüksek dönme hızını azaltmak için). "Uygula" üzerine tıklayın. Film ihraç görsel dosyası olarak (örneğin, "avi"), her dönme açısı için bir resim dosyası oluşturur "tiff" dosyası olarak (Ek Film 1) veya ihracat (Şekil 3B; rotasyon r4, r10, r18).
5. Kombine İkinci Harmonik Nesil (Kollajen) ve Kültür sırasında Ex Vivo Doku İki foton Heyecanlı Floresan (elastin) Görüntüleme
Not: özellikle belirtilmedikçe tüm işlemler, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- Inkübatör Transwell plakaları çıkarın ve ti (sabitlenmemiş) tek yerortamının 500 ul ihtiva eden bir 35 mm hücre kültür plakasına ssue parçası.
- Uzun eksen plaka üzerinde düz şekilde yerleştirin doku. Ancak her zaman ıslak değil yüzen doku tutun.
- Doğrudan doku (Şekil 1C) ile temas halinde multiphoton mikroskop su batırılmış objektif yerleştirin.
- 800 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ile görüntü elde edilir ve 371-425 nm'de (SHG, kolajen) ve 474-532 nm (otofloresansı, elastin) (Şekil 3C) arasında yayılan ışığı toplamak. 20X / 1.0 NA su daldırma hedefi kullanarak bir femtosaniye lazer ile donatılmış bir dik konfokal mikroskop iki-foton mikroskopi gerçekleştirin. Süreç konfokal üreticinin yazılımı ile yığınlar.
Not: kollajen moleküllerinin bir yakın kızılötesi lazer ile uyarma farklı derinliklerde yerli kollajen yapıların yüksek kontrastlı görüntüleme oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ex vivo yöntemi, bağ dokusu 3D kültürü de fibrozis ECM ve DD doku oluşturan diğer hücre bileşenleri ve potansiyel diğer türleri arasındaki ilişkiyi anlamak için kolay ve sağlam bir set up sistemi olduğunu. Ayrıca bu sistem, güvenilir bir yöntem, farklı hücre tipleri ve fibrotik yük 20 üzerindeki etkileri üzerinde bileşiklerin etkisini test etmek için izin verir.
dupuytren fibroz türetilen cerrahi atık maddelerin toplanması ile ilgili adım kültür odası ve analiz araçları örnekleri düzeneği Şekil 1 'de sunulmuştur. Şekil 1' de gösterildiği gibi, bu yöntem, örneğin büyük ekranlar madde aranması için deneysel bir araç sağlar, antifibrotik ilaç bileşikleri, aynı zamanda, gerçek zamanlı ve yeniden üretilebilir bir şekilde ECM modelleme çalışması. Fibrotik kablosunun nodüler parçaları eşit dilimlenmiş ve Transwell plakaları yerleştirilir; Her bir doku parçasının (100-200 um) kültür tablası (0.45 mikron gözenek büyüklüğü, 12 mm çapında) bir membran üzerine kültürlenir. Kültür ortamı zarından doku ile temas sağlayan, alt bölmeye eklenir. Ortalama 30-40 doku parçaları ilaç büyük ölçekli tarama sağlayan tek bir rezeksiyon numune, elde edilebilir; Bileşikler, küçük moleküller ya da büyüme faktörleri. Konsantrasyon ve / veya uyuşturucu zamana bağımlı bir etki ele deneyler mümkün bulunmaktadır.
Şekil 2'de gösterildiği gibi, gen ekspresyonu adeno kullanımı ile (aşın / demonte) manipüle edilebilir / lentivirüsler doğrudan dokuya enjekte edilir. Floresan etiketli viral transdüksiyon enjeksiyonu ile taze kalın doku örneklerinde yapılır. Doku 24-48 saat sonra enjeksiyon için kültür içinde kalır ve daha sonra, sabit bir gömülü ve 0.7 um cryosections içinde bölümlere ayrılmakta. Ayrıca, farklı bileşikler veya kültür koşulları doku parçası etkisini analiz etmekkonfokal mikroskobu (Şekil 3A-B) yapılır Şekil 3. kalın dokuların 3D görüntüleme gösterildiği gibi ler sabit ve bütün montaj bağışıklık tabi tutulur. Başka bir yöntem kültürü muhafaza dokularda canlı 3D görüntüleme ise; endojen kollajen remodeling ikinci harmonik üretimi (SHG) (Şekil 3C) tarafından taze disseke, sabit olmayan doku parçaları gerçek zamanlı incelenmiştir. Potansiyel anti-fibrotik ilaç etkisi, aynı zamanda, farklı zaman noktalarında aynı doku bölgelerinde takip edilir. Kalın doku kollajen yapıları dik multiphoton mikroskop sonohisterografiyi kullanarak görüntülü. Görüntüleme sırasında, doku örnekleri bir ortama yerleştirilir ve bir su daldırma amacı ile görüntülü. Görüntü alındıktan sonra, doku kültür sistemine geri transfer edilebilir. Etkileri, in vitro hücre-esaslı tahliller üzerinde bir avantaj sağlanmaktadır hücre ve hücre dışı ortamı seviyesinde incelenebilir. Ana için birden fazla olasılık vardırBöyle sabit doku kesitlerinin histoloji, tüm montaj ve immunfloresan konfokal mikroskopi 3D rekonstrüksiyon görüntüleme, SHG ve endojen kollajen ve elastin iki foton heyecanlı floresan görüntüleme gibi biyolojik etkileri erimesi. SHG görüntüleme avantajlarından bazıları hiçbir antikor boyama hazırlama gerekli olduğunu ve aynı doku (kültür koşullarında zaman kursu) birden çok kez görüntülenmiş olabilir ki, taze, sabit olmayan doku kullanımı vardır. SHG ve iki-fotonlu uyarılmış floresan görüntüleme kas ve bağ doku, 21-23 ve lekesiz arter duvar yapısının 24 için daha önce tarif edilmiştir, ancak burada dupuytren fibrozis çalışma için alternatif bir uygulama sunulmuştur.
Ex vivo 3D doku kültürü sistemi 1. Düzeni Şekil. (A) DD kalıcı fleksiyon kontraktürü. Bu rakam, bir önceki çalışmada 5 modifiye edilmiştir. Kurmak ex vivo kültür (B) Örnek. ECM birikimi analizi için kullanılabilecek deneysel yaklaşımlar (C) Örnekler. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Bütün montaj dokusunda Şekil 2. kanıtı ilke-ex vivo olarak, viral aracılı gen sentezleme modülasyonu (A). Çekirdeklerine-PRO-3 boya (mavi) ile görüntülendi. Barlar 75 mikron. (B) floresan Doğrudan görselleştirmeboya DsRed (kırmızı), Adenovirüs ifade-DsRed ile enjeksiyon sonrası. Barlar 75 mikron. (C) Birleştirilmiş görüntü (mavi nükleer boyama, kırmızı DsRed). 24 saat içinde hücrelerde adenoviral teslim gösteren DsRed sitoplazmik lokalizasyonu. Barlar 75 mikron. (DF) Lentiviral iletimi. (D) Çekirdekler TO-PRO-3 boya (mavi) ile görüntülendi. Barlar 25 um. (E) doku kesitlerinde GFP doğrudan görselleştirme (yeşil), lenti GFP parçacıkları ile enjeksiyon sonrası. Lenti-GFP hücre içi lokalizasyonu gösteren Barlar 25 mikron. (F) D Birleştirilmiş görüntü ve E. Barlar 25 um (GH) Örnek ("A" olarak belirtilmektedir), söz konusu gen karşı lentivirüs aracılı Nakavt;. (G) lentivirüs taşıyan karıştırılmış shRNA sekansıdokuya ex vivo olarak enjekte edilmiştir. ("A" olarak belirtilmektedir), ilgili protein için immünofloresan boyama kırmızı ile gösterilmiştir. Barlar 75 mikron. (H) lentivirüs taşıyan gen A-ShRNA dizisi dokuya ex vivo enjekte edildi. Protein "A" için İmmünofloresan boyama. Çekirdekler TO-PRO-3 boya ile boyanır. Barlar 75 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. 3D rekonstrüksiyon görüntüleme, ikinci harmonik üretimi ve iki-foton heyecanlı floresan görüntüleme. Konfokal mikroskobu ile (A) 3D görüntüleme. Farklı doku derinliklerinde (z = 50-200 mikron) boyunca odak düzlemleri Tek (xy) görüntüler. Tüm montaj immunofluorescence boyama; miyofibroblast işaretleyici α-düz (αSMA kırmızı) kas aktin, nükleer boyanma (TO-PRO-3, mavi). Barlar:. "R1", "r4", "r10", "R18" olarak gösterilen farklı 3D rotasyonlar panel A'da belirtildiği gibi 500 mikron (B) 3D ham görüntüleri (Z yığınını 389 mikron) görüntü yeniden. Barlar 500 mikron. Taze, kalın doku parçaları ikinci harmonik üretimi (SHG) görüntüleme (sol panelde, yeşil) (C) Endojen kollajen içeriği modelleme. ECM elastin yapıların İki foton heyecanlı floresan (TPF) multiphoton mikroskobu (orta panelde, kırmızı) tarafından ele geçirildi. Kolajen (yeşil) ve elastin (kırmızı) (sağ panel) Birleştirilmiş görüntü. Barlar:. 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Ek Film 1. Represenniteliksel 3D Dupuytren tüm montaj dokusunun yeniden filmi tüm montaj immunofloresan boyama için yedi günlük ex vivo kültür ve işlendikten sonra yapıldı DD doku Konfokal görüntüleme.; miyofibroblast işaretleyici α-düz (αSMA kırmızı) kas aktin, nükleer boyanma (TO-PRO-3, mavi). Ölçek çubuğu = 500 mikron. Çerçeveler = 20. Z = 389 mikron. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) | 8.00 g NaCI (0.137 M) 0.20 gr KCI (2,7 mM) 0.20 gr KH 2 PO 4 (1.1 mM) 0.10 g MgCI2 · 6H H2O (0.5 mM) 2.16 g 2 Na HPO 4 · 7H H2O (8,1 mM) 0.10 g susuz CaCl2 (0.9 mM) H2O 1 L |
| , Çeker ocak içinde, 100 ml fosfat tamponlu tuzlu suda (PBS) ihtiva eden bir şişe içinde paraformaldehid 4 g çözülür balon kapsamaktadır. Bir ısıtma / karıştırma bloğu üzerinde şişesi yerleştirin ve yavaşça çözüm karıştırın. Bu maksimum 65 ° C'ye ulaştığında yani sıcaklığını izlemek. Aşırı ısıtma kaçının. Paraformaldehit çözülmüş ve çözelti berrak görünür sonra, ısı kapatın ama karıştırmaya bırakın. Güvenlik nedenleriyle dokunmayın. Soğutma izin verin. , Kısım soğutulmuş ve -20 ° C derin dondurucuda veya maksimum bir hafta için 4 ° C buzdolabında uzun vadeli saklayın. | |
| BSA (bovin serum albümin),% 10 (ağ / hac) | 100 mi H2O içinde 10 g BSA çözündürün Filtre 0.22 mikron filtre bağlayıcı bir düşük protein kullanılarak sterilize. 4 ° C'de saklayın. |
| DMSO / metanol (% 20) permeabilizasyon çözeltisi | Ile, dimetil sülfoksit karıştırınMetanol (1: 4 analoji, toplam hacim 100 ml) eklenmiştir. |
Tablo 1. Tampon çözümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ex vivo insan bağ dokusu kültürleme en kritik adımlar canlılığı sağlamak için cerrahi müdahaleden sonra dokusunun hemen kullanımı vardır; Doku her zaman orta ya da tuzlu su çözeltisi içinde kalmalıdır; steril kültür korumak; doku enine kesitleri en fazla 200 mikron kalınlığına sahip olmalıdır; Doku ortamı ile temas içinde olan, ancak tamamen su olmadığında, ex vivo kültür sistemi kurmak en uygunudur. Orta sadece küçük bir hacim içinde transwell dış bölme (örneğin, 500-600 ul 12-kuyu başına levha yüzey alanı) üzerine eklenmelidir.
Dupuytren en türetilen Bağ dokusu gibi kollajen, proteoglikan ve elastin gibi ECM proteinleri içeriği yüksek olan zor bir yapıda dolaşmış olan; Bu özellikleri ve ek nedeniyle nedeniyle miyofibroblast kontraktürü bu dokuya kesmek için zor olabilir. Uygun cerrahi aletleri kullanmak önemlidir; bl kavisliküçük doku parçaları kesmek için eşit kalınlıkta ve küçük cerrahi makas daha büyük parçalar kesme makası Mayo aktarıldı (örneğin, daha fazla doku parçaları kullanım 24-kuyu plakaları gerekiyorsa).
DD çalışma için Yöntemleri histopatolojik eksize fibrotik numune analizleri, ya da birincil fibroblastların türetme vardır. Yapılır, hasta malzemeden Hücre türetme iki yolu olduğunu; yöntemlerin birinde, doku parçaları fibroblast sonucudur olana kadar birkaç hafta plastik kültür plakaları içinde kültürlenir. İkinci yöntem, kolajenaz ve tripsin ile doku enzimatik tedavisidir. İlk yöntem nedeniyle kültür koşulları, zaman alıcıdır, fibroblast özellikleri değiştirilmiş olan ve aynı hücre çizgisinin geçişleri arasındaki geçiş bağımlı farklılıklar bulunmaktadır. enzimatik yöntem hızlıdır ve, ancak, doğal ECM üzerinden bu hücrelerin in vitro olarak bakım, in vivo yansıtmaz hücre tahlilleri sıralama için kullanılabilir 25 sinyal (yani mechanoregulation ve mekanotransdüksiyonu) etkiler. Zaman 26 kısa sürede MFBS içinde αSMA liflerinin sökme germe sonuçlarının kaybı. ex vivo αSMA bolluğu 27, 28., Teknik ve biyolojik değişkenlik İlişkin birleşmesiyle yararlanabilir, bizim yöntem tekrarlanabilir (canlılık, ECM ağı) nedeniyle kültür kısa sürede doku değişime daha az eğilimli. Örneğin, fibroblast akıbet yöntemi biyokimyasal değişikliklere neden olabilecek birkaç hafta gerektirir (örneğin, genetik mutasyonlar, replikatif yaşlanma birikimi). Ancak, hasta-spesifik genetik özellikleri ve biyolojik değişkenlik DD araştırma alanında kendi başına zorluklar ve güncel yöntemlerin herhangi biri ile ele alınamaz.
Bu protokol gösterildiği gibi, cerrahi müdahaleden sonra fibrotik DD örnekleri doğrudan doğruya ex-vivo 3B sistemin kültürlenmiş ve / veya ani olarak dondurulmuştur bulunmaktadır. Bilimsel söz bağlı olarak, doku modifikasyonu büyüme faktörleri, kimyasal terkipler, h eklenmesiyle mümkündürgen teslimat, antisens oligonükleotidler ve miRNA'lar irus-aracılı. Bileşikler, ortam içinde veya 3D kültür odası içinde dokusunda lokal mikroenjeksiyon ile temin edilebilir. 3 sonra, doku, hücre izolasyonu ve FACS analizi ya da total RNA ve sentezleme profili analizi için proteinlerinin izolasyonu gibi histolojik analiz için işleme için homojenize edilebilir kültür 7 güne kadar verilir. lifli proteinler (αSMA, kollajen tip I ve II, fibronektin), kordon ve elyaflı ağ kıvamında nodül kısmının doku mimarisinin bir durumu önce ve tedaviden sonra değerlendirilir. Kültür sırasında ECM düzenlenmeleri izlemek için biz sonohisterografiyi (kollajen) ve iki-foton heyecanlı floresan (elastin) görüntüleme birleştirdi.
dışı düzenlenmeleri daha sonra sayısal veya görüntü ölçümü yazılımı kullanılarak modellenebilir. Bu parametreler fibrozis veya Molec uyuşturucu etkileri bir göstergesidirkültür sırasında uyarılan edilmiştir ular değişiklikler. Ayrıca ECM diziler de etkileri daha iyi bir bakış oluşturmak için tek dilimler yapılabilir. Genel fibrozis ex vivo çalışma sağlar sağlam bir sistem kurduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
3D organ kültürü: Yazarlar Dupuytren hastalığı için bir Patent Başvurusu bulundular. # GB1307200. Ticari lisans ve hizmet sözleşmeleri mevcuttur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
