Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung die zelltypspezifische Genexpression im Hirngewebe von Ratten untersuchen

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik zu verwenden, um bestimmte Arten von Nervenzellen für die anschließende Analyse der zelltypspezifischen Genexpression, epigenetischen Markern und/oder Proteinexpression zu sortieren.

Abstract

Das Gehirn besteht aus vier primären Zelltypen, darunter Neuronen, Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten. Obwohl sie nicht der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Gehirn sind, sind Neuronen aufgrund ihrer direkten Rolle bei der Beeinflussung des Verhaltens die am häufigsten untersuchten dieser Zelltypen. Auch andere Zelltypen im Gehirn beeinflussen die neuronale Funktion und das Verhalten über die von ihnen produzierten Signalmoleküle. Neurowissenschaftler müssen die Wechselwirkungen zwischen den Zelltypen im Gehirn verstehen, um besser zu verstehen, wie sich diese Wechselwirkungen auf die neuronale Funktion und die Krankheit auswirken. Bisher ist die gebräuchlichste Methode zur Analyse der Protein- oder Genexpression die Homogenisierung ganzer Gewebeproben, in der Regel mit Blut und ohne Berücksichtigung des Zelltyps. Dieser Ansatz ist ein informativer Ansatz zur Untersuchung allgemeiner Veränderungen der Gen- oder Proteinexpression, die die neuronale Funktion und das Verhalten beeinflussen können. Diese Analysemethode eignet sich jedoch nicht für ein besseres Verständnis der zelltypspezifischen Genexpression und der Wirkung der Zell-zu-Zell-Kommunikation auf die neuronale Funktion. Die Analyse der Verhaltensepigenetik ist ein Bereich mit wachsendem Schwerpunkt, der untersucht, wie sich Modifikationen der Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Struktur auf die langfristige Genexpression und das Verhalten auswirken; Diese Informationen sind jedoch möglicherweise nur relevant, wenn sie unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Abstammungslinie und damit epigenetischer Marker, die auf bestimmten Genen einzelner neuronaler Zelltypen vorhanden sein können, zelltypspezifisch analysiert werden. Die im Folgenden beschriebene Technik der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) bietet eine einfache und effektive Möglichkeit, einzelne Nervenzellen für die anschließende Analyse der Genexpression, der Proteinexpression oder epigenetischer Modifikationen der DNA zu isolieren. Diese Technik kann auch modifiziert werden, um spezifischere neuronale Zelltypen im Gehirn für eine anschließende zelltypspezifische Analyse zu isolieren.

Introduction

Der Zweck des unten beschriebenen Protokolls besteht darin, einzelne Zelltypen aus einer heterogenen Population von Nervengewebe zu isolieren, um anschließend die zelltypspezifische Genexpression, die Proteinexpression oder sogar epigenetische Marker zu analysieren. Das Gehirn besteht aus vielen Zelltypen, die von unterschiedlichen Vorläuferzellen abstammen und zelltypspezifische Eigenschaften und Funktionen aufweisen. Trotz dieser Unterschiede können diese unterschiedlichen neuronalen Zelltypen ähnliche Rezeptoren und intrazelluläre Signalmoleküle exprimieren, was die Analyse dieser allgegenwärtigen Proteine mit herkömmlichen Methoden schwierig macht, sie zu messen oder zelltypspezifisch zu interpretieren. Neurowissenschaftler müssen die Funktion und Aktivierung dieser unterschiedlichen Zelltypen im Gehirn identifizieren und herausfinden, wie sie das Verhalten individuell beeinflussen können, da dies letztendlich der erste Schritt zur Identifizierung spezifischerer Medikamente und therapeutischer Ziele für neurologische und neuropsychiatrische Erkrankungen sein wird. Trotz dieses übergeordneten Ziels der neurowissenschaftlichen Forschung kann es schwierig sein, einzelne neuronale Zelltypen aus dem Gehirn für die Analyse der Gen- oder Proteinexpression, die Aktivierung von Signalmolekülen oder die Modifikation epigenetischer Marker auf der DNA zu isolieren. Von den derzeit verwendeten Techniken kann die Immunhistochemie die Expression von Proteinen zelltypspezifisch identifizieren, wenn sie mit einer zusätzlichen Färbung eines zelltypspezifischen Markers kombiniert wird, obwohl dies auf spezifischen Antikörpern beruht, die die interessierenden Proteine richtig färben können, und es kann schwierig sein, sie zu quantifizieren. Durch die In-situ-Hybridisierung kann die spezifische Lokalisation von Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) in einzelnen Zellen des Gehirns identifiziert werden, aber dies ist ein mühsamer Prozess, der auch die Co-Analyse bestimmter Zelltypen einschränkt und nur die Analyse eines oder vielleicht einiger weniger Gene von Interesse ermöglicht. Bei der Laser-Capture-Mikrodissektion wird ein Laser verwendet, um Subpopulationen von Zellen zu isolieren, die mittels Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Der Zeitaufwand dieses Prozesses und die relativ geringe Ausbeute können jedoch die anschließende Analyse von Proteinen oder mRNA-Spiegeln erheblich einschränken, insbesondere wenn die Expression dieser Moleküle von vornherein gering ist. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine relativ neue Technik im Bereich der Neurowissenschaften, um einzelne Zelltypen aus dem Gehirn zu isolieren, um anschließend die Genexpression¹ und/oder epigenetische Ziele² zu analysieren. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um bestimmte Arten von Nervenzellen für die anschließende Analyse der zelltypspezifischen Genexpression, der Proteinexpression oder epigenetischer Marker zu sortieren. FACS wird seit Jahrzehnten in einer Reihe von medizinischen Forschungsbereichen wie Krebs und Immunologie eingesetzt, um verschiedene Zellen auf der Grundlage physikalischer oder biochemischer Eigenschaften zu zählen und zu sortieren³. Darüber hinaus wurde die Durchflusszytometrie klassischerweise verwendet, um die Proteinexpression pro Zelle unter Verwendung spezifischer Antikörper zu analysieren. Das im Folgenden beschriebene Verfahren nutzt die Vorteile klassischer Durchflusszytometrie-Techniken, um einzelne Zelltypen für die anschließende Analyse molekularbiologischer Endpunkte zu isolieren. Das Durchflusszytometer kann mehrere tausend Zellen in einer Sekunde analysieren, was es zu einer schnellen und effizienten Alternative zu den oben beschriebenen Techniken macht. Darüber hinaus können Zellen auf der Grundlage der zellulären Expression eines bestimmten Proteins (z. B. eines Neurotransmitterrezeptors) oder einer Kombination von zwei oder mehr Proteinen (Kolokalisation mehrerer Proteine in einem bestimmten Zelltyp) isoliert werden. Dies ermöglicht es dem Nutzer, sehr selektive neuronale Zelltypen anhand ihrer molekularen Eigenschaften zu isolieren, um ihre Funktion im Gehirn zu identifizieren.

Um FACS durchzuführen, werden neuronale Zellen in eine Einzelzellsuspension vorbereitet, die durch eine Durchflusszelle geführt wird, die die Zellen trägt und ausrichtet, so dass sie zur Analyse in einer Reihe durch einen Lichtstrahl und Laser geleitet werden. Ein Computer erfasst die Daten jeder Zelle und zeichnet sie in einem Histogramm auf, um die angegebenen Parameter (Größe, Granularität und Fluoreszenz) zu analysieren. Basierend auf diesen Parametern können die Zellen sofort in separate Röhrchen sortiert werden, um sie wieder zu sammeln und anschließend an einem beliebigen Endpunkt zu analysieren. Das unten beschriebene Protokoll verwendet drei Antikörper zur Sortierung von Neuronen (unter Verwendung eines Thymozyten-Antigens 1, eines Thy1-Antikörpers), Astrozyten (unter Verwendung eines glialen Glutamattransporters, eines GLT1-Antikörpers) und Mikroglia (unter Verwendung eines Clusters von Differenzierungsmolekülen 11B, CD11b-Antikörper). Dieses Protokoll kann wie unten beschrieben verwendet oder mit unterschiedlichen Antikörpern modifiziert werden, je nachdem, welchen Zelltyp man für seine eigenen Experimente isolieren möchte.

Es gibt einige Vorbehalte, die bei der Bestimmung, ob dieses Protokoll für bestimmte Experimente geeignet ist, zu berücksichtigen sind. Ein großer Vorbehalt kann den spezifischen Zelltyp betreffen, den man isolieren möchte. In diesem Protokoll werden drei Antikörper als extrazelluläre Antikörper verwendet, die es dem Experimentator ermöglichen, die Zelltypen während des Färbevorgangs intakt zu halten und so die Integrität der RNA, DNA und Proteine im Inneren zu erhalten. Es ist möglich, dass man einen bestimmten neuronalen Zelltyp mit einem Antikörper isolieren möchte, der ein Protein identifiziert, das nur in dieser bestimmten Zelle exprimiert wird. Zum Beispiel könnte man dopaminerge Neuronen mit einem Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase isolieren oder Acetylcholin-Neuronen mit einem Antikörper gegen Cholinacetyltransferase isolieren. Diese Proteine sind intrazellulär und würden daher eine Fixierung und Permeabilisierung der Zellmembran für die anschließende Färbung mit den entsprechenden Antikörpern erfordern. Obwohl dies bereits vor ^4,5 durchgeführt wurde, kann dieser Prozess die Ausbeute an RNA oder DNA aus diesen permeabilisierten Zellen erheblich verringern. Ein weiterer Nachteil kann sein, dass nicht alle Antikörper für FACS geeignet sind. Zum Beispiel kann man derzeit einen Antikörper verwenden, der sehr gut für Western Blot funktioniert, eine Technik, die die Denaturierung von Proteinen erfordert. Dieser Antikörper ist möglicherweise nicht notwendigerweise für die Identifizierung dieser Zelltypen mittels FACS geeignet, da die Proteine an keinem Punkt dieses Protokolls denaturiert sind und der Antikörper daher möglicherweise keine Möglichkeit hat, an sein inhärentes Antigen zu binden. Die Unternehmen stellen Spezifikationsblätter zur Verfügung, in denen die Anwendungen aufgeführt sind, für die ein Antikörper zugelassen wurde. Wenn ein Antikörper nicht für die Durchflusszytometrie zugelassen ist, sollte dies nicht davon abhalten, dieses Protokoll mit einem bestimmten Antikörper auszuprobieren. Man sollte sich jedoch darüber im Klaren sein, dass es nicht garantiert ist, dass es für FACS funktioniert. Ein dritter Vorbehalt dieses Protokolls hat mit der Anzahl der Zellen zu tun, die man zu isolieren versucht. FACS ist eine ausgezeichnete Technik, um selbst aus einem kleinen Stück Gewebe so viele Zellen wie möglich zu gewinnen, aber es ist auch möglich, dass, wenn man eine relativ spärliche Population von Zellen aus einer relativ kleinen Gehirnregion isolieren möchte, die Ausbeute eines Tieres von Natur aus gering ist. In diesem Fall kann es erforderlich sein, das Hirngewebe einiger weniger Tiere derselben Behandlungsgruppe zu bündeln, um die für die anschließende Analyse erforderliche Anzahl von Zellen zu erhalten. In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung wurde jedoch die gengezielte Voramplifikation von cDNA für die anschließende Analyse der Genexpression von einer kleinen Anzahl aktivierter Neuronen (5-6%) aus einer größeren Gruppe sortierter Neuronen verwendet, was darauf hindeutet, dass es möglich ist, die Genexpression selbst von kleinen Untergruppen von Nervenzellen zu analysieren, ohne eine große Anzahl von Tieren zu bündeln⁶Ein letzter Nachteil dieser Technik ist, dass man Zugang zu einem Zellsortierer haben sollte, der nicht zu weit entfernt ist. Der Zellensortierer ist eine komplizierte Maschine, die eine umfangreiche Schulung erfordert, um sie richtig zu verwenden. Daher werden diese Maschinen oft von einem qualifizierten Techniker in einer Kernanlage bedient. Darüber hinaus besteht das Ziel dieses Verfahrens darin, das Nervengewebe zu dissoziieren, es für spezifische Antikörper zu färben und diese Proben innerhalb kurzer Zeit (vielleicht einen halben Tag) sofort zu einem Sortierer zu bringen. Dieser Zeitrahmen wird dazu beitragen, das Überleben und die Ausbeute isolierter Zellen zu erhöhen und die Integrität der Zellen für die nachfolgende Verarbeitung und Analyse zu erhalten. Wenn alle oben beschriebenen Parameter erfüllt sind, ist FACS eine hervorragende Methode, um die zelltypspezifische Expression von Genen und Proteinen aus Nervengewebe zu analysieren.

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Delaware und dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt.

Protocol

1. Vorbereitung für die Gewebeentnahme (15 – 30 min)

1. Brennpolieren Sie drei Sätze Pasteur-Pipetten aus Glas mit abnehmendem Durchmesser und nummerieren Sie sie mit "1" = ca. 1 mm Durchmesser, "2" = ca. 0,75 mm Durchmesser und "3" = ca. 0,50 mm Durchmesser.
2. Resuspendieren Sie das lyophilisierte Enzym A mit dem gesamten Puffer A gemäß dem Protokoll, das mit dem Neural Dissociation Kit geliefert wird (siehe Materialtabelle). Nicht wirbeln. Die Lösung wird in 50 μl Aliquote aliquotiert und zur späteren Verwendung bei -20 ºC gelagert.
3. Stellen Sie 1 l Myelinentfernungspuffer und einen Vakuumfilter für die Sterilisation her [Myelinentfernungspuffer = 1.000 ml 0,1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 2 ml 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 10 g Rinderserumalbumin (BSA)].
4. Schneiden Sie die Nylon-Netzfolie in kleine 1 x 1 Zoll (2,5 x 2,5 cm) große Quadrate, die zum Filtern von Zellresten verwendet werden, und autoklavieren Sie sie in einem kleinen Becherglas, das mit Aluminiumfolie bedeckt ist.
5. Bereiten Sie 1 l Waschpuffer vor [Waschpuffer = 1.000 ml 0,1 M PBS, 2 ml 500 mM EDTA und 10 g BSA].

2. Gewebeentnahme

1. Schalten Sie das Wasserbad auf 37 ºC ein.
2. Bereiten Sie Puffer X aus dem neuralen Dissoziationskit vor, indem Sie Beta-Mercaptoethanol zu Puffer X bis zu einer Endkonzentration von 0,067 mM hinzufügen (für 4 Proben fügen Sie 13,5 μl 50 mM Beta-Mercaptoethanol zu 10 ml Puffer X hinzu).
3. Bereiten Sie Enzymmischung 1 vor, indem Sie für jede Probe 50 μl Enzym P mit 1.900 μl Puffer X mischen, wie im Protokoll für das Neural Dissociation Kit beschrieben. Mischen Sie beispielsweise für 4 Proben 200 μl Enzym P mit 7.600 μl Puffer X.
4. Stellen Sie Buffer X bei 37 ºC in das Wasserbad.
5. Geben Sie 2 ml kalte Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) (ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺) in eine Vertiefung einer sterilen 6-Well-Kulturplatte für jede Probe, die entnommen wird, und bewahren Sie sie für die Gewebedissektion auf Eis auf.

3. Gewebedissektion (45 min – 1 h)

1. Injizieren Sie dem Tier eine angemessene Menge Euthanasielösung (handelsübliche Barbituratlösung, z. B. Euthasol) gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und perfundieren Sie das gesamte Blut mit kalter 0,9%iger Kochsalzlösung.
   1. Verabreichen Sie Ratten eine Überdosis Euthanasielösung.
   2. Überwachen Sie die Anästhesie über die Atmung und durch Zehenkneifen. Wenn das Tier ausreichend betäubt ist (keine Reaktion auf das Zehenkneifen und tiefes, langsames Atmen), kann die Ratte perfundiert werden.
   3. Um die Ratte zu durchbluten, schneide die Brusthöhle mit einer Hochleistungsschere auf. Schneiden Sie das Zwerchfell, um den Zugang zum Herzen zu ermöglichen. Schneiden Sie die Rippen an beiden Seiten bis zum oberen Rand der Brust ab, um vollen Zugang zum Herzen zu ermöglichen. Zu diesem Zeitpunkt kann der Brustkorb mit einem Paar Hämostaten zur Seite gehalten werden.
   4. Führen Sie eine Herzperfusion durch, indem Sie eine 18-G-Nadel (für erwachsene Ratten), die an einer elektrischen Pumpe befestigt ist, in den linken Ventrikel des Herzens einführen. Die Pumpe saugt kalte 0,9%ige Kochsalzlösung auf.
   5. Schneiden Sie dann den rechten Vorhof mit einer kleinen Schere auf, damit das Blut und das flüssige Perfusat aus dem Körper abfließen können.
   6. Perfundieren Sie Ratten mit ca. 10 ml (für erwachsene Ratten) 0,9 % Kochsalzlösung, um alle peripheren Immunzellen und -faktoren zu entfernen.
2. Präparieren Sie den gewünschten Teil der Hirnregion mit sterilen Rasierklingen und entsprechender Dissektion, dann legen Sie die Gewebestücke ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ in das kalte HBSS.
   HINWEIS: Das Protokoll erfordert HBSS ohne Ca²⁺ und^{Mg 2+} in den frühen Schritten des Protokolls, da diese Ionen die für die neuronale Dissoziation erforderlichen Enzyme stören können.
3. Nachdem alle Gewebeproben entnommen wurden, kehren Sie zur Gewebeaufbereitung auf die Reinbank oder die sterile Kulturhaube zurück.

4. Neuronale Dissoziation (1 Std.)

1. Würfeln Sie jede Gewebeprobe mit sterilen Rasierklingen auf dem Deckel der 6-Well-Kulturplatte in kleine Stücke. Dieses Protokoll wurde für Gewebeproben von ca. 30 - 100 mg verwendet, ist aber für Gewebeproben von bis zu 400 mg zugelassen. Bei Gewebeproben mit einem Volumen von mehr als 400 mg müssen die Reagenzvolumina entsprechend hochskaliert werden.
2. Verwenden Sie 1 ml frisches HBSS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺, um die gewürfelten Gewebestücke mit einer Pipette in ein steriles 2-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Die Schritte 4.1 und 4.2 werden für alle Proben wiederholt, bis alle Proben in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführt wurden.
3. Die Proben werden bei 300 x g für 2 min bei RT zentrifugiert und mit Überstand aspiriert.
4. Jede Probe wird mit 1.900 μl warmem Enzyme Mix 1, wie in den Schritten 2.2 und 2.3 hergestellt, zugegeben und die Röhrchen verschlossen.
5. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang im 37 ºC heißen Wasserbad und drehen Sie die Röhrchen mehrmals alle 5 Minuten um, um die abgesetzten Gewebestücke wieder zu suspendieren.
6. In der Zwischenzeit bereiten Sie Enzymmischung 2 vor, indem Sie 20 μl Puffer Y mit 10 μl aufgetautem Enzym A mischen (für 4 Proben mischen Sie 80 μl Puffer Y mit 40 μl aufgetautem Enzym A).
7. Geben Sie 30 μl Enzymmischung 2 in jede Probe und invertieren Sie sie vorsichtig. Nicht wirbeln.
8. Dissoziieren Sie jede Gewebeprobe mit der Pasteurpipette "1" und reiben Sie sie 30 Mal auf und ab.
9. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang in einem 37 °C heißen Wasserbad. Drehen Sie die Röhrchen mehrmals alle 5 Minuten um, um die abgesetzten Gewebestücke wieder zu suspendieren.
10. Dissoziieren Sie jede Gewebeprobe mit der Pasteur-Pipette "2" und reiben Sie sie 30 Mal auf und ab. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
11. Dissoziieren Sie jede Gewebeprobe mit der Pasteurpipette "3" und reiben Sie sie 30 Mal auf und ab. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
12. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang in einem 37 ºC heißen Wasserbad; drehen Sie die Röhrchen mehrmals alle 5 Minuten um, um die abgesetzten Zellen wieder zu suspendieren.
13. Tragen Sie eine einzellige Suspension auf einen 80-Mikron-Zellstamm auf, der auf ein 15-ml-Falcon-Röhrchen gelegt wird, um alle großen Schmutzpartikel zu entfernen, und waschen Sie den Filter und die Zellen mit 10 ml HBSS (mit Ca²⁺ und Mg²⁺), um die Enzymreaktionen zu stoppen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis jede Probe in ein sauberes 15-ml-Falcon-Röhrchen überführt ist.
14. Die Proben werden bei 300 x g für 10 min bei RT zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.

5. Myelinabbau (45 min)

1. Das Pellet der Zellen wird gründlich mit 400 μl Myelinentfernungspuffer resuspendiert.
2. Fügen Sie die angegebene Menge der Myelinentfernungskügelchen hinzu und pipettieren Sie sie auf und ab, um sie gründlich zu mischen.
   HINWEIS: Das Volumen der verwendeten Myelinentfernungsperlen hängt von der Größe des Gewebes, dem Alter des Tieres und der in dieser bestimmten Gehirnregion erwarteten Myelinmenge ab. Inkubieren Sie z. B. eine Hippocampus-Probe einer adulten Ratte (ca. 300 mg) mit 100 μl Myelinentfernungsperlen.
3. 15 min im Kühlschrank bei 4 ºC inkubieren.
4. Waschen Sie jede Probe mit 5 ml Myelinentfernungspuffer
.
5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x g für 10 min bei RT.
6. Während des Zentrifugierens der Proben wird 1 Säule für jede Probe in das Magnetfeld des Magnetsortierers gelegt und ein sauberer 80-Mikron-Filter auf jede Säule gelegt.
7. Bereiten Sie die Säulen und den Filter vor, indem Sie jede Säule 3 Mal (insgesamt 3 ml) mit 1 ml Myelinentfernungspuffer spülen. Sammeln Sie den gesamten Durchfluss in einem Abfallbehälter, z. B. dem Boden einer leeren Kippbox.
8. Positionieren Sie 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen direkt unter jeder Säule, um die Probenentnahme vorzubereiten.
9. Wenn die Zellen die Zentrifugation abgeschlossen haben, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn gründlich in 500 μl Myelinentfernungspuffer. Tragen Sie sofort die Zellsuspension auf die Säule auf und sammeln Sie die Zellen im darunter liegenden Röhrchen.
10. Waschen Sie den Filter und die Säule 4 Mal mit 1 ml Myelinentfernungspuffer (insgesamt 4 ml).
11. Zentrifugieren Sie die Zellsammlung bei 300 x g für 10 min bei RT.
12. Aspirieren Sie den Überstand und die Zellen sind nun bereit für die Färbung.

6. Färben von lebenden Zellen für FACS (1 Stunde für die Färbung)

1. Die Zellen kurz (2 Sekunden) vortexen, um das Pellet zu trennen, und sofort 5 μl Fc-Block (Anti-Cluster der Differenzierung 32, CD32) hinzufügen, erneut vortexen und im Kühlschrank bei 4 ºC für 5 min inkubieren.
2. In der Zwischenzeit bereiten Sie die Primärantikörpermischung vor, indem Sie die drei Primärantikörper wie folgt in Waschpuffer geben: 0,125 μl Allophycocyanin (APC)-konjugierter CD11b-Antikörper (1:800), 1 μl Anti-GLT1-Antikörper (1:100) und 0,4 μl Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) – konjugierter Thy1-Antikörper (1:250) pro 100 μl Waschpuffer. Jede Probe erhält 100 μl Primärantikörpermischung zur Inkubation; Wenn Ihre Probe jedoch viel größer als 400 mg Gewebe ist, sollten Sie in Betracht ziehen, das Volumen Ihrer primären Antikörpermischung entsprechend zu erhöhen
3. Bereiten Sie die Röhrchen für die Einzelfärbekontrolle vor, indem Sie nur 2 μl Zellen aus jedem Probenröhrchen entfernen und in jedes einzelne Färbekontrollröhrchen geben. Zu den "Einzelfärbe"-Kontrollen gehören: nur APC-CD11b, nur GLT1, nur FITC-Thy1, nur PE-Sekundärantikörper und die "blinde" oder ungefärbte Kontrolle.
   HINWEIS: Alle Proben sollten in allen Färbekontrollen vertreten sein, daher sollten 2 μl Zellen aus jeder Probe in jedes Färbekontrollröhrchen gegeben werden.
4. Die Röhrchen kurz vortexen (2 Sekunden) und 100 μl Primärantikörpergemisch in jedes Probenröhrchen und 100 μl des entsprechenden Primärantikörpers in jedes Färbekontrollröhrchen geben, die Röhrchen erneut vortexen, die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, um die fluoreszierenden Antikörper vor jeglichem Licht zu schützen, und die Röhrchen 20 Minuten lang bei 4 ºC im Kühlschrank inkubieren. Die Proben sollten für den Rest des Verfahrens kühl (bei 4 °C) aufbewahrt werden, um die Integrität der Proben und der Antikörper zu erhalten.
5. Wirbeln Sie die Röhrchen kurz vor und geben Sie 2 ml Waschpuffer in jedes Röhrchen.
6. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 350 x g für 5 min bei 4 ºC.
7. In der Zwischenzeit bereiten Sie die Sekundärantikörpermischung vor, indem Sie 0,2 μl PE-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper pro 100 μl Waschpuffer hinzufügen. Jede Probe erhält 100 μl Sekundärantikörpermischung; Wenn Ihre Probe jedoch viel größer als 400 mg Gewebe ist, sollten Sie in Betracht ziehen, das Volumen Ihrer primären Antikörpermischung entsprechend zu erhöhen.
8. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, kippen Sie den Überstand jeder Probe in die Spüle und tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch.
9. Die Röhrchen kurz vortexen und 100 μl Sekundärantikörpergemisch in jedes Probenröhrchen und den entsprechenden Sekundärantikörper in jede Färbekontrolle geben, die Röhrchen erneut vortexen, die Röhrchen mit Alufolie abdecken und die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ºC für 15 Min. inkubieren< /> HINWEIS: Das GLT1-Färbungskontrollröhrchen sollte die Sekundärantikörpermischung erhalten.
10. Nach der Inkubation die Röhrchen kurz vortexen und 2 ml Waschpuffer in jedes Röhrchen geben.
11. Die Röhrchen bei 350 x g für 5 min bei 4 ºC zentrifugieren.
12. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, kippen Sie den Überstand jeder Probe in die Spüle und tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch.
13. Wirbeln Sie die Röhrchen vor und geben Sie 0,25 ml steriles PBS in jedes Röhrchen. Die Proben stehen zur Sortierung bereit.
    HINWEIS: Weitere Zellen können 0,5 ml steriles PBS benötigen; Es ist jedoch am besten, mit einem geringeren Volumen zu beginnen, da die Probe immer verdünnt werden kann, wenn sie zu stark mit Zellen konzentriert ist.
    HINWEIS: Geben Sie optional DNase in das Röhrchen, um ein Verklumpen der Zellen und damit ein Verstopfen des Sortierers zu verhindern. Die Proben können auch mit einem sterilen 80-Mikron-Filter kurz vor der Sortierung gefiltert werden, um ein Verstopfen des Sortierers zu vermeiden.
14. Bringen Sie die Zellen auf Eis zum Sortierer. Sammeln Sie die Zellpopulationen in 2 ml nukleasefreien Zentrifugenröhrchen mit 0,5 ml sterilem PBS in jedem Röhrchen.
15. Nach der Sortierung schleudern Sie die Zellen bei 300 x g für 2 Minuten bei 4 ºC herunter. Aspirieren Sie den größten Teil des PBS und frieren Sie die Zellen im -80 ºC-Gefrierschrank bis zur weiteren Verarbeitung entweder für die RNA-Extraktion (siehe 1 für weitere Protokolldetails), die DNA-Extraktion (siehe 2 für weitere Protokolldetails) oder die Zelllyse für die Proteinanalyse ein.

Results

Die Bedeutung von Myelinabbau und Gewebeperfusion

Abbildung 1 zeigt die Bedeutung des Myelinmangels. Myelinabbau (Schritte 5.1 bis 5.12 des obigen Protokolls) tritt auf, wenn die einzellige Suspension in den Myelinentfernungsperlen inkubiert, gewaschen und anschließend durch die Säule auf dem magnetischen Sortierer geleitet wird. Der Zweck dieser Schritte besteht darin, die Menge an zellulären Trümmern in jeder Probe zu reduzieren. Wenn Neuronen dissoziiert und verreibt werden...

Discussion

Ähnlich wie viele andere Gewebe und Systeme besteht das Gehirn aus einer heterogenen Zellpopulation, die zusammenarbeitet, um das Verhalten zu beeinflussen. Die Analyse der Genexpression, der Proteinexpression oder epigenetischer Modifikationen einzelner Zellen innerhalb dieser heterogenen Population hat das Potenzial, Informationen über die Funktion des Systems als Ganzes zu liefern, zelluläre Prozesse zu identifizieren, die sowohl normales Verhalten als auch Krankheitsprozesse regulieren, und zelltypspezifische Ziele f...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neuronales Dissoziationskit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
Myelinentfernungsperlen II	Miltenyi Biotec	130-096-733
LS Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Nylon-Mesh-Folie	Amazon	CMN-0074-10YD	40 Zoll Breite, 80 Mikron Größe Mesh
Fc Block / Anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	Reaktivität für
Ratte APC-konjugierten CD11b-Antikörper	Biolegend	201809	Reaktivität für Ratte
Kaninchen Anti-GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	Reaktivität für Ratte oder Mensch
PE-konjugiertes Anti-Kaninchen Sekundärantikörper	eBioscience	1037259	Sekundärantikörper für Anti-GLT1
FITC-konjugierter Anti-Ratten-CD90 (Thy1) Maus-Antikörper	Biolegend	202504	Reaktivität für Ratten