Methodenartikel

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

DOI:

10.3791/52551

⸱

22. April 2015

 ,  ,  , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Videoartikel veranschaulicht ein umfassendes Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung aller Stadien der adulten Hippocampus-Neurogenese innerhalb desselben Gewebeabschnitts. Wir haben eine Methode entwickelt, um die Einschränkungen der indirekten multiplen Immunfluoreszenz zu überwinden, die entstehen, wenn geeignete Antikörper von verschiedenen Wirtsspezies nicht verfügbar sind.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogenese ist ein stark reguliert, mehrstufiges Verfahren, bei dem neue Neuronen aus einer aktivierten neuronalen Stammzelle über setzen verstärkt Zwischenvorläufertypen erzeugt. Jede dieser Subtypen exprimiert ein Satz spezifischer molekularer Marker, der zusammen mit spezifischen morphologischen Kriterien können für die Identifikation verwendet werden. Typischerweise werden Immuntechniken aufgebracht mit Subtyp-spezifische Antikörper in Kombination mit exo- oder endogenen Proliferationsmarker. Wir beschreiben hier Immunmarkierung Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von allen Stadien der Erwachsenen Neurogenese. Diese umfassen die Anwendung der Thymidinanaloga, transkardialer Blutung, Gewebeverarbeitung, hitzeinduzierter Epitopdemaskierung, ABC Immunhistochemie, mehrere indirekte Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Zell Quantifizierung. Außerdem eine sequentielle Mehrfachimmunfluoreszenz-Protokoll, das Probleme u umgeht präsentieren wirsually sich aus der Notwendigkeit der Verwendung von primären Antikörpern in den gleichen Wirtsspezies erhöht. Es ermöglicht eine genaue Identifizierung aller Hippocampus-Vorläuferuntertypen zusammen mit einem Proliferationsmarker in einem einzigen Abschnitt. Diese Techniken sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung der unterschiedlichen Vorläufertypen parallel, ihre Beteiligung an der Hirnerkrankungen und deren Rolle in spezifischen Gehirnfunktionen zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwei Hirnregionen konstitutiv erzeugen neue Nervenzellen während des gesamten Lebens, das Subventrikularzone der Seitenventrikel und der Subgranularzone (SGZ) des Gyrus dentatus des Hippocampus (DG). Die neugeborenen Neuronen stammen aus neuralen Vorläuferzellen und durchlaufen verschiedene Stadien der morphologischen und physiologischen Entwicklung vor Erreichen der Geschlechtsreife 1,2. Aus einem sich langsam teil radialen Gliazellen artigen Stammzellen (Typ 1) aufeinanderfolgenden Stufen der transit amplifying Zwischenvorläuferzellen entstehen. Je mehr undifferenzierte Untertypen (Typ 2a und Typ 2b) eine unregelmäßige Form mit kurzen, tangentialen Prozesse. Sie erzeugen Neuroblasten (Typ 3), die nach und nach in den Zellzyklus verlassen, um unreife Neuronen werden (mit Dendriten erweitert in Richtung der molekularen Schicht) und schließlich in den Hippocampus-Netzwerk als reife Körnerzellen zu integrieren. Aufgrund ihrer besonderen physiologischen Eigenschaften diese Zellen stellen die Schaltung mit verbesserter Plastizität 3 suggesting eine einzigartige Rolle bei der Funktion des Hippocampus. Eigentlich Studien der letzten zehn Jahre generiert erhebliche Beweise dafür, dass die adulte Neurogenese trägt zur räumlichen Gedächtnisses, Muster Trennung und emotionales Verhalten 4,5.

Adulte Neurogenese kann durch verschiedene Ansätze untersucht werden. Thymidinanaloga integrieren in die DNA während der S-Phase des Zellzyklus und ermöglichen Geburt aus, Quantifizierung und Schicksal Analyse der neugeborenen Zellen 6-8. Sequentielle Anwendung unterschiedlicher Thymidin-Analoga (zB CldU, EdU oder IdU) kann zur Zellerneuerung oder Zellpopulationen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verlaufs des Experiments 9 geboren untersuchen. Eine Alternative, endogenen Marker für Zellproliferation Ki67. Es ist in sich teilenden Zellen in allen Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, M), mit Ausnahme der Ruhephase (G0) und dem Beginn des G1 10,11 ausgedrückt. Um den Phänotyp Neugeborenen Zellpopulationen in der Erwachsenen dentat analysierene Gyrus mehrere stufenspezifische molekulare Marker wie GFAP, Nestin, DCX und NeuN 1,6 verwendet werden. GFAP ist ein Marker für reife Astrozyten wird aber auch in radialer Gliazellen-ähnlichen Zellen in der adulten Vorderhirn exprimiert. Nestin ist ein Zwischenfaden spezifisch für radiale Glia-ähnlichen Zellen und frühen Zwischen Progenitorzellen. DCX ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein in Zwischenvorläuferzellen, Neuroblasten und unreife Neuronen exprimiert. Auf der Grundlage der (Mit-) Expression dieser drei Marker und die morphologischen Merkmale der markierten Zellen vier verschiedene Vorläuferzelltypen zu unterscheiden: Typ 1 (GFAP +, Nestin +, DCX -), Typ 2a (GFAP - Nestin + , DCX -) Typ 2b (GFAP - Nestin +, DCX +) und Typ 3 (GFAP - Nestin -, DCX +) ein. Co-Kennzeichnung von DCX mit NeuN, die in postmitotischen Neuronen exprimiert wird, ermöglicht die Differenzierung von immature (DCX +, NeuN +) und reifen (DCX -, NeuN +) Körnerzellen.

Die oben genannten Markierungen werden häufig für Immunofluoreszenz co-Kennzeichnung und anschließende konfokale Mikroskopie verwendet, um die Anzahl und die Identität von neugeborenem Zellen zu analysieren. Dies erfordert typischerweise Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies zu unerwünschten Antikörper Kreuzreaktivität verhindern. Allerdings ist die Mehrzahl der primären Antikörper für die Neurogenese Forschung angehoben entweder in Kaninchen oder Mäusen (zB Maus-α-BrdU, Maus α-NeuN, Kaninchen α-Ki67, Kaninchen α-GFAP). Dies führt zu starken Einschränkungen hinsichtlich der Anzahl und Kombination von Antigenen, die in einer einzigen Scheibe ausgewertet werden konnte. Dies wiederum nicht steigt nur der Färbung Aufwand, da mehrere Färbungen müssen durchgeführt werden, sondern könnte auch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Darüber hinaus sind einige Antigene anfällig für Formalinfixierung induzierte Epitop Maskierung (zB Ki67Nestin). Wir beschreiben hier Änderungen von den klassischen Ein- und Mehr Immunomarkierung Protokolle (zB Epitopdemaskierung, mehrere aufeinander folgende Immunfärbung, die Verwendung von Nestin-GFP transgenen Mäusen, 12), die viele dieser Probleme zu überwinden. Insbesondere erlaubt die sequenzielle Mehrfachimmunfärbungsprotokolls gegen bis zu vier unterschiedlichen Antigene auch wenn ein Teil der Antikörper wird aus dem gleichen Wirt stammen. Dies ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Typ 1, Typ 2a, 2b Typ und Typ 3-Vorläuferzellen, sowie ihre proliferative Aktivität innerhalb einer einzelnen Seite.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Alle Verfahren, die lebende Tiere wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie 86/609 / EWG des Rates Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von der Ethikkommission (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) zugelassen wurde.

1. intraperitoneale Injektion von Thymidinanaloga

  1. Wiegen Tiere am Tag vor der Injektion. Berechnen Sie die Menge an Thymidin-Analogon für alle am nächsten Tag sowie individuelle Gewicht angepassten Injektionsvolumina einer 10 mg / ml Stammlösung geplant Injektionen erforderlich.
  2. Bereiten Sie 10 mg / ml Thymidin-Stammlösung. (VORSICHT! Thymidin-Analoga sind giftig. Folgen Sie den spezifischen Sicherheitsdatenblätter (MSDS) von den Lieferanten zur Verfügung gestellt, also tragen Laborkittel und Schutzhandschuhe, mit einem Laborabzug).
    1. Nehmen Thymidin-Analogon aus dem Gefrierschrank und bringen es auf RT, ca. 21 ° C. Wiegen Sie 10 mg und fügensteriler Kochsalzlösung (für BrdU und CldU) oder 0,04 N NaOH (in steriler Kochsalzlösung, für IDU), Wirbel. Platz für mindestens 10 bis 15 Minuten lang in einem 50 ° C Wasserbad und Wirbel alle 2 - 3 Minuten, um das Pulver aufzulösen.
      HINWEIS: Lösungen für bis zu 24 Stunden, wenn sie bei Raumtemperatur und für mehrere Wochen bei -20 ° C gelagert. Schützen Lösungen von Licht (Abdeckung mit Aluminiumfolie). Kontrollieren Sie immer die Niederschläge und wieder auflösen, wenn nötig.
  3. Restrain die Maus durch das Genick und intraperitoneale Injektion eines geeigneten, dem Gewicht angepassten Volumen der Stammlösung (bei Raumtemperatur) mit einer feinen Dosierung Spritze mit einer 30 G-Nadel.
    HINWEIS: Bei CldU und IdU müssen nacheinander im gleichen Tier verabreicht werden, zu prüfen, um äquimolare Konzentrationen injiziert (zB 42,5 mg / kg CldU und 57,5 mg / kg IdU, die 50 mg / kg BrdU entsprechen). Deshalb passen Sie die Injektionsvolumina der 10 mg / ml-Stammlösungen.

2. Gewebepräparation

  1. PrepaWieder 4% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 am Tag vor Perfusion. Lagerung bei 4 ° C.
  2. Transkardial perfuse die tief narkotisierten Mäusen (3,5% Isofluran) über der linken Herzkammer mit 10 ml eiskaltem PBS, dann mit 40 ml eiskaltem Formaldehyd (Durchflussrate von 5 ml / min). Präparieren des Gehirns und post-fix im gleichen Fixativ für 24 h bei 4 ° C.
  3. Übertragen Sie die Gehirne nacheinander in 10% (24 Stunden bei 4 ° C) und 30% Saccharose (bis das Gehirn sinkt, ca. 48 h). Zum Einfrieren langsam tauchen die kryogeschützt Gehirn in -25 ° C Isopentan bis keine Luftblasen entstehen aus dem Gewebe. Bei -80 ° C.
  4. Geschnitten Koronalschnitte von 40 um Dicke auf einem Gefriermikrotom (Blocktemperatur bei -25 bis -16 ° C). Sequenziell Übertragungsabschnitten in Frostschutzlösung, die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte (siehe Abbildung 1). Lagerung bei -20 ° C.

"1" Abbildung 1. Schematische Darstellung der Übertragung von Mikrotom Scheiben in eine 24-Well-Platte. Bei A1 starten und legen nachfolgende Scheiben in Reihe A nach A6 gehen in die nächste Zeile B und so weiter. Bei Erreichen D6, gehen Sie zurück zu A1 und fortfahren. Diese Anordnung von Scheiben ermöglicht die Quantifizierung von jedem n-ten Abschnitt eines gesamten Gehirns. Zur Quantifizierung von neugeborenen Zellen nehmen jeden 6. Hirnschnitt (entsprechend dem Inhalt einer Spalte), Immunfluoreszenz Phänotypisierung nehmen jeden 12-ten Abschnitt (entspricht dem Gehalt von 2 alternierende Reihen von einer Spalte).

3. Immunfärbung

HINWEIS: Abschnitte verarbeitet frei schwebenden, in der Regel in 6-Well-Platten mit einer Trägerplatte ausgestattet und Mesh-Einsätzen. Ausnahmsweise Blockieren, Antikörperinkubationen und ABC-Reaktion sind in 12- oder 24-Well-Platten durchgeführt, ohne Mesh-Einsätze (0,5 bis 1 ml pro well reicht, abhängig von der Anzahl der Schichten, die gefärbt werden müssen). Während dieser Schritte Übertragungsabschnitte mit Hilfe einer feinen Bürste (Spülen mit jeder neuen Lösung). Alle Inkubationen werden unter ständigem Rühren (max 150 rpm) durchgeführt.

  1. Immunhistochemie (ABC-Methode)
    1. Übertragen Sie Abschnitte von Frostschutzmittel in TBS und gründlich (einmal O / N bei 4 ° C, 5-mal bei RT für 10 Minuten jede) zu Frostschutzmittel vollständig zu entfernen.
    2. Inkubieren für 30 min in 1,5% H 2 O 2 in TBS-T, um endogene Peroxidase-Aktivität zu quenchen. Achten Sie auf die Blasenbildung und wieder tauchen Abschnitte, wenn nötig. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
    3. Optional: Inzwischen vorzuwärmen Heizschrank und 2 N HCl auf 37 ° C. Abschnitte Inkubation 30 min bei 37 ° C in 2 N HCl, um DNA zu denaturieren. Sanft getrennte Abschnitte mit Hilfe eines Pinsels.
    4. Optional: Neutralisieren Sektionen für 10 min in 0,1 M Boratpuffer pH8,5, RT. Während der Übertragung, kurz Tupfer die Mesh-Einsätze, die die Abschnitte auf einem Papiertuch, um HCl leavings entfernen. Spülen Sie 2 mal in TBS 15 min je.
    5. Inkubieren in TBSplus, um das Gewebe durchlässig und unspezifische Antikörperbindungsstellen, 1 h bei RT zu blockieren.
    6. Inkubieren in primären Antikörper in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
    7. Inkubiere in biotinylierten sekundären Antikörper in TBSplus, 3 h bei RT verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. In der Zwischenzeit ...
    8. Bereiten ABC-Komplex gemäß dem Protokoll des Herstellers (1% A + 1% B in TBS-T). Man lässt 30 min bei RT stehengelassen, bevor Gebrauch. Abschnitte AB Reagenz Inkubation für 1 h bei RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
    9. Bereiten Sie 50 ml 0,5 mg / ml DAB in TBS-T pro 6- oder 12-Well-Platte, aufgeteilt in zwei Hälften und Pipette 4 ml oder 2 ml pro Vertiefung auf. Übertragungsabschnitten in DAB-Lösung (VORSICHT! DAB ist giftig. Folgen Sie der spezific Sicherheitsdatenblatt des Lieferanten, dh tragen Laborkittel und Schutzhandschuhe, mit einem Laborabzug).
    10. 0,5 ml 1% H 2 O 2 zu den verbleibenden 25 ml DAB-Lösung, zu mischen und Pipetten äquivalente Volumina wie oben in jede Vertiefung Peroxidase-Reaktion gestartet werden. Inkubieren für 12 min. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
    11. Berg Abschnitte Folien in Gelatine, an der Luft trocknen O / N. Deckglas mit permanentes Fixiermittel.
    12. Optional: bevor Sie das Deckglas Gegenfärbung (siehe Abschnitt 3.5).
      HINWEIS: Wenn das Signal-zu-Rausch-Verhältnis niedrig ist, da der hohe Hinter Wiederholen H 2 O 2 -Behandlung nach der Inkubation mit AB-Reagenz (Schritt 3.1.8).
  2. Multiple-Immunfluoreszenz
    1. Einzelne oder gleichzeitig mehrere Immunfluoreszenz
      1. Übertragen Sie Abschnitte von Frostschutzmittel in TBS und gründlich (einmal O / N bei 4 ° C, 5-mal bei RT für 10 min jeweils) vollständig zu entfernen eintifreeze.
      2. Optional: wie Sie die Schritte 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Inkubieren in TBSplus, um das Gewebe durchlässig und blockieren unspezifische Antikörperbindungsstellen, 1 h bei RT.
      4. Inkubieren in primären Antikörper-Cocktail (zB Ratten α-BrdU, Meerschweinchen α-DCX, Ziegen α-GFP) in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
      5. Inkubieren in Cocktail aus einem Fluorochrom konjugierte Sekundärantikörper (zB Rhodamin Red α-rat, Alexa-647 α-Meerschweinchen, Alexa-488 α-Ziege, alle in Esel abgeleitet) in TBSplus verdünnt, 3 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C. Ab sofort schützen Schnitte von Licht. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
      6. Berg Abschnitte Folien in Gelatine, an der Luft trocknen O / N. Deckglas mit wässrigem Eindeckmedium.
    2. Sequential mehrere Immunfluoreszenz mit primären Antikörpern aus derselben Wirtsspezies
      1. Da die Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Inkubieren in fiersten primären Antikörper (zB Kaninchen α-Antigen A), O / N bei 4 ° C. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
      3. Inkubieren im ersten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (zB Rhodamin Red-Konj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Ab sofort schützen Schnitte von Licht. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
      4. Inkubieren in 10% Normalserum von demselben Host wie die primären Antikörper (zB Kaninchenserum) für 3 h RT offen Paratope am ersten sekundären Antikörpers sättigen. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
      5. Inkubiere in TBSplus mit 50 ug / ml unkonjugierter einwertige Fab-Fragmente gegenüber dem Gastgeber der primären Antikörper gerichtet (zB α-Kaninchen-IgG (H + L)) an Epitope, die von dem zweiten sekundären Antikörper, O / N erfasst werden kann abzudecken 4 ° C.
      6. Mindestens 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. Während der Übertragung, kurz swab die Mesh-Einsätze, die die Abschnitte auf einem Papiertuch, um alle Fab leavings entfernen.
      7. Inkubieren im zweiten primären Antikörper (zB Kaninchen α-Antigen B), O / N bei 4 ° C. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
      8. Inkubieren im zweiten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (zB Alexa-488-Konj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min jeweils, montieren und Deckglas oben.
        HINWEIS: Um die Antigene mit Antikörpern beschriften aus verschiedenen Wirtsarten fügen Sie sie in Schritt 3.2.2.2 und den entsprechenden Sekundärantikörper zu Schritt 3.2.2.3.
    3. Eine der sekundären Antikörper aus derselben Spezies wie eine der primären Antikörper
      Hinweis: Dieses Protokoll ist zusammen mit GFAP, Nestin-GFP und DCX geeignet für Vierfachfärbung gegen BrdU oder Ki67.
      1. Befolgen Sie streng Protokoll Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Bis zu diesem Zeitpunkt ausschließlich Eselserum in TBSplus.
      2. Inkubiere in TBSplus enthaltend 3% Ziegenserum, 1 h bei RT. Dies umfasst offene Paratope auf der α-Ziege sekundären Antikörper. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
      3. Inkubieren in AMCA-Konj. Ziegen α-Kaninchen in TBSplus, 3 Stunden RT oder O / N 4 ° C verdünnt. Dreimal in TBS Spülen für 15 Minuten jeweils, montieren und Deckglas oben.
    4. CldU, IdU Co-Färbung
      1. Spülen, denaturieren und zu neutralisieren Abschnitte, wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben (Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Inkubieren mit 20 ug / ml unkonjugierter Fab Fragmente α-Maus-IgG (H + L) in TBSplus, 1 h bei RT. Spülen 4 mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 min.
      3. Inkubieren in primären Antikörper-Cocktails Ratte α-BrdU (1: 400; gereinigt IgG2) und Maus-α-BrdU (1: 350) in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
      4. Inkubation in sekundärem Antikörper-Cocktail enthält biotinylierten Esel α-Ratte (1: 500) und FITC-conj. Esel α-Maus-Fab-Fragmente (1: 100). 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
      5. Inkubieren in Rhodamin Red-Konj. Streptavidin, 2 h bei RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min jeweils, montieren und Deckglas oben.
    5. Die Amplifikation von Fluoreszenzsignal in Nestin-GFP-Mäuse
      1. Hinzufügen Ziege α-GFP an den primären Antikörper-Cocktail.
      2. Hinzufügen eines Fluorochrom konjugierten sekundären Antikörpers mit spektralen Eigenschaften ähnlich GFP (wie Alexa 488 conj. Esel α-Ziege) an den sekundären Antikörper-Cocktail.
  3. Epitopdemaskierung
    1. Führen Sie Epitopdemaskierung nach dem Ausspülen Frostschutzmittel. Vorheizen Dämpfer mit 6- oder 12-Well-Platten mit 0,1 M Citratpuffer pH 6,0 bis 95 bis 99 ° C (etwa 25 min).
    2. Übertragen Sie die Abschnitte in die heiße Citratpuffer und Dampf für 30 Minuten (die Platten abdecken mit Aluminiumfolie als Kunststoff lIDs sind nicht hitzebeständig).
    3. Unmittelbar danach die Platten in einem Eisbad abkühlen. Dies hilft, um Gewebemorphologie, die von besonderer Bedeutung ist bei der Arbeit mit Hirnschnitten der postnatalen Tieren zu schützen.
    4. Spülen Sie 3 mal in TBS für jeweils 10 min zu spülen und zu neutralisieren, das Citrat und weiterhin Färbung.
  4. Maus-Antikörper auf Mausgewebe
    1. Mit 20 & mgr; g / ml einwertige Fab-Fragmente α-Maus-IgG (H + L; gleichen Wirtsart als sekundärer Antikörper) zu der ersten Sperrstufe (zB Schritt 3.1.5 oder 3.2.1.3).
    2. Spülen Sie 4-mal in TBS und einmal in TBS-T für 10 Minuten jeweils, und fahren Sie mit entsprechenden Protokoll.
  5. Kresylviolett Gegenfärbung
    1. Vorheizen Kresylviolett Lösung auf 60 ° C (im Glas). Die Objektträger in der heißen Lösung für 3 min.
    2. Spülen Sie in aq. dest. und dehydratisieren 2 Mal für jeweils 1 min in 70%, 96% und 100% Isopropanol ist.
      3. Klar für 5-6 min in Xylol oder Xylol-Ersatzstoff und Deckglas mit einem kompatiblen permanentes Fixiermittel.

4. Datenanalyse

  1. Graf Peroxidase gefärbt neugeborenen Zellen in jedem 6-ten Abschnitt entlang der gesamten rostrokaudalen Umfang des Gyrus dentatus. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung.
  2. Multiplizieren die resultierende Zellzahlen mit dem Schnittpunkt-Intervall, um eine Schätzung der Gesamtzahl der Neugeborenen-Zellen zu erhalten.
  3. Bild der Fluoreszenz mit einem konfokalen Lasermikroskops mit geeigneten Laser und Filtersystemen ausgestattet beschriftet Abschnitte. Nehmen Bildstapeln an zufälligen Positionen entlang der gesamten Ausdehnung des Gyrus dentatus bei 400-facher Vergrößerung und mindestens 50 zufällig ausgewählten interessierenden Zellen pro Hemisphäre für die Co-Markierung mit anderen Markern analysiert.
  4. Multiplizieren die resultierende Prozentsatz der co-markierten Zellen (% / 100) mit der Gesamtzahl der neugeborenen Zellen zu berechnen absoluteNummern bestimmter neugeborenen Zellpopulationen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir verwendeten die vorstehend beschriebenen zu quantifizieren und zu charakterisieren neugeborenen Zellen in den postnatalen und Hippocampus Methoden. Daher haben wir Wildtyp und Neurogenese-defizienten Cyclin D2 Knock-out (CCND2 KO) Mäuse unter Bedingungen bekannt, die Rate der Neurogenese (dh angereicherten Umgebung, EE) 13,14 beeinflussen gebracht. Immunhistochemische Färbung DAB entweder gegen Ki67, BrdU CldU oder IdU konsistent zeigten unterschiedliche neugeborenen Zellzahlen zwischen ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantifizierung und Identifizierung von Subpopulationen von neugeborenen Zellen ist ein zentrales Thema in der adulten Neurogenese Forschung. Die Kombination von Proliferationsmarker und Antikörper gegen Proteine ​​in bestimmten Phasen der adulten Neurogenese ausgedrückt ermöglicht immunhistochemischen Nachweis dieser Subpopulationen. Einige der Antikörper oder Antikörperkombinationen erfordern spezifische Färbung Bedingungen.

Kennzeichnung von sich teilenden Zellen mit synthetischen Thymidi...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken S. Tausch für die hervorragende technische Unterstützung. Die Arbeit wurde gefördert durch das BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) und die DFG (FOR1738).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

ImmunohistochemistrySekundäre AntikörperBlocking

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Thymidin-Analogon Verabreichung
5-Brom-2&prim;-Desoxyuridin, BrdUSigma-AldrichB9285toxisch (mutagen, teratogen)
5-Chlor-2&prim;-Desoxyuridin, CldUSigma-AldrichC6891toxisch (mutagen, teratogen)
5-Chlor-2&prim;-Desoxyuridin, CldUMP Biomedicals2105478toxisch (mutagen, teratogen)
5-Iod-2′-Desoxyuridin, IdUMP Biomedicals2100357toxisch (mutagen, teratogen)
Gewebepräparat
>Isofluran-ActavisPiramal Healthcare700211
Paraformaldehyd Pulver (PFA)Riedel-De Hä en16005, brennbare
Perfusionspumpe PD5206Heidolph Instruments523-52060-00
Masterflex Tygon Laborschlauch, Ø 0,8 mmThermo Fischer Scientific06409-13
Zuführnadel, gerade, 21 G, 1,75 mm olivfarbene Spitze, 40 mmAgnthos1036
Gefriermikrotom Microm HM 400Thermo Fischer Scientific
24-Well-Zellkultur-Multiwell-PlattenGreiner Bio-One662160<
Tefal vitacuisine steamerTefalVS 4001
Netwell 24 mm Polyester-Mesh-Membran-EinsätzeCorning3479vorgeladen in 6-Well-Kulturplatten
Netwell 15 mm Polyester-Mesh-Membran-EinsätzeCorning3477vorgeladen in 12-Well-Kulturplatten
Netwell Kunststoff 6-Well-TrägerkitCorning3521für 24 mm Polyester-Mesh-Membraneinsätze
Netwell Kunststoff 12-Well-TrägerkitCorning3520für 15 mm Polyester-Mesh-Membraneinsätze
Vectastain Elite ABC KitVector LaboratoriesPK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidintetrahydrochloridhydrat)Sigma-AldrichD-5637krebserregend, lichtempfindlich
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
Primary antibodies
Rabbit IgG1 α-Ki67Novocastra/ Leica BiosystemsNCL-L-Ki67MM1DAB 1:400/IF 1:100; erfordert Epitop-Entnahme
Kaninchen α-GFAP, AS-3-GFSynaptic Systems173 0021:500
Ziegen-IgG (H+L) α-GFPAcris AntikörperR1091P1:300
Maus IgG1 α-NestinAbcamab61421:200; erfordert Epitopgewinnung
Meerschweinchen IgG (H+L) α-DoublecortinMerck MilliporeAB22531:500
Ratte IgG2a α- BrdU (Aszites)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030CXzum Nachweis von BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Ratte IgG2a α-BrdU (gereinigt)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030   zum Nachweis von CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Maus IgG1 α-NeuNMerck MilliporeMAB3771:500
Maus IgG1κ α-BrdUBD Biosciences347580Zum Nachweis von IdU; DAB 1:500/IF 1:350<
Esel α-Meerschweinchen IgG (H+L)-BiotinDianova711-065-1521:500
Esel α-Ratte IgG (H+L)-BiotinDianova712-065-1501:500
Esel α-Maus IgG (H+L)-BiotinDianova715-065-1511:500
Ziege α-Ratte IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Molekulare SondenA110061:250
Esel α-Ziege IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Molekulare SondenA110551:250
Esel α-Maus IgG (H+L)-FITC, Fab-FragmentDianova715-097-0031:100
Esel α-Maus IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova715-605-1511:250
Esel α-Meerschweinchen IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova706-605-1481:250
Esel α-Ratte IgG (H+L)-Rhodamin Rot-XDianova712-295-1501:250
Esel α-Kaninchen IgG (H+L)-Rhodamin Rot-XDianova711-295-1521:250
Esel α-Meerschweinchen IgG (H+L)-Rhodamin Rot-XDianova706-296-1481:250
Streptavidin-Rhodamin Red-XDianova016-290-0841:500
Ziege α-Kaninchen IgG (H+L)-AMCADianova111-155-1441:250, funktioniert nur mit Kaninchen α-GFAP
Hoechst 33342Molekulare SondenH35701:1000
DAPIMolekulare SondenD13061:1000<
Fab-Fragment Esel α-Maus IgG (H+L)Dianova715-007-0031:20
Fab-Fragment Esel α-Kaninchen IgG (H+L)Dianova711-007-0031:20
Normales EselserumMerck MilliporeS30
Normales KaninchenserumDianova011-000-010
Normales ZiegenserumDianova005-000-001
RinderserumalbuminSigma-AldrichA7906
Histology
CresylvioletSigma-AldrichC5042
Neo-ClearMerck Millipore109843ungiftiger Xylolersatz
Neo-MountMerck Millipore109016permanentes Einbettmedium
Mikroskopie
Axioskop 2Carl Zeiss Mikroskopie
LSM 710Carl Zeiss Mikroskopie
giftigetd colspan="4">td colspan="4">td colspan="4">

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46(2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Sequenzielle ImmunfluoreszenzThymidin AnalogGewebeverarbeitungKonfokalmikroskopieZellquantifizierungAntik rper der Wirtsspeziesneurale Progenitorzellen

Verwandte Artikel