Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Studie ist es zu zeigen, wie die Mosaik-Transgenese-Strategie im Zebrafisch verwendet werden kann, um die relativen Beiträge mehrerer Onkogene zur Tumorinitiierung und -progression in vivo schnell und effizient zu bewerten.

Zusammenfassung

Eine umfassende genomische Analyse hat eine überraschend große Anzahl genetischer Veränderungen bei verschiedenen Krebsarten aufgedeckt. Die robusten und effizienten Identifizierung onkogener "Treiber" unter diesen Tumoren und die Definition ihrer komplexen Beziehungen zu gleichzeitigen genetischen Veränderungen während der Tumorpathogenese bleibt eine gewaltige Aufgabe. In jüngster Zeit hat sich der Zebrafisch zu einem wichtigen Tiermodell für die Erforschung menschlicher Krankheiten entwickelt, vor allem wegen seiner einfachen Wartung, seiner hohen Fruchtbarkeit, seiner offensichtlichen Vorteile für die In-vivo-Bildgebung, der hohen Konservierung von Onkogenen und ihrer molekularen Signalwege, seiner Anfälligkeit für Tumorentstehung und vor allem wegen der Verfügbarkeit transgener Techniken, die für den Einsatz bei Fischen geeignet sind. Transgene Zebrafischmodelle von Krebs wurden häufig verwendet, um onkogene Signalwege in verschiedenen Tumorarten zu sezieren. Die Entwicklung eines stabilen transgenen Fischmodells ist jedoch sowohl mühsam als auch zeitaufwändig, und es ist noch schwieriger und zeitaufwändiger, die Zusammenarbeit mehrerer Gene bei der Krankheitspathogenese mit diesem Ansatz zu analysieren, der die Generierung mehrerer transgener Linien mit Überexpression der einzelnen Gene von Interesse erfordert, gefolgt von einer komplizierten Züchtung dieser stabilen transgenen Linien. Daher bietet die Verwendung eines mosaikartigen transienten transgenen Ansatzes im Zebrafisch einzigartige Vorteile für die funktionelle genomische Analyse in vivo. Kurz gesagt, Kandidatentransgene können in Wildtyp- oder transgene Zebrafischembryonen im Einzelzellstadium coinjiziert werden und gemeinsam in jede somatische Zelle in einem Mosaikmuster integriert werden, das zu gemischten Genotypen im selben primär injizierten Tier führt. Auf diese Weise kann schneller und kostengünstiger untersucht werden, ob und wie die Kandidatengene zusammenarbeiten können, um die Tumorentstehung voranzutreiben. Durch die vorübergehende Überexpression von aktiviertem ALK in den transgenen Fischen, die MYCN überexprimieren, zeigen wir hier die Zusammenarbeit dieser beiden Onkogene bei der Pathogenese eines pädiatrischen Krebses, des Neuroblastoms, das den meisten Formen der heutigen Behandlung widerstanden hat.

Einleitung

Krebserkrankungen sind progressive Erkrankungen, die durch die Anhäufung von pathologischen Mutationen, Deletionen und Chromosomen gewinnt mit der Zeit gekennzeichnet. Diese genetischen Anomalien können mehrere zelluläre Prozesse, die vom Zellzyklus, Zelltod, energetische Metabolismus und Zusammensetzung des Zytoskeletts zu Reaktionen wie Hypoxie Stress beeinflussen. Daher spiegelt die Tumorgenese kollektive Aktionen von mehreren genetischen Veränderungen in einem breiten Spektrum von biologischen Prozessen. Neue integrative genomische Forschung, einschließlich Sequenzierung ganzer Genome, Exoms Sequenzierung, die gezielte Sequenzierung, deep sequencing und genomweiten Assoziationsstudien haben eine wachsende Zahl von neuen genetischen Veränderungen im Wesentlichen alle Arten von Tumoren ^1-4 identifiziert. In vielen Fällen gemeinsam auftreten die genetischen Läsionen in einem nicht-zufälligen Weise ^5-8, was darauf hindeutet, ihre Zusammenarbeit bei der Krankheitsentstehung. Sezieren der onkogenen Rollen der großen Palette von aberrant exprimierter Gene resultierenden from diese genomische Veränderungen ist notwendig, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln und um die Antworten von Tumorzellen gegenüber diesen Substanzen zu verstehen, aber das hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, die eine sehr robuste Tiermodellsysteme für die Durchführung von Hochdurchsatz-funktionelle Genomanalyse vivo.

Obwohl Säugetiere, insbesondere Nagetiere, sind bevorzugte Modelle in der Krebsbiologie hat der Zebrafisch begonnen, erhebliche Aufmerksamkeit zu erregen. Die Knochenfische Zebrabärbling (Dario rerio) als Modellorganismus für die Entwicklungsstudie seit 1960 im Einsatz und wurde zum ersten Mal auf die Untersuchung von Tumor Pathogenese 1982 ^9-11 angewendet. Einfache Wartung, geringe Körpergröße, und hohe Fruchtbarkeit machen den Zebrafisch ein robustes Modell für eine groß angelegte Vorwärts genetischen Screens von Mutationen, die abnorme und pathologische Phänotypen ¹⁰ verleihen identifizieren. Die optische Transparenz der Zebrafischembryonen ist ein weiteres wichtiges Merkmal unterstützt breitere Verwendung dieser Krebs-Modell, wiesie ermöglicht in vivo-Bildgebung, um durchgeführt, um die Tumorentwicklung in Echtzeit ⁹ zu finden, eine Anwendung, die bei Nagern ¹² relativ schwer werden. Neueste vergleichende Genomik Analyse der Zebrafisch Referenzgenom (ZV9) ergab 26.206 Protein kodierende Gene, mit 71% mit menschlichen Orthologe, von denen 82% sind mit krankheitsassoziierten Genen im Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) Datenbank ^{13 korreliert, 14.} Folglich ist die Zebrafisch wurde verwendet, um diverse Arten von menschlichen Krebsarten, einschließlich Neuroblastom Muster ^8, T-Zell-akute lymphatische Leukämie (T-ALL), ^{15,16, 17,18} Melanom, Ewing-Sarkom ^19, Rhabdomyosarkom ^20,21, Pankreaskarzinom ^{22, 23} und Leberzellkarzinom myeloischen malignen Erkrankungen, ^24,25, und wurde ausgewählt, wie ein Krebs-Modell für die Xenotransplantation studiert ^11,26.

Eine stabile transgeneAnsatz im Zebrafisch wird häufig verwendet, um die Wirkung der Verstärkung-of-Funktion von Genen in der normalen Entwicklung oder Pathogenese ^27,28 studieren. Ein solches Modell (Figur 1A) zu entwickeln, injiziert man ein DNA-Konstrukt, das das Gen von Interesse durch einen gewebespezifischen Promotor in die Ein-Zellen Wildtyp-Embryonen angetrieben enthält. Drei bis vier Monate nach der Injektion, wenn die injizierten Embryos geschlechtsreif sind, werden sie mit Wildtyp-Fischen ausgekreuzt, um diejenigen, die die Integration des DNA-Konstrukts in ihrer Keimbahn, die sie als Gründer Fisch Bildschirm Lizenzen. Viele Faktoren, wie beispielsweise die Kopienzahl und die Integrationsstelle des Transgens, beeinflussen die Expression des Transgens in stabilen transgenen Linien. Somit, um eine transgene Tumormodell zu entwickeln, haben, mehreren stabilen transgenen Linien Expression eines einzelnen Onkogen, zunächst erzeugt und für die Linie, die das Transgen in einer Ebene, die zu Tumorentstehung führen könnte exprimieren gescreent werden. Allerdings, wenn die Überexpression eines Kandidaten oncogene toxisch für Keimzellen, ist es schwierig, eine stabile transgene Linie erzeugt durch direkte Überexpression des Transgens ^29. Daher kann dieser Ansatz sehr zeitaufwändig sein, mit einem hohen Risiko des Scheiterns, um ein geeignetes Modell Krebs erzeugen.

Hier zeigen wir eine alternative Strategie, die auf Mosaik transiente Transgenese (1B), die einzigartige Vorteile gegenüber herkömmlichen stabilen Transgenese für funktionelle genomische Untersuchung in vivo zur Verfügung stellt. In diesem Ansatz werden eine oder mehrere transgene Konstrukte in der Ein-Zell-Stadium von transgenen und Wildtyp-Embryos injiziert. Die injizierten DNA-Konstrukte, die Transgene sind dann mosaik und zufällig in den Primär injiziert Fisch integriert, was zu einer gemischten Genotypen in mehreren Zellpopulationen in den einzelnen Fisch ^30. Außerdem Koinjektion von mehreren DNA-Konstrukte in einem Zellembryonen zu Co-Integration in die gleiche Zelle an zufälligen Stellen, so dass man trace die Zellen mit Expression von Transgenen und erkunden Sie die Wechselwirkungen verschiedener Gene im Krankheitsentstehung in den Mosaik-Tiere ^31. Als Beweis für das Prinzip, transient wir im peripheren sympathischen Nervensystems (PSNS) unter der Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase (d & bgr; h) Promotors in Wildtyp-Fisch und transgene Fische überexprimierenden MYCN überexprimiert Mutation aktiviert ALK (F1174L) mit mCherry Reportergens. ALK, das einen Rezeptor-Tyrosin-Kinase kodiert, ist das am häufigsten mutierte Gen in Hochrisiko-Neuroblastom ^5-7,32,33. ALK (F1174L), als eine der häufigsten und potente somatischen aktivierenden Mutationen ist in überrepräsentiert MYCN- verstärkt Neuroblastom-Patienten mit hohem Risiko und wirkt synergistisch mit MYCN Expression auf Neuroblastom Tumorentstehung in der stabilen transgenen Mäusen und transgenen Zebrafisch Modelle ^8,34,35 beschleunigen. Durch Mosaiktransiente Überexpression von ALK (F1174L) mit mCherry im MYCN transgene Fische, rekapituliert wir die Beschleunigung der in der stabilen transgenen Fischen Überexpression sowohl ALK (F1174L) und MYCN beobachteten Tumor Beginn, was darauf hindeutet, dass das Mosaik Transgenese Strategie kann schnell und effizient eingesetzt werden Bewertung der relativen Beiträge mehrerer Onkogene in Tumorinitiation in vivo.

Protokoll

HINWEIS: Alle Zebrafisch Studien und Pflege der Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Mayo-Klinik Institut IACUC genehmigten Protokoll # A41213 getan.

1. DNA-Konstrukte für Transgenese

1. Amplify ein 5,2-kb Dopamin beta-Hydroxylase (d & bgr; h) Promotorbereich ⁸ mit dem CH211-270H11 BAC-Klon (von BACPAC Ressourcen-Center (BPRC)) als DNA-Template. Verwenden eines PCR-System geeignet für lange und genaue PCR-Amplifikation langer DNA-Matrizen und den folgenden Zyklus Programme für PCR: 94 ° C für 2 min, 10 Zyklen (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 & deg; C, 8 min), gefolgt von 30 Zyklen (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (Vorwärtsprimer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' und Rückwärtsprimer 5'- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
2. Erstellen Sie die d & bgr; h -pDONRP4-P1R Eintrag clone ⁸ mit kommerziellen rekombinanten Klonen System wie Multisite-Gateway. Mischen Sie 1 ul gereinigtes dβh PCR-Produkt (172 ng / ul), 1 ul (150 ng / ul) pDONRP4-P1R Donorvektor (zusammen mit anderen Gateway Vektoren sind großzügige Geschenke von Dr. Chi-Bin Chien, Univ. Of Utah) , 4 & mgr; l TE-Puffer (pH 8,0) mit 2 ul BP Clonase Enzymmix, Inkubation 1 h bei 25 ° C und dann in One Shot TOP10 kompetente E. Transformation coli nach dem Protokoll des Herstellers.
3. Generieren Sie die d & bgr; h: EGFP-transgenen MYCN konstruieren ⁸ mit in Schritt 1.2 genannten rekombinanten Klonen System. Mischen Sie 1 ul jeder entry clone (150 ng / ul) mit einem 5,2-kb dβh Promotor (dβh -pDONR P4-P1R Konstrukt), EGFP fehlt ein Stop-Codon (PME-EGFP Konstrukt) und menschliche MYCN cDNA (ein großzügiges Geschenk von Dr. Hogarty an der Kinderklinik von Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 Konstrukt), 1 ul (150 ng / ul) des modifizierten Zielvektor, der I-SceI-Erkennungsstellen (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland), 4 ul TE Puffer ( pH-Wert 8,0) mit 2 & mgr; l LR Clonase Enzymmix, Inkubation 1 h bei 25 ° C und dann zu transformieren, um chemisch kompetente E. coli, wie One-Shot-Top-10 und folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
4. Stellen mitf: mitf transgenen Konstrukt ⁸ durch Verdauen des PNP-mitf Vektor mit NotI und SalI Restriktionsenzyme für 2 h bei RT und durch Subklonieren des frei 2,65-kb (ein großzügiges Geschenk von Dr. D. Raible, Univ of Washington.) DNA-Fragment, das die MITF-Promotor und die kodierende Sequenz des Zebrafisch MITF Gen in die NotI und MluI-Stellen eines modifizierten pBluescript-Vektor, der flankierenden I-SceI-Erkennungsstellen enthält (ein großzügiges Geschenk von Dr. Hui Feng, Boston University), unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gemß dem Protokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Um die Effizienz der Erzeugung von stabilen MYCN exprimierenden Linien zu erhöhen, d & bgr; h: EGFP-MYCN und mitf:. Mitf DNA-Konstrukte sind in einem Zellstadium Perlmutt Embryonen koinjiziert Perlmutt bezeichnet eine Art von mutierten Fische fehlt ein Neuralleiste stamm Melanophor während der Entwicklung ^36. Somit kann die Erscheinung von Pigmentzellen in den injizierten Embryos schlägt die Integration MITF: MITF DNA-Konstrukte in das Genom. Es wurde gezeigt, dass zwei oder drei koinjiziert DNA-Konstrukte können in das Fischgenom ³¹ kointegriert werden. EGFP-MYCN Transgen und zur leichteren Identifizierung von MYCN stabile transgene Linie: So kann die Pigmentierung von mitf Ausdruck verursacht als Marker für die Integration der dβh dienen.
5. Mischen Sie die d & bgr; h: EGFP-MYCN und mitf: mitf DNAKonstrukte in einem 3: 1-Verhältnis in einem Gesamtvolumen von 15 & mgr; l Reaktion mit 1 & mgr; l von I-SceI Enzym und 0,75 ul Puffer. Sicherzustellen, dass die Gesamtmenge an DNA in der Reaktion nicht 750 ng nicht überschreiten.
6. Führen Sie die I-SceI Verdauung bei RT für 4 h oder O / N. Am zweiten Tag wird die I-SceI- verdauten DNAs bereit sind für die Mikroinjektion oder bei -20 ° C für die Injektion in der Zukunft gespeichert werden. Bewahren Sie die I-SceI Enzym bei -80 ° C in kleinen Aliquots seiner Enzym zu gewährleiste.
7. Subklonieren die menschliche ALKF1174L und Wildtyp-ALK-Gen aus dem pcDNA3-Vektor (ein großzügiges Geschenk von Dr. George am Dana-Farber Cancer Institute) ⁷ in EcoRI- und NotI-Stellen eines pENTRY1A Vektor (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gemß dem Protokoll des Herstellers.
8. Generieren Sie die d & bgr; h: ALKF1174L </ Em> oder dβh: ALKWT transgene Konstrukte mit dem rekombinanten dessen Einzelheiten in Protokoll 1.2 erwähnt. Kurz gesagt, kombiniert drei Eingabe Klone dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (oder ALKWT -pENTRY1A) und P3E-polyA, in die modifizierte Zielvektor, der I-SceI-Erkennungsstellen (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland), mit LR Clonase Enzym-Mischung, nach dem Protokoll des Herstellers.
9. Mischen Sie die d & bgr; h: ALKF1174L (oder dβh: ALKWT) und dβh: mCherry DNA-Konstrukte zu einem 3: 1-Verhältnis und linearisieren sie mit I-SceI Enzym wie in PROTOKOLL 1,5-1,6 beschrieben.

2. Mikroinjektion

1. Verwenden Sie Glasmikropipetten mit 1,0 mm Durchmesser für alle Injektionen ^37. Brechen Sie die Spitze der Glasmikropipetten mit einer Rasierklinge vor der Injektion. Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen von spritzening H ₂ O in einen Tropfen Mineralöl. Der Durchmesser der resultierenden Tröpfchen und einstellen Mikroinjektor (Druck oder die Dauer der Druckimpuls), um sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen von weniger als 10% des gesamten Zellvolumens von einem zell Embryonen.
2. Fügen Sie eine zusätzliche 0,5 ml frisches I-SceI Enzym (5 Einheiten / ul) in 5 ul Injektionslösung, die DNA-Konstrukte direkt vor der Injektion die Effizienz der Transgenese ³⁸ zu erhöhen. Injizieren 50-80 pg linearisierter DNA-Konstrukte in das Zytoplasma einer Zelle-Embryonen. Um den Erfolg von Injektions sicherzustellen, mischen die Probe mit 0,25% Phenolrot zur Visualisierung. Wenn Zellen rot nach der Injektion, bedeutet dies, die Mikroinjektion erfolgreich ist. Um eine hohe Erfolgsquote für die Erzeugung transgener Fische zu gewährleisten, haben wir spritzen typischerweise bis zu 500 Embryonen.
3. Um transgene Fische stabil exprimieren MYCN erzeugen, coinject das linearisierte d & bgr; h: EGFP-MYCN und MITF: MITF-DNA-Konstrukten (in einer 3: 1-Verhältnis) in Embryonen der Pigmentierung Mutante Perlmuttzebrafisch beim Ein-Zell-Stadium. Die Expression Mitf dient als Reporter für die Integration der transgenen Konstrukte im Fischgenom.
4. Für Mosaikexpression von ALK in dem Wildtyp oder MYCN transgenen Embryos, Co-Injektion das linearisierte d & bgr; h: ALK F1174L (oder dβh: ALKWT) mit dβh: mCherry DNA-Konstrukte (bei ​​einem Verhältnis 3: 1) in die Ein-Zelle Embryonen aus der Zucht von F1 heterozygot Tg (dβh: EGFP-MYCN) erhaltenen transgenen Fisch mit Wildtyp AB Fische. So die Hälfte der Nachkommen transgen sind für MCYN und die Hälfte sind Wildtyp.

3. Bildschirm für stabile oder Mosaic transgene Fische

1. Um die Effizienz der Identifizierung von stabilen MYCN -exprimierenden Leitungen zu erhöhen, zu betäuben vorwiegend injiziert Perlmutt Embryonen Tricaine (0,02%) at Tage 3-5 des postfertilization und Bildschirm für die Pigmentierung. Übertragen Sie die Embryonen mit Pigmentierung auf eine neue Petrischale mit frischen Ei Wasser und heben Sie sie bis zur Geschlechtsreife für weitere Überprüfungen für den Gründer Fisch, der den d & bgr; h durchzuführen: EGFP-MYCN Transgen in den Keimzellen.
2. So ermitteln Sie den Gründer mit Keimbahntransmission von EGFP-MYCN, Outcross pigmentierte F0 wachsene Fische mit Wildtyp AB Fische und Bildschirm für EGFP-positiven Embryonen im 1-2 Tage nach der Befruchtung für weitere Genotypisierung. Legen Sie eine einzelne EGFP-positiven F1 Embryo in ein PCR-Röhrchen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. In 50 ul von gDNA Extraktionspuffer, die 12,5 ul der 4x Lysepuffer, 35 ul H ₂ O und 2,5 ul Proteinase K (10 mg / ml), um Embryo enthält. Inkubieren der Reaktion für 2-3 h bei 55 ° C, gefolgt von 10 Minuten Inkubation bei 98 ° C zur Inaktivierung von Proteinase K. Zu 50 ml 4x Lysepuffer machen, 500 & mgr; l von 1 M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1 M KCl to 47 ml H ₂ O. HINWEIS: Nach dem F0 MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp AB Fische gezüchtet, die alle die Nachkommen pigmentiert sind. So Pigmentierung nicht als Marker zur Identifizierung von MYCN- positive Fisch servieren. Während in der MYCN transgene Fische wird das EGFP-MYCN Fusionsprotein im PSNS exprimiert, einschließlich der sympathischen Neuronen des oberen Halsganglien und sequentiellen Ganglien des sympathischen Kette und den nicht PSNS dopaminergen Neuronen wie die Medulla oblongata und Kopfganglien ^8. So kann die Expression von EGFP als Marker zur Identifizierung der MYCN stabilen transgenen Embryos dienen.
3. Verwenden Sie 2 ul von gDNA aus der pigmentierten F1 Embryo als Vorlage extrahiert Primer MYCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG GAG AAC CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 ', und das folgende Programm Witzh die GC-RICH PCR System: 1 Zyklus 95 ° C für 3 min, 25 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 58 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 3 min. Wir Genotyp typischerweise 14-16 pigmentierten Embryonen aus einer Paarung, die Anwesenheit von integrierten MYCN Transgen in den pigmentierten Embryonen wurden über 6 Gründer Fisch überexprimieren MITF und MYCN wurden durch dieses Verfahren identifiziert bestätigen.
4. Heben Sie den Rest der EGFP-positiven F1-Embryonen. Fin Clip und Genotyp sie bei 2-3 Monate alt Verwendung des obigen Protokolls, um die Integration des Transgens in MYCN Fisches weiter zu bestätigen. Breed F1 MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp AB Fische. Co-spritzen den linearisiert d & bgr; h: ALK F1174L (oder dβh: ALKWT) mit dβh: mCherry DNA-Konstrukte in den einzelligen Embryonen in Protokoll 2.4 beschrieben.
5. Sortieren Sie die MYCN exprimierenden Embryos im Experiment in PROTOKOLL 2.4 beschrieben mit einem stereoskopischen Fluorescence Mikroskop und Bildschirm, die in erster Linie injizierten Embryonen an den Tagen 1-3 von postfertilization für die Expression von EGFP-MYCN im PSNS. Dann, während der Tage 2-5 des postfertilization, betäuben die Embryonen mit Tricaine (0,02%) und sortieren diese MYCN- positive oder negative Embryonen wieder basierend auf der Expression von mCherry im PSNS Verwendung eines stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop. Die Expression mCherry dient als Marker für die Coexpression von ALK in Geweben der Mosaikprimär injizierten Tieren.
   HINWEIS: ~ 600 Nachkommen aus der Zucht von MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp-Fisch resultierenden Pro Gruppe wurden mit den linearisierte DNA-Konstrukte injiziert, einschließlich d & bgr; h: ALK F1174L und dβh: mCherry, dβh: ALKWT und dβh: mCherry oder dβh : mCherry allein sind. Mosaik Expression mCherry in 70-90% des hauptsächlich eingespritzten Fische beobachtet werden. Die Hälfte einer ein-Drittel des injizierten Fische überlebten durch die Larvenstadium zur Tumor Uhr.
6. Heben Sie die gesamte mCherry + MYCN + und mCherry + MYCN - Embryonen gemäß den Standardprotokollen aus der Zebrafisch-Buch ³⁹ und überwachen Tumor Beginn beginnend bei 5 Wochen postfertilization.

4. Tumor Watch in Mosaic transgene Fische

1. Überwachen mCherry- positive primär injiziert Fisch alle 2 Wochen ab 5 Wochen postfertilization zum Nachweis von Tumor Beginn.
2. Anesthetize Fisch mit Tricaine (0,02%) und der Bildschirm für die Anwesenheit von mCherry - und EGFP-exprimierenden Tumoren in den PSNS unter Nikon SMZ-1500 stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop mit einer Digitalsicht DS-U1-Kamera ausgestattet.
3. Um zu bestätigen, ob die Tumoren der ALK Transgen exprimieren, isolieren mCherry- und EGFP-positive Massen für ALK Genotypisierung PCR.
4. Unter Verwendung von PCR, verstärken genomischer DNAALK P7:: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'und ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3' und die folgende PCR-Reaktion: 1 Zyklus aus entwickelten Tumoren mit den folgenden Primern extrahiert von 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen (94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 60 sec). Dann Folge das PCR-Produkt mit ALK P7 Primer weiter die Existenz von mutierten oder Wildtyp-ALK in den mCherry-positiven Tumoren bestätigen.

Ergebnisse

Um zu untersuchen, ob die Überexpression von Mutation aktiviert ALK F1174L oder Wildtyp-ALK konnte mit MYCN in Neuroblastom-Induktions zusammenzuarbeiten, überexprimiert wir entweder aktivierten menschlichen ALK oder Wildtyp-menschlichen ALK unter der Kontrolle der d & bgr; h Promotor in der PSNS transgener Fische überexprimierenden MYCN. Eine der folgenden Konstrukte, dβh - ALKF1174L oder dβh - in einzelligen Wildtyp oder ...

Diskussion

In dieser repräsentativen Studie verwendeten wir transiente Co-Injektion und Co-Expression von aktivierten ALK mit dem mCherry Reportergens in MYCN exprimierenden transgene Fische, um zu zeigen, dass diese Gene zusammenarbeiten, um deutlich zu beschleunigen den Ausbruch von Neuroblastom, im Einklang mit unseren früheren Feststellung in Verbindung stabil transgene Fische Koexpression beide aktiviert ALK und MYCN ^8. Dieses Mosaik transgenen Ansatz besitzt mehrere deu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Erweitern Sie das PCR-System mit langen Vorlagen	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO-Vektor	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA-Ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II Enzym Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II Enzymmix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-REICHES PCR-SYSTEM 	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuklease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoskopisches Fluoreszenzmikroskop	Nikon, NY
Nikon Digitalvisier DS-U1 Kamera	Nikon, NY