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Methodenartikel

Besetzung des Kurzfristige Fetal Schafe für Multivariate Chronische Non-narkotisierten Recordings

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DOI:

10.3791/52581

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25. Oktober 2015

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1Département de sciences cliniques, CHUV, Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC, 2Département d'obstetriques et de gynécologie, CHU Ste-Justine Research Centre, Université de Montréal, 3Département de neurosciences, CHU Ste-Justine Centre de recherche, Université de Montréal, 4Centre de recherche en reproduction animale (CRRA), Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die chronisch instrumentierten nicht-narkotisierten fetaler Schafsmodell wird verwendet, um die menschliche Entwicklung des Fötus in Gesundheit und Krankheit zu studieren, weil es chirurgische Platzierung und Wartung von Katheter und Elektroden, repetitive Blutentnahme, Substanz Injektion, Aufnahme der bioelektrischen Aktivität und in vivo-Bildgebung ermöglicht. Wir beschreiben die erforderlich ist, um dieses Modell zu etablieren Verfahren.

Zusammenfassung

Das chronisch instrumentierte trächtige Schaf wurde als Modell für die Entwicklung des menschlichen Fötus und die Reaktionen auf pathophysiologische Reize wie Endotoxine, Bakterien, Nabelschnurverschlüsse, Hypoxie und verschiedene pharmakologische Behandlungen verwendet. In diesem Modell wurden die lebensrettenden klinischen Praktiken der Glukokortikoid-Behandlung bei Frühgeburtsrisikofüßen und der therapeutischen Hypothermie entwickelt. Dies ist auf die einzigartige Zugänglichkeit des nicht anästhesierten fötalen Schafs für die chirurgische Platzierung und Wartung von Kathetern und Elektroden zurückzuführen, was eine wiederholte Blutentnahme, Substanzinjektion, Aufzeichnung der bioelektrischen Aktivität, Anwendung elektrischer Stimulation und In-vivo-Organbildgebung ermöglicht. Hier beschreiben wir das chirurgische Instrumentierungsverfahren, das erforderlich ist, um ein stabiles, chronisch instrumentiertes nicht-anästhesiertes fetales Schafmodell zu erreichen, einschließlich der Charakterisierung der postoperativen Erholung aus Sicht von Blutgasen, Stoffwechsel und Entzündungen.

Einleitung

Eine Vielzahl von Tiermodellen gibt es für die Untersuchung der normalen und kompromittiert Schwangerschaften, einschließlich Labornagern, nicht-menschlichen Primaten und Hauswiederkäuer. 1.2.3.4.5 Die chronisch instrumentierten trächtigen Schafen wurde ausgiebig seit 50 Jahren als verwendet ein Modell der menschlichen fötalen Entwicklung und antwortet pathophysiologische Stimuli, wie Lipopolysaccharid (LPS). 6-10 Die Läsionen nach der LPS-Exposition zu imitieren, was genau in Frühgeborenen mit Periventrikuläre Leukomalazie, was auf eine ähnliche Reifungsprofil beider Arten gesehen. 11, 12

Andere Komplikationen während der Schwangerschaft auch im Detail, wie die Entdeckung, dass vorgeburtliche Glukokortikoide fördern Lungenentwicklung 13-15 und das Verständnis der Auswirkungen der intrauterinen Wachstumsretardierung (IUGR) auf den Fötus 16,17 sucht.

Die umfangreiche Verwendung von fetalen Schafmodell aufgrund der uniq istue amenability des nicht-narkotisierten fetalen Schaf zur chirurgischen Anordnung und Wartung von Katheter und Elektroden, so dass sich wiederholende Blutentnahme Aufzeichnung bioelektrische Aktivität, Anlegen elektrischer Stimulation und in vivo bildgebenden Verfahren. 18 Telemetrie ist auch möglich, wenn auch weniger häufig verwendete doch aufgrund der höheren Komplexität als auch die Einrichtung als Anfangs und Wartungskosten. 19

Darüber hinaus ist das fetale Schafmodell sehr vielseitig, da viele Variationen der Instrumentierung möglich, je nach den Maßnahmen von Interesse. Beispielsweise ist es möglich, über mehrere Tage bis Wochen aufzuzeichnen multivariate Signale in Echtzeit wie fötalem Atembewegungen, elektrische Gehirnaktivität, Herzkreislaufreaktionen, Elektrokardiogramm, regionalen Blutfluss in einem Bereich von Organen mit Strömungssonden oder Mikrokügelchen, usw. Dank Diese Vielseitigkeit, eine breite Palette von Studien durchgeführt worden, einschließlich der Entwicklung der cardiovascular System 20,21, Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA) Achse 22, die Entwicklung des Gehirns 23 und Schlafzustände Entwicklung insbesondere 24, Auswirkungen von Hypoxie / Asphyxie 25, therapeutischen Hypothermie 26, Entzündung 6-11, Kombination von 27, Glucocorticoide 28,29, Anti-Depressiva 30, bronchopulmonalen Dysplasie (BPD) 31,32, fötale Programmierung 33,34,35,36,37,38,39 oder Entwicklung neuartiger fetale Überwachung Modalitäten vor und während der Geburt zu aber Namen ein einige Bereiche der Untersuchung. 40,41,42,43

Das übergeordnete Ziel des vorgestellten Verfahrens ist es, grundlegende Implementierung dieser vielseitigen Modells zeigen. Es ermöglicht die Einrichtung einer Vielzahl von akuten und chronischen experimentelle Protokolle studieren fetalen Physiologie und Pathophysiologie an der integrativen, Orgel, zellulärer und molekularer Ebene.

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Protokoll

Tierpflege folgte den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und der Genehmigung durch die Université de Montréal Council on Animal Care (Protokoll # 10-Rech-1560). Detaillierte Informationen über Materialien und Methoden ist in der Tabelle 1 angegeben.

1. Anästhesie

  1. Legen Sie eine Single-Lumen-Katheter in eine Halsschlagader.
  2. Sedieren das Mutterschaf mit Acepromazin (Atravet 10 mg / ml) 2 mg intravenös etwa 30 min vor der Einleitung der Narkose, um Spannungen mit der Prozedur, die wiederum reduziert Cortisolspiegel zu reduzieren.
  3. Verabreichen Diazepam (Diazepam 5 mg / ml) 20 mg Ketamin (Ketalar 100 mg / ml), 4-5 mg / kg und Propofol (Propofol 10 mg / ml) 0,5 bis 1 mg / kg intravenös an allgemeine Betäubung.
  4. Legen Sie eine Atemwegsaustauschkatheter in die Luftröhre mit Hilfe eines Laryngoskops mit einer Wisconsin-Typ Klinge (Extralange 350 mm Linkshänder Blade), um mit der Intubation zu unterstützen. Schieben des Silizium Endotrachealtubus (9 bis 12 mm Innendurchmesser) von dem Atemweg Austauschkatheter in die Luftröhre. Diese Technik ermöglicht die Intubation Prozess. Pumpen Sie die Manschette des Endotrachealtubus sorgfältig, um den Druck-induzierten Ulzera der Luftröhre zu vermeiden und fixieren das Rohr auf den Kopf des Mutterschaf.
  5. Verbinden Sie den Tubus auf die Atemkreis des Narkosegerät und beginnt sofort mit der mechanischen Beatmung. Ventilatoreinstellungen anzupassen, um eine P a CO 2 innerhalb der normalen Grenzen von 35 bis 45 mmHg zu erhalten.
  6. Setzen Sie einen Katheter in die A. auricularis (22 bis 20 g; 1 in [0,9 x 25 mm], um 1.16 in [1.1 x 30 mm]) und eine Verbindung zu nicht konformen Schlauch an direkten arteriellen Blutdruck zu überwachen.
  7. Verwenden Sie ein Multiparameter-physiologischen Monitor an das Elektrokardiogramm, direkte arterielle Blutdruck, Sauerstoffsättigung (SpO 2), Kapnographie aufnehmen (P ET CO 2), und die Temperatur alle 5 min. Übertragen Sie alle physiologic Daten über ein serielles Kabel an eine zentrale physiologische Daten Sammelcomputer. Aufrechterhaltung der normalen Körpertemperatur mit Hilfe eines Umlaufwasserdecke.
  8. Verwalten eines ausgewogenen polyionische Lösung bei 10 ml / kg für die erste Stunde der Narkose und dann auf 5 ml / kg / h zu verringern.
  9. Verwalten Trimethoprim-Sulfadoxin 5 mg / kg IV des Mutterschaf gerade vor dem Hautschnitt als Antibiotikaprophylaxe.
  10. Verwenden Sie Standard-aseptischer Techniken bei allen chirurgischen Manipulationen des Mutterschaf und Fötus.
  11. Barrier Krankenschwester die Mutterschafe zu allen Zeiten. Dies schließt auch den nicht-chirurgischen Personals. Dadurch wird der enzootischen Potenzial zB Coxiella burnetii zu minimieren. Mit Handschuhen und Masken (N-95-Typ) zu allen Zeiten.

2. Überblick über das chirurgische Verfahren

  1. Machen Sie eine 20 cm Mittelschnitt durch den unteren Bauchwand unmittelbar kranial des Euters durch die Linea alba, um Bauchmuskelschäden zu minimieren.
    1. Retract das große Netz kranial und die Gebärmutterhörner werden manuell palpiert. Abtasten jedes Horn aus dem Körper des Uterus auf die Spitze des Horns zu bemerken, die Zahl der Feten und ihrer Größe. Wenn es mehr als ein Fötus, wählen Sie die größere Fötus durch die Auswertung manuell die Kopfgröße und die Breite zwischen den Umlaufbahnen.
    2. Halten Sie den Kopf des Fötus gewählt fest durch die Gebärmutter teilweise nach außen verlagert. Führen Sie eine 10 cm hysterotomy auf der großen Krümmung mit Metzenbaumschere. Setzen Sie sofort über den Kopf eine nicht-Latex-sterile OP-Handschuh mit steriler Kochsalzlösung gefüllt ist, als ob es eine Hand waren. Alternativ können Sie angefeuchteten 4x4, um die fetale Kopf feucht zu halten. Sichern Sie die Gebärmutter, um die Bauchwand.
      1. Exteriorisieren der rechten und linken Brust Gliedmaßen und ziehen Sie den Fötus vorsichtig aus der Gebärmutter bis zum Schwertfortsatz.
    3. Legen Polyvinyl Katheter in die rechte und linke Armvene und Arterien mit einem Standard-Cut-down-Technik. Legen another Polyvinylkatheter in die Amnionhöhle durch Fixieren ihrer 'Ende mit dem Brustbein des Fötus.
      1. Verwenden Sie nur sterile Katheter. Wir empfehlen Gassterilisation in Ihrem Standard-Anlage. Befestigen Sie jede Katheters mit einer Nadel und die Nadel in einen doppelten Hahn für eine spätere Entnahme von Blut oder Drucküberwachung zu ermöglichen.
    4. Naht Edelstahl-Elektroden, um den Hammergriff, Schwertfortsatz und zu jedem Punkt der Schulter, um die EKG-Überwachung (EKG).
    5. Bringen Sie den Fötus in die Gebärmutter. Alle Katheter und Elektroden Ausfahrt über eine kleine Stichinzision in der linken Flanke.
    6. Schließen Sie die Laparotomie mit einem Drei-Schicht-Verschluss. Naht der Bauchwand mit einem synthetischen resorbierbaren Monofilamentnahtmaterial USP 2 in einer einfachen kontinuierlichen Weise. Schließen Sie den subkutanen Raum mit einem synthetischen resorbierbaren geflochtenen Naht USP 0 in einem einfachen kontinuierlichen Weise. Verwenden chirurgischem Edelstahl Klammern, um den Hautschnitt zu schließen.
  2. Beschreibung der chirurgischen Prozedur
    1. Entfernen Wolle durch Rasieren das Schwertfortsatz auf die Brustdrüse und entlang der Falte der Flanke auf jeder Seite mit einer Klinge # 40 Reinigen Sie das ventrale Abdomen dann gründlich mit einer 4% Chlorhexidingluconat und einer weichen Bürste für 3 min.
      1. Führen Sie eine Standard-sterile Peeling mit Chlorhexidingluconat 4% von der Mitte des Bauches und Fortschritte in einer Kreisel Mode für 3 min. Gießen Sie steriler Kochsalzlösung auf den Bauch, um das Desinfektionsmittel Seife entfernen. Für den letzten Schritt des chirurgischen Vorbereitung, führen drei alternative Passagen Chlorhexidingluconat-Lösung 2% Isopropylalkohol 70%.
    2. Sicherstellen, dass die Tiefe der Anästhesie ausreichende vor der Inzision. Einen Standard Laparotomieschnitts vom Nabel nur Schädel an das Euter durch die Linea alba, um Bauchmuskelschäden zu minimieren.
    3. Führen Sie einen langen Schwammzange in den Bauch auf der linken Bauchwand bisder geplanten Austrittsstelle für Katheter im paracostal Region.
      1. Stecken Sie die Spitzen der Pinzette gegen die Wand, bis eines Assistenten kann es zu lokalisieren und bestätigen Sie die entsprechende Website. Öffnen Sie leicht (1 cm) der Backen der Zange und lassen Sie den Assistenten machen einen 2 cm voller Dicke Stichinzision.
      2. Exteriorisieren die Spitzen der Pinzette durch den Einschnitt, wieder zu öffnen, und sanft erfassen die Katheter mit der Zange, die wird schließlich aus dem Bauch durch die ventrale Bauchschnitt gezogen. Zu beachten ist, einige Gruppen zu implantieren, die Katheter und dann exteriorisieren ihnen. Dies hat den Nachteil, dass intra fötalen EKG-Überwachung ist nicht möglich.
    4. Tasten Sie die Gebärmutter, um fötalen Position und Zahlen zu ermitteln. Bestimmen Sie die größte Fötus mit der interaurale erreichbar. Einzuschneiden der Gebärmutterwand auf der großen Krümmung über dem Rücken des Kopfes, die Vermeidung der Keimblättern.
      1. Legen Sie eine stumpfendige Kanüle durch die Plazentamembranen, um eine Uhr zu erhaltenniotic Flüssigkeitsprobe frei von Blutungen. Einzuschneiden die Plazentamembranen mit einer Schere.
    5. Exteriorisieren die Schädel Hälfte des Fötus durch diesen Einschnitt. Legen Sie eine sterile nicht Latex chirurgische Handschuh mit steriler Kochsalzlösung bei 37 ° C über den Fötus Kopf gefüllt zur Aufrechterhaltung der Normothermie.
      1. Während der Entfernung des fetalen Oberkörper aus der Gebärmutter, haben der Assistent halten Sie die Babcock herauf, um den Verlust von Fruchtwasser zu verhindern. Dann, wiederum unter Verwendung Babcock Zange klemmen die fötalen Membranen und Gebärmutterwand zur Haut Bauch Kontamination mit Fruchtwasser zu verhindern.
      2. Expose nur die Teile des fetalen Körpers, die instrumentiert werden und die restlichen Teile in der Gebärmutter zu halten oder mit feuchten und warmen (37 ° C) sterilen Tüchern abgedeckt, die jeweils benötigen.
    6. Entführen die beiden Brust Gliedmaßen, um die Exposition gegenüber der Oberarmarterie zu erleichtern und Vene auf bilateraler Ebene. Einzuschneiden entlang der medialen Seite von sowohl Antebrachiums und Pflegevollständig um die Oberarmarterie und Vene zu sezieren.
    7. Legen Polyvinyl Katheter in den rechten und linken Arm-Arterien und links Armvene mit einem Standard-Cut-down-Technik.
      1. Befreien Sie das Schiff, um von benachbarten Gewebe über 1 cm katheterisiert werden. Ligieren der distale Abschnitt des Gefäßes mit einem geflochtenen synthetischen resorbierbaren USP 2-0 Naht. Preplace eine Ligatur am proximalen Aspekt des Schiffes aber halten Sie es losgebunden.
        1. Verwendung CASTRO Schere, geschnitten das Gefäß quer zu etwa 30% seines Durchmessers. Stoppen Sie den Blutfluss teilweise durch Ziehen an der proximalen Naht. Stecken Sie den Katheter in proximaler Richtung.
      2. Legen Sie die Polyvinyl-Katheter bis zu 8 cm proximal oder bis Widerstand erkannt und ziehen Sie dann leicht zurück. Zeitlich sichern den proximalen Teil des Katheters mit einer Gefäßklemme. Stellen eine weitere Naht um sowohl den proximalen und distalen Seite des Katheters. Ein Assistent wird kontinuierlich aspirating und Spülen des Katheters, um die Durchgängigkeit des Katheters zu gewährleisten.
      3. Schließen Sie die fetale Haut mit einem USP 2-0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial, mit einer fortlaufenden Naht Muster.
    8. Auf der rechten und der linken Schulter, Manubrium und Schwertfortsatz, befestigen eine isolierte Edelstahl-Elektrode, um die Überwachung des fötalen ECG zu erleichtern.
    9. Naht der Fruchtwasserdruck und Sampling-Katheter mit dem Brustbein. Dieser Katheter ist an seinem Ende gefenstert.
    10. Sicherung aller der Katheter auf dem Rücken des Fötus unter Verwendung einer USP 2-0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial.
    11. Vor dem Austausch des Fötus zurück in die Gebärmutter, zu verwalten Clenbuterol 30 ug IV langsam über 15 Minuten zu Hypotonie zu vermeiden und Gebärmutter Entspannung.
    12. Naht der Eihäute mit USP 4-0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial mit einem durchgehenden Muster. Integrieren Sie nur einen Katheter oder eine Elektrode in einer Zeit, in die closure, um einen dichten Verschluß zu gewährleisten. Verwenden Sie einen Doppelschicht-Cushing-Muster respektieren Halsted Prinzipien, um die Gebärmuttermuskelschicht zu schließen mit einem USP 0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial. Begraben die chirurgische Knoten sorgfältig.
    13. Unter Verwendung einer Tabaksbeutelnaht Muster, sichern alle Katheter und EKG-Kabel wie sie aus der linken paracostal Einschnitt.
    14. Unter Verwendung eines USP 2 Monofilament synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial sichern die Linea alba mit einem kontinuierlichen Muster. Schließen Sie die subkutanen Gewebe unter Verwendung USP 2-0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial mit einem durchgehenden Muster. Sichern Sie die Hautschicht mit chirurgischen Klammern.
    15. Verabreichen 250 mg Ampicillin intravenös und wieder über die Frucht Katheter in die Amnionhöhle. Ersetzen Sie verlorene Fruchtwasser mit warmem Salzlösung.
    16. Legen Sie alle exteriorisiert Katheter und EKG-Elektroden in einen Ort Beutel, um die Sterilität zu erhalten. Legen Sie einen glatt um den Oberkörper des Mutterschaf, alle Katheter eine Sicherungd Elektroden auf den Körper des Mutterschaf.
    17. Stoppen Vollnarkose und extubieren die ewe einmal Kehlkopfreflexe wieder normalisiert haben.
    18. Schicken Sie das Mutterschaf zu einer Stoffwechselkäfig, sobald sie stabil folgenden Vollnarkose. Das Mutterschaf in der metabolischen Käfig für die Dauer des Experiments liegen. Das Mutterschaf sollten in der Lage zu stehen, sich hinzulegen und zu essen ad libitum während der Überwachung des nicht-narkotisierten Fötus ohne sedierende die Mutter zu sein.
    19. Für die folgenden drei Tagen zu verabreichen Antibiotika prophylaktisch auf das Mutterschaf (Trimethoprim sulfadoxine 5 mg / kg) und Fetus (250 mg Ampicillin intravenös und wieder über das Fruchtwasser Katheter).
    20. Bewerten Sie die Stoffwechsellage der beiden Mutterschaf und Fötus mit Blutgasanalysen.
    21. Spülen Sie alle Katheter mit dem minimalen Volumen von heparinisierter Kochsalzlösung möglich ist. Achtung - Sie überschreiten nicht die tägliche Dosis von Heparin und Flüssigkeiten zulässig für den Fötus. Es ist möglich, Flüssigkeitsüberbelastung den Fötus. Flush langsam einmalTag ~ 5 ml NaCl pro Zeile nach der Antibiotika-Prophylaxe.
  3. Datenerfassung und Analyse
    1. Während der Operation wahlweise Aufzeichnung der mütterlichen und fetalen EKG und Herzfrequenz sowie mütterlichen arteriellen Blutdruck und Atemwegsdruck (Paw) kontinuierlich (Abbildung 1). Verwenden Sie das Leben Monitorfenster, um alle Daten außer mütterlichen EKG zu erwerben. Futtermittel, die solche Daten in Analog-Digital-Wandler zusammen mit fetale und maternale EKG-Signale; geben mütterlichen und fetalen EKG zunächst in 1901 Vorverstärker. Die Bilanz und zeigt alle Daten in Herstellersoftware.
    2. Nehmen Sie einen 1 mL arteriellen Probe gleichzeitig vom Mutterschaf und Fötus für die arterielle Blutgasanalyse, Laktat, Glukose und stützen überschüssige Bestimmung (im Plasma) am Beginn der fetalen Chirurgie (unmittelbar nach dem Einsetzen des ersten Arterienkatheter) und nach dem Schließen der Gebärmutter .
    3. Während der postoperativen Erholung, werfen Sie einen 3 ml fetalen Blutprobe, um die IL-6 und TNF-α Inflamm messenAtory Profile. Zentrifuge das Plasma bei 4 ° C (4 min, 4.000 x g) Dekantieren und Speichern der Plasma bei -80 ° C für die nachfolgenden ELISA-Tests.
      Anmerkung: Für den Zweck der berichteten repräsentative Ergebnisse, sechs Tage nach der Operation wurden die Tiere unter Verwendung von intravenöser Injektion von 20 ml Natriumpentobarbital getötet. Fetale Wachstum wurde von Körper, Gehirn, Leber und Müttergewichte bewertet. Die Dauer der Probezeit wird natürlich variieren je nach der für den jeweiligen Forschungsfrage gewählte Design ab und kann 6 Wochen zu erreichen ~.
  4. Zytokin Analysen (optionaler Schritt)
    1. Bestimmen Cytokinkonzentrationen (IL-6, TNF-α) im Plasma unter Verwendung eines Schaf-spezifischer Sandwich-ELISA. Precoat-Maus-Anti-Schaf-monoklonale Antikörper (Fang-Antikörper-IL-6) oder Maus-anti-Rinder-monoklonalen Antikörper (TNF-α) in einer Konzentration 4 ug / ml auf ELISA-Platten bei 4 ° C für O / N nach 3mal Waschen mit Waschpuffer (0,05% Tween 20 in PBS, PBST).
    2. Die Platten für 1 h mit 1% BSA in PBST. 3 Mal Waschen Sie die Platten mit Waschpuffer.
    3. Verwenden rekombinanter Proteine ​​Schafe (IL-6, TNF-α) als Standard-ELISA, bereiten eine serielle Verdünnungen reichen von Standard 1 von 2.000 ng / ml bis Standard 7 von 31,25 pg / ml.
    4. Last 50 ul Serien verdünnten Protein Standards und Proben pro Well und Inkubation für 2 h bei RT, waschen Sie die Platten 3-mal. Führen Sie alle Standards und Proben in zweifacher Ausfertigung.
    5. Je 50 & mgr; l von Kaninchen-Anti-Schaf-polyklonaler Antikörper (Nachweis-Antikörper IL-6) oder Kaninchen-anti-Rinder-polyklonalen Antikörpers (TNF-α) in einer Verdünnung von 1: 250 in den Vertiefungen und Inkubieren für 30 min bei RT. 5 mal Waschen Sie die Platten mit Waschpuffer.
    6. Dann werden 50 ul des Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP konjugiert (Verdünnung 1: 5000) für 30 min.
    7. Inkubieren mit 50 & mgr; l TMB-Substrat-Lösung pro Well.
    8. Stoppen Farbentwicklungsreaktion zum gewünschten Zeitpunkt mit 25 ul 2 N Schwefelsäure.
    9. Lesen Sie die plAtes auf ELISA-Plattenlesegerät bei 450 nm, mit einem 570 nm Wellenlängenkorrektur.
      Anmerkung: In unseren Assays die Empfindlichkeit der IL-6 ELISA war 16 pg / ml, die Empfindlichkeit von TNF-a ELISA betrug 13,9 pg / ml. Für alle Tests wurde die Intra-Assay und Inter-Assay-Variationskoeffizienten <5% und <10% betragen.
  5. Statistische Auswertungen
    Hinweis: Die genauen statistischen Methoden werden auf der Fragestellung ab. Hier berichten wir über die verwendet werden, um signifikante Unterschiede bei den in Tabelle 2 angegebenen Blutgase Prüfverfahren.
    1. Testen normalen Datenverteilung mit Kolmogorov-Smirnov-Test, gefolgt von parametrisch oder nicht-parametrische Tests mit Anpassung für multiple Vergleiche, als angemessen.
    2. Verwenden K-Mittel-Cluster-Analyse, um die Föten in der Kohorte, die spontan hypoxischen waren und legt die jeweiligen pO 2 und O 2 Sat-Werte (betrachten pO 2 <20 mmHg oder O 2 Sa <55%, wie Fetal Hypoxie). 44-48
    3. Verwenden statistischer Software wie SPSS für die Analysen.
    4. Vorliegenden Daten als Mittelwert ± Standardabweichung mit statistischen Unterschiede bei p <0,05 als signifikant angesehen.

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Ergebnisse

38 schwangere zeit vom Mutterschafe wurden bei 128 ± 2 Tagen der Trächtigkeit instrumentiert (DGA ~ 0,88 Trächtigkeit tige 145 DGA) mit arteriellen, venösen und Frucht Katheter und Elektrokardiogramm (EKG) Elektroden mit steriler Technik unter Vollnarkose (sowohl Mutterschaf und Fötus ). Im Falle einer Zwillingsschwangerschaft wurde der größere Fetus basierend auf Palpation und der Schätzung der intertemporalen Durchmesser gewählt wird; alternativ kann der Fötus instrumentiert werden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt w...

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Diskussion

Das Anästhetikum und chirurgischen Verfahren vorgestellt, das für die Herstellung eines Tiermodells zur Untersuchung der Physiologie und Pathophysiologie fötalen erforderlich sind: die chronisch mit Instrumenten nicht-narkotisierten fetalen Schafen.

Vier kritischen Schritte in dem Protokoll hervorzuheben. Erstens, vorbei an den Katheter und Elektroden durch das mütterliche Flanke: Es ist wichtig, dass dies sofort getan an inneren Organen Verletzungen zu vermeiden. Zweitens Befestigen des ute...

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Offenlegungen

Es wurden keine Angaben gemacht.

Danksagungen

Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die Molly Towell Perinatal Research Foundation, die Canadian Institutes of Health Research (CIHR) und den Fonds de Recherche du Québec – Santé (FRQS) (an MGF) und das CIHR-Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR) (an LDD).

Die Autoren danken Esther Simard, Marco Bosa, Carl Bernard und Carmen Movila für ihre technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ACE LichtquelleSchott-FostecA20500
PräparierschereFine Science Tools14060 - 11
Abgewinkelte PräparierschereFine Science Tools15006 - 09
SkalpellgriffFine Science Tools10003 - 12abwechselndes Präparierwerkzeug
Gebogene Skalpellklingen #12Fine Science Tools10012 - 00abwechselndes Präparierwerkzeug
KnochenschereFine Science Tools16044 - 10
S & T NahtbindezangeFine Science Tools00272 - 13
Dumont SS Pinzette - abgewinkeltFine Science Tools11203 - 25 
Geflochtenes Seidennaht Größe 6-0Teleflex Medical07 - 30  - 10
Medical TapeTranspore3M
Ketaminhydrochlorid 100 mg/mlHospiraNDC 0409 - 2051 - 05Final Does is 80 mg/kg
Tranqui Ved Injection (Xylazin 100 mg/ml)VecdoNDC 50989 - 234 - 11Final Does is 10 mg/kg
Reactive orange 14Sigma - AldrichR - 8254
Ringers Lösung KomponentenDie Lösung ist gasausgeglichen mit 95 % O2 und 5 % Co2, endgültiger pH-Wert 7,4
NatriumchloridSigma - AldrichS7653Endkonzentration: 118 mM
KaliumchloridFisher ScientificP217 - 3Endkonzentration: 4,7 mM
Calciumchlorid-DihydratFisher ScientificC79 - 500Endkonzentration: 2,5 mM
Kaliumphosphat einbasischFisher ScientificP -285Endkonzentration: 1,2 mM
MagnesiumsulfatJ.T. BakerJan-00Endkonzentration: 0,57 mM
4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES)Fisher ScientificBP 310 - 500Endkonzentration: 5,95 g/L
GlukoseSigma - AldrichG8270Endkonzentration: 5,5 mM
LifeWindowDigicare Biomedical Technology
CED-Bioverstärker und ADC-EinheitenCambridge Electronic Design Limited,
Unit 4, Science Park,
Milton Road,
Cambridge CB4 0FE
ENGLAND.		Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Datenerfassungssoftware: Spike 2, V7.13
Neurolog Analogsignal-BioverstärkerDigitimer Ltd
37 Hydeway
Welwyn Garden City
Hertfordshire, AL7 3BE, England		NL108A
ABL800FlexRadiometer Kanada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2
Eppendorf 5804REppendorf Kanada; 2810 Argentia Road, #2
Mississauga, Ontario, L5N 8L2
Arrow Jugularkatheter-SetArrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA
Atravet10 mg/ml
Diazepam5 mg/ml
Ketamin Ketalar100 mg/ml
Propofol10 mg/ml
SurgiVeTEndotrachealtuben; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA
Cook Atemwegsaustauschkatheter mit RAPI-FIT-AdapternCook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA
Dispomed BeatmungsgerätDispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6
BD Insyte-WBecton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA22 bis 20 G; 1,1 x 30 mm [0,9 x 25 mm] bis 1,16 Zoll [1,16 Zoll]
Edwards Lifesciences Ref: PX272 Drucküberwachungskit mit TruWave Einweg-Druck-LifeWindow
LW6000Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA
Gaymar
Babcock
Polyvinyl-KatheterSCI (Scientific Commodities Inc.)2 Meter
2-0 Vicryl
Castroviejo Schere
Elektrokardiogramm (EKG)LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Deutschlandvier Kupferelektroden in einer Hülle, 2
Meter 2-O Vicryl
3-0 Vicryl
PDS II USP
Trimethoprim Sulfadoxin
Ampicillin
StopcockArgon Medical, Cat  041220001ADoppelter 4-Wege-Absperrhahn mit männlicher Luer-Lock-Nadel
Tyco Healthcare 8881202389Monoject Aluminium-Nabe, stumpfe Nadeln, 22Gx, 0,7 mm x 38,1 mm: für fetale arterielle und venöse Katheter
Nadeln TycoHealthcare 8881202322Monoject Aluminium-Nabe, stumpfe Nadeln, 16Gx, 1,6 mm x 38,1 mm: für Amnionkatheter

Referenzen

  1. Barry, J. S., Anthony, R. V. The pregnant sheep as a model for human pregnancy. Theriogenology. 69, 55-67 (2008).
  2. Morrison, J. L. Sheep models of intrauterine growth restriction: fetal adaptations and consequences. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 730-743 (2008).
  3. Rees, S., Inder, T. Fetal and neonatal origins of altered brain development. Early Hum Dev. 81, 753-761 (2005).
  4. Rees, S., Harding, R., Walker, D. The biological basis of injury and neuroprotection in the fetal and neonatal brain. Int J Dev Neurosci. 29, 551-563 (2011).
  5. Moisiadis, V. G., Matthews, S. G. Glucocorticoids and fetal programming part 1: Outcomes. Nat rev Endocrinol. 10, 391-402 (2014).
  6. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 343-353 (2006).
  7. Gotsch, F., et al. The fetal inflammatory response syndrome. Clin Exp Obstet Gynecol. 50, 652-683 (2007).
  8. Svedin, P., Kjellmer, I., Welin, A. K., Blad, S., Mallard, C. Maturational effects of lipopolysaccharide on white-matter injury in fetal sheep. J child neurol. 20, 960-964 (2005).
  9. Nitsos, I., et al. Chronic exposure to intra-amniotic lipopolysaccharide affects the ovine fetal brain. J Soc Gynecol Investig. 13, 239-247 (2006).
  10. Yan, E., Castillo-Melendez, M., Nicholls, T., Hirst, J., Walker, D. Cerebrovascular responses in the fetal sheep brain to low-dose endotoxin. Pedia res. 55, 855-863 (2004).
  11. Dean, J. M., et al. Delayed cortical impairment following lipopolysaccharide exposure in preterm fetal sheep. Ann Neurol. 70, 846-856 (2011).
  12. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum Dev. 3 (1), 79-83 (1979).
  13. Liggins, G. C. Premature parturition after infusion of corticotrophin or cortisol into foetal lambs. J Endocrinol. 42, 323-329 (1968).
  14. Liggins, G. C. Premature delivery of foetal lambs infused with glucocorticoids. J Endocrinol. 45, 515-523 (1969).
  15. Liggins, G. C., Fairclough, R. J., Grieves, S. A., Kendall, J. Z., Knox, B. S. The mechanism of initiation of parturition in the ewe. Recent Prog Horm Res. 29, 111-159 (1973).
  16. Morrison, J. L. Sheep models of intrauterine growth restriction: fetal adaptations and consequences. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 730-743 (2008).
  17. Robinson, J. S., Hart, I. C., Kingston, E. J., Jones, C. T., Thorburn, G. D. Studies on the growth of the fetal sheep. The effects of reduction of placental size on hormone concentration in fetal plasma. J Dev Physiol. 2, 239-248 (1980).
  18. Carmel, E., et al. Fetal brain MRI - experiences in the ovine model of cerebral inflammatory response. Repro sci. 19 (3), 347A-348A (2012).
  19. Samson, N., Dumont, S., Specq, M. L., Praud, J. P. Radio telemetry devices to monitor breathing in non-sedated animals. Respir Physiol Neurobiol. 179, 111-118 (2011).
  20. Thakor, A. S., Giussani, D. A. Effects of acute acidemia on the fetal cardiovascular defense to acute hypoxemia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 296, R90-R99 (2009).
  21. Green, L. R., Kawagoe, Y., Homan, J., White, S. E., Richardson, B. S. Adaptation of cardiovascular responses to repetitive umbilical cord occlusion in the late gestation ovine fetus. J Physiol. 535, 879-888 (2001).
  22. Unno, N., et al. Changes in adrenocorticotropin and cortisol responsiveness after repeated partial umbilical cord occlusions in the late gestation ovine fetus. Endocrinology. 138, 259-263 (1997).
  23. Muller, T., et al. Developmental changes in cerebral autoregulatory capacity in the fetal sheep parietal cortex. J Physiol. 539, 957-967 (2002).
  24. Keen, A. E., Frasch, M. G., Sheehan, M. A., Matushewski, B., Richardson, B. S. Maturational changes and effects of chronic hypoxemia on electrocortical activity in the ovine fetus. Brain Res. 1402, 38-45 (2011).
  25. Ross, M. G., et al. Correlation of arterial fetal base deficit and lactate changes with severity of variable heart rate decelerations in the near-term ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 208, e281-e286 (2013).
  26. Gunn, A. J., Gunn, T. R., de Haan, H. H., Williams, C. E., Gluckman, P. D. Dramatic neuronal rescue with prolonged selective head cooling after ischemia in fetal lambs. J Clin Invest. 99, 248-256 (1997).
  27. Xu, A., Piorkowska, K., Matushewski, B., Hammond, R., Richardson, B. S. Adaptive Brain Shut-Down Counteracts Neuroinflammation in the Near-Term Ovine Fetus. 60th Meeting of the Society for Gynecologic Investigation, 20 (3), Reproductive Sci. 222A(2013).
  28. Derks, J. B., et al. A comparative study of cardiovascular, endocrine and behavioural effects of betamethasone and dexamethasone administration to fetal sheep. J Physiol Lond. 499, 217-226 (1997).
  29. Lohle, M., et al. Betamethasone effects on fetal sheep cerebral blood flow are not dependent on maturation of cerebrovascular system and pituitary-adrenal axis. J Physiol. 564, 575-588 (2005).
  30. Morrison, J. L., et al. Maternal fluoxetine infusion does not alter fetal endocrine and biophysical circadian rhythms in pregnant sheep. J Soc Gynecol Investig. 12, 356-364 (2005).
  31. Allison, B. J., et al. Ventilation of the very immature lung in utero induces injury and BPD-like changes in lung structure in fetal sheep. Pediatr Res. 64, 387-392 (2008).
  32. Rozance, P. J., et al. Intrauterine growth restriction decreases pulmonary alveolar and vessel growth and causes pulmonary artery endothelial cell dysfunction in vitro in fetal sheep. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, L860-L871 (2011).
  33. Fowden, A. L., Giussani, D. A., Forhead, A. J. Endocrine and metabolic programming during intrauterine development. Early hum dev. 81, 723-734 (2005).
  34. Nathanielsz, P. W., Hanson, M. A. The fetal dilemma: spare the brain and spoil the liver. J Physiol. 548, 333(2003).
  35. Manikkam, M., et al. Fetal programming: prenatal testosterone excess leads to fetal growth retardation and postnatal catch-up growth in sheep. Endocrinology. 145, 790-798 (2004).
  36. Savabieasfahani, M., et al. Fetal programming: testosterone exposure of the female sheep during midgestation disrupts the dynamics of its adult gonadotropin secretion during the periovulatory period. Biol Reprod. 72, 221-229 (2005).
  37. Bergen, N. H., et al. Fetal programming alters reactive oxygen species production in sheep cardiac mitochondria. Clin Sci (Lond). 116, 659-668 (2009).
  38. Cox, L. A., et al. A genome resource to address mechanisms of developmental programming: determination of the fetal sheep heart transcriptome. J Physiol. 590, 2873-2884 (2012).
  39. Mahoney, M. M., Padmanabhan, V. Developmental programming: impact of fetal exposure to endocrine-disrupting chemicals on gonadotropin-releasing hormone and estrogen receptor mRNA in sheep hypothalamus. Toxicol Appl Pharmacol. 247, 98-104 (2010).
  40. Blad, S., Welin, A. K., Kjellmer, I., Rosen, K. G., Mallard, C. ECG and Heart Rate Variability Changes in Preterm and Near-Term Fetal Lamb Following LPS Exposure. Reprod Sci. 15, 572-583 (2008).
  41. Frasch, M. G., et al. Heart rate variability analysis allows early asphyxia detection in ovine fetus. Reprod Sci. 16, 509-517 (2009).
  42. Frasch, M. G., Keen, A. E., Gagnon, R., Ross, M. G., Richardson, B. S. Monitoring fetal electrocortical activity during labour for predicting worsening acidemia: a prospective study in the ovine fetus near term. PLoS One. 6, e22100(2011).
  43. Durosier, L. D., et al. Sampling rate of heart rate variability impacts the ability to detect acidemia in ovine fetuses near-term. Front pedia. 2, 38(2014).
  44. Danielson, L., McMillen, I. C., Dyer, J. L., Morrison, J. L. Restriction of placental growth results in greater hypotensive response to alpha-adrenergic blockade in fetal sheep during late gestation. J Physiol. 563, 611-620 (2005).
  45. Edwards, L. J., Simonetta, G., Owens, J. A., Robinson, J. S., McMillen, I. C. Restriction of placental and fetal growth in sheep alters fetal blood pressure responses to angiotensin II and captopril. J Physiol. 515 (Pt 3), 897-904 (1999).
  46. Xu, A., et al. Adaptive brain shut-down counteracts neuroinflammation in the near-term ovine fetus. Front neurol. 5, 110(2014).
  47. Xu, A., et al. The Ovine Fetal and Placental Inflammatory Response to Umbilical Cord Occlusions With Worsening Acidosis. Reprod Sci. 22 (11), (2015).
  48. Wang, X., Durosier, L. D., Ross, M. G., Richardson, B. S., Frasch, M. G. Online detection of fetal acidemia during labour by testing synchronization of EEG and heart rate: a prospective study in fetal sheep. PLoS One. 9, e108119(2014).
  49. Reid, A., Malone, J. Q fever in Ireland A seroprevalence study of exposure to Coxiella burnettii among Department of Agriculture workers. Occ med. 54, 544-547 (2004).
  50. Roest, H. I., Bossers, A., van Zijderveld, F. G., Rebel, J. M. Clinical microbiology of Coxiella burnetii and relevant aspects for the diagnosis and control of the zoonotic disease Q fever. Vet quart. 33, 148-160 (2013).
  51. Neill, T. J., Sargeant, J. M., Poljak, Z. The effectiveness of Coxiella burnetii vaccines in occupationally exposed populations: a systematic review and meta-analysis. Zoonoses and public health. 61, 81-96 (2014).
  52. Roest, H. I., Bossers, A., Rebel, J. M. Q fever diagnosis and control in domestic ruminants. Dev biol. 135, 183-189 (2013).
  53. Frasch, M. G., et al. Fetal body weight and the development of the control of the cardiovascular system in fetal sheep. J physilo. 579, 893-907 (2007).
  54. Rurak, D., Bessette, N. W. Changes in fetal lamb arterial blood gas and acid-base status with advancing gestation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 304, R908-R916 (2013).
  55. Frasch, M. G., et al. Fetal body weight and the development of the control of the cardiovascular system in fetal sheep. J physiol. 579, 893-907 (2007).
  56. Frasch, M. G., et al. Measures of acidosis with repetitive umbilical cord occlusions leading to fetal asphyxia in the near-term ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 200, 200.e1-207.e1 (2009).
  57. The ESHRE Capri Workshop Group. Multiple gestation pregnancy. Hum reprod. 15, 1856-1864 (2000).
  58. Frasch, M. G. Re The perinatal development of arterial pressure in sheep: effects of low birth weight due to twinning. Reproductive sciences (Thousand Oaks, Calif.). 15, 863-865 (2008).
  59. Hancock, S. N., Oliver, M. H., McLean, C., Jaquiery, A. L., Bloomfield, F. H. Size at birth and adult fat mass in twin sheep are determined in early gestation. J Physiol. 590, 1273-1285 (2012).
  60. Wassink, G., Bennet, L., Davidson, J. O., Westgate, J. A., Gunn, A. J. Pre-existing hypoxia is associated with greater EEG suppression and early onset of evolving seizure activity during brief repeated asphyxia in near-term fetal sheep. PLoS One. 8, e73895(2013).
  61. Mathai, S., et al. Acute on chronic exposure to endotoxin in preterm fetal sheep. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 304, R189-R197 (2013).
  62. Heuij, L. G., et al. Synergistic white matter protection with acute-on-chronic endotoxin and subsequent asphyxia in preterm fetal sheep. J neuroinflam. 11, 89(2014).
  63. Gagnon, R., Challis, J., Johnston, L., Fraher, L. Fetal endocrine responses to chronic placental embolization in the late-gestation ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 170, 929-938 (1994).
  64. Miller, S. L., Supramaniam, V. G., Jenkin, G., Walker, D. W., Wallace, E. M. Cardiovascular responses to maternal betamethasone administration in the intrauterine growth-restricted ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 201, 613.e1-613.e8 (2009).
  65. Regnault, T. R., et al. The relationship between transplacental O2 diffusion and placental expression of PlGF, VEGF and their receptors in a placental insufficiency model of fetal growth restriction. J Physiol. 550, 641-656 (2003).
  66. Wallace, J. M., Aitken, R. P., Cheyne, M. A. Nutrient partitioning and fetal growth in rapidly growing adolescent ewes. J reprod and fertil. 107, 183-190 (1996).
  67. Rakers, F., et al. Effects of early- and late-gestational maternal stress and synthetic glucocorticoid on development of the fetal hypothalamus-pituitary-adrenal axis in sheep. Stress. 16, 122-129 (2013).
  68. Jiang, Y., et al. The sheep genome illuminates biology of the rumen and lipid metabolism. Science. 344, 1168-1173 (2014).
  69. Begum, G., et al. Epigenetic changes in fetal hypothalamic energy regulating pathways are associated with maternal undernutrition and twinning. FASEB J. 26, 1694-1703 (2012).
  70. Byrne, K., et al. Genomic architecture of histone 3 lysine 27 trimethylation during late ovine skeletal muscle development. Anim Genet. 45, 427-438 (2014).
  71. Lie, S., et al. Impact of embryo number and maternal undernutrition around the time of conception on insulin signaling and gluconeogenic factors and microRNAs in the liver of fetal sheep. Am J physiol Endocrinol. 306, E1013-E1024 (2014).
  72. Nicholas, L. M., et al. Differential effects of maternal obesity and weight loss in the periconceptional period on the epigenetic regulation of hepatic insulin-signaling pathways in the offspring. FASEB J. 27, 3786-3796 (2013).
  73. Wang, K. C., et al. Low birth weight activates the renin-angiotensin system, but limits cardiac angiogenesis in early postnatal life. Physiol rep. 3, (2015).
  74. Zhang, S., et al. Periconceptional undernutrition in normal and overweight ewes leads to increased adrenal growth and epigenetic changes in adrenal IGF2/H19 gene in offspring. FASEB J. 24, 2772-2782 (2010).

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