Visualisierung Streptococcus pneumoniae Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

Zusammenfassung

Streptococcus pneumoniae bildet diskrete, nicht eitrige mikroskopische Läsionen im Herzen. Dargestellt ist das Protokoll für ein Mausmodell der kardialen Mikroläsionsbildung. Es werden Anweisungen zur Visualisierung von Mikroläsionen mittels Mikroskopie, zur Unterscheidung zwischen frühen und späten Mikroläsionen und Methoden zum Nachweis des kardialen Umbaus im Herzen von Rekonvaleszenten gegeben.

Zusammenfassung

Während Bakteriämie Streptococcus pneumoniae können über das vaskuläre Endothelium in das Myokard zu translozieren und bilden diskrete Bakterien gefüllte mikroskopische Läsionen (Mikroläsionen), die bemerkenswert sind aufgrund der Abwesenheit von infiltrierenden Immunzellen. Aufgrund ihrer Freisetzung von kardiotoxischen Produkte, S. pneumoniae im Mikroläsionen werden gedacht, um auf die Herzinsuffizienz, die häufig während der Knall invasive Pneumokokken-Erkrankungen bei Erwachsenen beobachtet bei. Hierin ist ein Protokoll zur experimentellen Maus-Infektion, die zu Herz Mikroläsion Bildung innerhalb von 30 Stunden führt reproduzierbar nachgewiesen. Der Unterricht wird auf Mikroläsion Identifikation in Hämatoxylin & Eosin Herzschnitte und die morphologischen Unterschiede zwischen frühen und späten Mikroläsionen zur Verfügung gestellt werden hervorgehoben. Der Unterricht wird über ein Protokoll zur Überprüfung der S. bereitgestellt pneumoniae im Mikroläsionen mit Antikörpern gegen Pneumokokken-Kapselpolysaccharid undImmunfluoreszenzmikroskopie. Zuletzt wurde ein Protokoll für die Antibiotika-Intervention, infizierten Mäusen und für die Erfassung und Beurteilung der Narbenbildung in den Herzen der rekonvaleszenten Mäusen befreit ist. Zusammen werden diese Protokolle die Untersuchung der molekularen Mechanismen Pneumokokken Herz Invasion Kardiomyozyten Tod kardialen Remodeling als Folge der Exposition gegenüber S. erleichtern pneumoniae, und die Immunantwort auf das Pneumokokken im Herzen.

Einleitung

Krankenhausaufenthalt von Erwachsenen für ambulant erworbener Pneumonie (CAP) trägt eine dokumentierte Risiko für unerwünschte kardiale Ereignisse, die Sterblichkeit ^1-4 beiträgt. In einer aktuellen Studie von Corrales-Medina et al. Herzkomplikationen wurden gefunden, um mit und / oder verantwortlich für 27% der Pneumonie-assoziierten Todesfälle ³ zugeordnet werden. Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken die), die häufigste Ursache der GAP und Sepsis ^5, wurde direkt mit unerwünschter kardialer Ereignisse bei nicht weniger als 19% der erwachsenen Patienten zugelassen ⁶ verbunden. MACE mit Lungenentzündung sind neu oder verschlimmert Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen und Herzinfarkt in abnehmender Häufigkeit ^6.

In einer aktuellen PLoS Pathogens Artikel von Brown et al., S. pneumoniae wurde gefunden, fähig Translokation durch die Herz Gefäßendothel Eintritt in die myocardium, und die Bildung von diskreten nicht-eitriger mikroskopische Läsionen (Mikroläsionen) mit Bakterien in den Herzkammern während invasive Pneumokokkenerkrankung (IPD) ⁷ gefüllt. Der Nachweis der Herz Mikroläsion Bildung wurde in der Herzproben von nicht-menschlichen Primaten und Einzelpersonen, die Pneumokokkeninfektion erlegen beobachtet. Ebenso experimentell infizierten Mäusen reproduzierbar kardialen Mikroläsionen entwickelt. Bei Mäusen wurde Mikroläsion Größe und Anzahl positiv mit der Dauer und Schwere der Bakteriämie Ebenen Troponin in Seren und aberrante kardialen Elektro korreliert. Bakterielle Translokation in das Herz wurde gefunden, durch die gleichen Mechanismen für die Translokation des Pneumokokken durch die Blut-Hirn-Schranke und die Entwicklung einer Pneumokokken-Meningitis, dh Cholin-Bindungsprotein A vermittelte Invasion von vaskulären Endothelzellen in einem Laminin-Rezeptor und Platelet verantwortlich auftreten aktivierenden Faktor-Rezeptor-abhängigen Weise ^8. MicrolesIonenbildung benötigt auch die Pneumokokken-porenbildende Toxin Pneumolysin, die gefunden wurde, um Kardiomyozyten ⁷ töten.

Pneumokokken Herzmikroläsionen sind verschieden von eitrigen Weichgewebe und Herz Abszessen, die von anderen Gram-positive Bakterien einschließlich Staphylococcus aureus hervorgerufen werden. Diese werden durch einen einzelnen Brennpunkte der Bakterien durch Neutrophile und Fibrinablagerung ^9,10 umgeben ist. Mikroläsionen von S. gebildet pneumoniae sind kleiner, im gesamten betroffenen Herz verteilt, und es fehlt Immun Zellinfiltrate. Während der frühen Stadien der Infektion, Mikroläsionen verursacht durch S. pneumoniae erscheinen als Bereiche der beschädigte oder entzündete Gewebe erinnert an die pathologische Anzeichen einer Kardiomyopathie. Einige Monozyten kann während dieser Zeit beobachtet werden, aber ihre Anwesenheit ist von kurzer Dauer und Läsionen schnell nekrotischen Stellen entstehen und bei gleichzeitig weiterhin gr mit Bakterien gefülltow Größe bis zum Tod des Tieres oder antimikrobielle Intervention. Wichtig ist, dass innerhalb 3 Tage der antibiotischen Intervention, starkes Immunzellinfiltration wird am ehemaligen Läsion beobachtet und dies wird durch robuste Kollagenablagerung begleitet. Ähnliche kardialen Remodeling wurde berichtet, kommen folgenden Infarkt mit nachhaltigen Folgen auf die Herzfunktion ^11-15. So sind Mikroläsionen eine mögliche Erklärung für die unerwünschten kardialen Ereignissen, die während IPD und möglicherweise die erhöhte Inzidenz von Herz-Mortalität in rekonvaleszenten Menschen, die die Krankheit Folge überlebt haben, auftreten.

Hierin wird Anweisungen auf dem experimentellen Mausmodell der IPD und Herz-Läsion Bildung und Visualisierung von kardialen Mikroläsionen in frühen und späten Stadien der Infektion zur Verfügung gestellt. Das Protokoll für die Erfassung der Kollagenabscheidung in Tieren, die von antimikrobiellen Intervention gespeichert wurden demonstriert. Das Ziel dieses Artikels ist es, facilitate die Forschung von anderen Forschern auf diesem wichtigen und neuartigen Pneumokokken-Pathologie.

Protokoll

HINWEIS: Alle Maus-Experimente wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der University of Texas Health Science Center in San Antonio (Protokoll # 13032-34-01C) zugelassen. Tierpflege und experimentelle Protokolle, um öffentliches Recht 89-544 (Tierschutzgesetz) und ihren Anhängen, Public Health Service Richtlinien, und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (US Department of Health & Human Services) eingehalten werden.

1. Infektion

1. Erhalten BALB / c Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von 10 bis 12 Wochen alt sind zwischen.
   HINWEIS: S. pneumoniae Serotyp 4 Dehnungs TIGR4 ist ein virulenter klinischen Isolat, das sequenziert wurde ^16.
2. Wachsen TIGR4 in Todd-Hewitt-Brühe bei 37 ° C in 5% CO ₂ bis zum Erreichen einer optischen Dichte (OD) ₆₂₀ 0,5 (entsprechend 1,0 x 10 ^{& sup8;} koloniebildende Einheiten [CFU] / ml). Pellet die Pneumokokken-Kultur durch Zentrifugation für 10 min bei 3500 · g und Überstand mit einer Vakuumleitung. Auszusetzen und verdünnte Bakterien mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 1,0 x 10 ⁴ KbE / ml.
3. Mit Hilfe eines Induktionskammer, betäuben Mäuse mit 2,5% Isofluran in Sauerstoff verdampft. Bestätigen narkotisierten Zustand von sanften toe Prise mit stumpfen Pinzette.
   1. Halten Sie den narkotisierten Maus durch sein Genick und aufrecht mit einer Hand zu injizieren jede Maus intraperitoneal (ip) mit 100 ul des S. pneumoniae Suspension mit einer Spritze mit einer 27-30 Gauge-Nadel (entsprechend einer Provokationsdosis von 1,0 x 10 ³ CFU). Platzieren Sie die Maus wieder in seinem Käfig. Mäuse erwachen normalerweise 30-40 sec nach der Injektion.
4. Lassen Sie die Infektion zu mindestens 24 (Anfang) oder 30 (erweitert) h fahren.
   1. Euthanize die Mäuse durch CO ₂ Ersticken. Führen Genickbruch an der Maus zu gewährleisten verstorben. Sterbehilfe wird durch Entfernen bestätigtdes Herzens in Schritt 1.6.
5. Desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer und schneiden eine 2-3 mm Abschnitt. Sammel 2 ul Blut und seriell verdünnt das Blut 10-fach in PBS Natriumheparin 1 U / ml fünfmal enthält. Plattenreihenverdünnungen auf einer tryptischer Soja Blutagarplatte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in 5% CO _2. Am nächsten Tag extrapolieren aus Kolonie zählt das Niveau der Bakteriämie.
6. Immobilisierung der Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Plattform. Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol und trocken tupfen. Mit chirurgische Scheren und Zangen öffnen Sie die Brusthöhle, nehmen Sie den Brustkorb und durchschneiden die Membran, um das Herz und die Lunge aus. Mit einer Schere schneiden die Blutgefäße mit dem Herzen verbunden und vorsichtig herausschneiden das Herz mit Sorgfalt zu vermeiden Druck mit einer Pinzette.
7. Spülen Sie das Herz mit PBS und dann in Gewebeprobenentnahme Kassetten, so dass Koronalschnitte würde während der Gewebeschneide erhalten zu platzieren. Für Paraffineinbettung, place die Kassetten in 10% gepuffertem Formalin-Lösung und den nächsten Tag zu senden für die Paraffineinbettung.
   1. Alternativ Flash-Freeze mit OCT-Verbindung innerhalb eines cryomold, die auf Trockeneis platziert wurde.

2. Visualisierung der Herz Läsionen und Pneumokokken innerhalb Läsionen

1. Reduzieren Sie in Paraffin eingebetteten Herzen Abschnitte, so dass die vier Kammern des Herzens in jedem Gewebeschnitt zu sehen sind. Geschnitten Folien in einer Dicke von 5 um.
2. Entparaffinieren und schmutz Folien mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) mit Standardverfahren ^17.
3. Ansicht H & E gefärbten Herz Abschnitte mit einem Lichtmikroskop bei niedrigen (100X, 200X) und hoher (Öl-Immersion: 400X, 1,000x) Vergrößerungen. Charakterisieren Herzen auf das Vorhandensein von Mikroläsionen im Myokard. Hier erwerben H & E-Bilder mit einem Zeiss Axioskop 2 Mikroskop mit einer 100X 1.3 numerische Apertur Plan-Neofluar Ziel ausgestattet.
   HINWEIS: Bei inszeniert frühen Herz lesions werden von ihren Differential gefärbte Aussehen und in manchen Fällen das Vorhandensein von Immunzellen (Monozyten und Granulozyten), was anscheinend Monocyten diskriminiert. In fortgeschrittenen Läsionen, insbesondere diejenigen, bei 30 Stunden zu sehen, sind die Immunzellen fehlen und große vakuolenartigen Läsionen an ihrer Stelle beobachtet. Es ist wichtig anzumerken, dass, während Immunzellzufluss in den frühen Stadien der Herz Läsionsentwicklung auftreten kann es scheint nicht eine Voraussetzung sein.

3. Immunfluoreszenz-Mikroskopie für Pneumokokken innerhalb von Mikroläsionen

1. Abschnitt Herz in cryomolds mit Mikrotom bis zu einer Dicke von 5 um und Ort Schnitte auf positiv geladene Objektträger aus Glas. Lassen Sie gefrorene Herz-Abschnitte zu tauen und der Luft trocknen. Fix Sektionen für 10 min in 10% neutral gepuffertem Formalin (pH 6,8-7,2 bei 25 ° C).
2. Waschen Folien (3x) in PBS für 5 min, 15 min permeabilisiert in 0,2% Triton X-100 in PBS, dann einmal in PBS gewaschen.
3. Block Gewebe Abschnit auf auf Objektträger mit 10% Ziegenserum in PBS für 1 Stunde.
4. Spülen Folien mit PBS, Deckel und inkubieren Herzschnitte mit Kaninchen-Anti-Serotyp 4 Pneumokokken-Antiserum bei 1: 1000 in PBS mit 10% Ziegenserum für 2 Stunden bei 37 ° C.
   HINWEIS: Für negative Kontrollen sollten Ermittler naive Kaninchen-Antiserum verwenden
5. Nach dem Waschen mit PBS, Deckel und inkubieren Abschnitte mit 10% Ziegenserum-PBS mit Ziegen-Anti-Kaninchen-FITC-konjugiertem Antikörper bei 1: 2.000 für 30 Minuten bei 37 ° C.
6. Nach den Anweisungen des Herstellers, verwendet DAPI (4 ', 6- Diamidino-2-Phenylindol) bei 5 mg / ml für die Visualisierung von eukaryotischen Kernen. Waschen und montieren Gewebeschnitte mit FluorSave.
7. Erwerben Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen Mikroskopsystem bei niedrigen und hohen Vergrößerung. Stellen Sie die numerische Apertur entsprechend optimale Ergebnisse zu erhalten. Hier erwerben Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen System mit einem 60X 1,42 numerischer Apertur Ziel.

"> 4. Antibiotika Rettung von Septic Mäuse

1. Beginnen mit Mäusen infiziert ip mit 1,0 x 10 ³ CFU von TIGR4 wie zuvor in Schritt 1 angezeigt.
2. Beginnend bei 30 Stunden nach der Infektion zu verwalten pharmazeutischer Qualität ip Ampicillin (80 mg / kg Körpergewicht) in 100 ul Kochsalzlösung alle 12 Stunden 36 Stunden. Sammeln Herzen am gewünschten Zeitpunkt und Verfahren, wie in Schritt 1.6 für Paraffineinbettung und Gewebe, Schnitt beschrieben.

5. Kollagenablagerung Erkennung

1. Mit Xylol und abgestufte Alkoholschlichten mit VE-Wasser, entparaffinieren und Hydrat Gewebeschnitte mit Standardverfahren ^17. Gönnen Abschnitte mit einer wässrigen 0,2% Phosphormolybdänsäure für 5 Minuten einwirken lassen und mit VE-Wasser für 5 min.
2. Fleckenabschnitte mit 0,1% Sirius Rot in Pikrinsäure für 2 h bei Raumtemperatur.
3. Auswaschbereiche in 0,01 N Salzsäure für 3 min und Spülen mit 70% Ethanol für 1 min.
4. Dehydrate die Abschnitte mit dem identisch, aber in umgekehrter Reihenfolge der Waschgänge wie in 5.1 dargelegt, dehydrieren Herz Abschnitte bei der Steigerung und abgestuften Konzentrationen von Ethanol dann Xylol.
5. Berg Gewebeschnitte mit einem Befestigungslösung für mikroskopische Auswertung.
6. Um festzustellen, Regionen Kollagenablagerung, untersuchen Buntgewebeschnitten für Bereiche der tiefen Lese Färbung bei geringer und hoher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop. Jeder Bereich, in den Kammern des Herzens, die rot ist, ist ein Bereich, wo Kollagen abgeschieden wurde. Bereiche ohne diese roten Flecken sind Websites von gesundem Gewebe fehlt Kollagenablagerung. Hier erwerben picro Sirius Red Bunt Bilder mit Hilfe eines Mikroskops mit einem 20X 0,5 numerische Apertur Ziel ausgestattet.
   HINWEIS: Die Atrium Flecken rot in gesunden Geweben.

Ergebnisse

Visualisierung von Mikroläsionen von H & E

Herzmikroläsionen wurden in den Ventrikeln des H & E gefärbten Herzschnitten von Mäusen mit IPD nach ihrer ip Herausforderung TIGR4 beobachtet. Figur 1 veranschaulicht die Zunahme der Größe dieser Läsionen zwischen 24 und 30 h nach der Infektion (hpi), mit einer größeren Anzahl von Hämatoxylin färbten (dh, lila-blau) Pneumokokken innerhalb der Läsion sichtbar. Mikroläsionen wurden durch eine vakuolenartigen...

Diskussion

In diesem Bericht wird eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode, S. induzieren pneumoniae vermittelten kardialen Mikroläsionen bei Mäusen während IPD und die Techniken für die Visualisierung demonstriert. Mäuse werden mit einer Dosis von Bakterien, die Schwelle des Immunsystems für die Abfertigung übertrifft, was zu einer hochgradigen Bakteriämie, ähnlich der, die bei der menschlichen Sepsis auftritt, und führt zu möglichen bakteriellen Translokation in den Herzmuskel infiziert. Für noch unbekannten Gr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Todd-Hewitt Brühe	Neogen	7161A
O.C.T. Mischung	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normales Ziegenserum	Abcam	ab7481
Anti-Serotyp 4 Pneumokokken Antiserum	Statens Serum Institut	16747
Anti-Kaninchen-FITC-Antikörper für Ziegen	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
Phosphomolybdsäure 0,2%	Elektronenmikroskopie	26357-01
0,1 % Sirius Rot in Pikrinsäure	Elektronenmikroskopie	26357-02
0,01 N Salzsäure	Elektronenmikroskopie Sciences	26357-03
Gewebe-Greifmikroskop-Objektträger	Polysciences, Inc	24216
Paralube Vet Salbe	Dechra	12920060
Hämatoxylin- und Eosin-Färbeset	nicht spezifiziert		Norm