Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung menschlicher Kardiomyozyten, das die modulierte kardiale Differenzierung kleiner Moleküle und die durch Glukoseentzug vermittelte Kardiomyozytenreinigung kombiniert und die Produktion von gereinigten Kardiomyozyten für die Zwecke der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Wirkstoffscreenings ermöglicht.

Zusammenfassung

Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CMs) sind zu einem wichtigen Zellquelle, um den Mangel an primären Kardiomyozyten für die Grundlagenforschung und translationale Anwendungen anzugehen. Um hiPSCs in Kardiomyozyten zu differenzieren, wurden verschiedene Protokolle wie Embryoidkörper (EB) -basierte Differenzierung und Wachstumsfaktor Induktion entwickelt. Jedoch sind diese Protokolle ineffizient und sehr variabel in ihrer Fähigkeit gereinigt Kardiomyozyten erzeugen. Kürzlich wurde ein kleines Molekül-basierte Protokoll Verwendung Modulation Wnt / β-Catenin-Signalisierung wurde dargestellt, um die Herzdifferenzierung mit hohem Wirkungsgrad zu fördern. Bei diesem Protokoll, größer als 50% -60% der differenzierten Zellen Troponin-positiven Kardiomyozyten wurden konsequent beobachtet. Um Kardiomyozyten Reinheit weiter zu erhöhen, wurden die differenzierten Zellen unterzogen, um Hunger Glukose gezielt beseitigen Nicht-Kardiomyozyten auf der Grundlage der Stoffwechselunterschieds zwischen Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten. Unter Verwendung dieses Selektionsstrategie, die wir durchgängig erhalten eine Erhöhung des Verhältnisses der Herzmuskelzellen nicht-Kardiomyozyten größer als 30% in einer Population differenzierter Zellen. Diese hochgereinigtes Kardiomyozyten sollte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse von In-vitro-Krankheit Modellstudien und Wirkstoff-Screeningtests menschlichen iPS-basierten verbessern.

Einleitung

Primäre humane Kardiomyozyten sind aufgrund der Erfordernis invasiver Herzbiopsien, Schwierigkeiten bei der Dissoziation einzelner Zellen und wegen der schlechten langfristige Überleben der Zellen in Kultur schwierig zu erhalten. Angesichts dieses Mangels an primären humanen Kardiomyozyten, patientenspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) Technologie als leistungsfähige Alternative Kardiomyozyten Quelle für die Grundlagenforschung als auch klinische und translationale Anwendungen wie Krankheit Modellierung und Droge angesehen Entdeckung ^ein. Frühe Bemühungen bei der Differenzierung von pluripot....

Protokoll

HINWEIS: Lieferanteninformationen für alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 1 aufgeführt und Materialliste. Alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit Zellen, müssen steril sein, und aseptisches Verfahren entsprechend verwendet werden. Führen alle Kultur Inkubationen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator, sofern nicht anders angegeben. In diesem Protokoll werden alle Unterscheidungen in 6-Well-Platten durchgeführt, bei dem die hiPSCs ausgesät. Nach Differenzierung und Reinigung können Zellen dissoziiert und zur späteren Verwendung erneut plattiert werden.

1. Mit....

Ergebnisse

Die morphologischen Veränderungen während hiPSC Differenzierung.

Die hiPSC in Feeder-freien Platten kultiviert wuchs als flache, zweidimensionale Kolonien. Bei Erreichen etwa 85% Konfluenz wurden hiPSCs mit 6 uM CHIR zur ​​Differenzierung (1A) behandelt. Erhebliche Mengen von Zelltod, eine normale und weit verbreitetes Phänomen, wurden nach 24 Stunden von CHIR Behandlung beobachtet. Nach zwei Tagen CHIR Behandlung die hiPSCs weiter in Richtung eines mesoderm.......

Diskussion

Erhalten einer großen Menge von hochgereinigtem hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten ist kritisch für die Grundherzforschung sowie klinische und translationale Anwendungen. Cardiac Differenzierungsprotokolle haben enorme Verbesserungen in den letzten Jahren, um Kleinmoleküle moduliert und Monolayer-basierte Methoden ⁵ unterzogen, den Übergang von Embryoidkörper-basierte Verfahren, die einen kardiogenen Wachstumsfaktoren ^2, um Sandwichverfahren ¹² Matrix und schließlich. Der vorstehend genann.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Matrigel (9-12 mg/ml)	BD Biosciences	354277
RPMI-Medien	Invitrogen	11835055
Glukosefreie RPMI-Medien	Invitrogen	11879-020
B27 Minus Insulin	Invitrogen	A1895601
B27 Supplement (mit Insulin)	Invitrogen	17504-044
Pen-Streptokokken-Antibiotikum	Invitrogen	15140122
Fötales Rinderserum	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK-Inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Zellheber	Fisher	08-100-240
Kryofläschchen	Fisher (NUNC Röhrchen)	375418
TrypLE Select Enzym	Invitrogen	12563-011