Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung menschlicher Kardiomyozyten, das die modulierte kardiale Differenzierung kleiner Moleküle und die durch Glukoseentzug vermittelte Kardiomyozytenreinigung kombiniert und die Produktion von gereinigten Kardiomyozyten für die Zwecke der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Wirkstoffscreenings ermöglicht.

Zusammenfassung

Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CMs) sind zu einem wichtigen Zellquelle, um den Mangel an primären Kardiomyozyten für die Grundlagenforschung und translationale Anwendungen anzugehen. Um hiPSCs in Kardiomyozyten zu differenzieren, wurden verschiedene Protokolle wie Embryoidkörper (EB) -basierte Differenzierung und Wachstumsfaktor Induktion entwickelt. Jedoch sind diese Protokolle ineffizient und sehr variabel in ihrer Fähigkeit gereinigt Kardiomyozyten erzeugen. Kürzlich wurde ein kleines Molekül-basierte Protokoll Verwendung Modulation Wnt / β-Catenin-Signalisierung wurde dargestellt, um die Herzdifferenzierung mit hohem Wirkungsgrad zu fördern. Bei diesem Protokoll, größer als 50% -60% der differenzierten Zellen Troponin-positiven Kardiomyozyten wurden konsequent beobachtet. Um Kardiomyozyten Reinheit weiter zu erhöhen, wurden die differenzierten Zellen unterzogen, um Hunger Glukose gezielt beseitigen Nicht-Kardiomyozyten auf der Grundlage der Stoffwechselunterschieds zwischen Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten. Unter Verwendung dieses Selektionsstrategie, die wir durchgängig erhalten eine Erhöhung des Verhältnisses der Herzmuskelzellen nicht-Kardiomyozyten größer als 30% in einer Population differenzierter Zellen. Diese hochgereinigtes Kardiomyozyten sollte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse von In-vitro-Krankheit Modellstudien und Wirkstoff-Screeningtests menschlichen iPS-basierten verbessern.

Einleitung

Primäre humane Kardiomyozyten sind aufgrund der Erfordernis invasiver Herzbiopsien, Schwierigkeiten bei der Dissoziation einzelner Zellen und wegen der schlechten langfristige Überleben der Zellen in Kultur schwierig zu erhalten. Angesichts dieses Mangels an primären humanen Kardiomyozyten, patientenspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) Technologie als leistungsfähige Alternative Kardiomyozyten Quelle für die Grundlagenforschung als auch klinische und translationale Anwendungen wie Krankheit Modellierung und Droge angesehen Entdeckung ^ein. Frühe Bemühungen bei der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu Herzmuskelzellen verwendet Differenzierungsprotokollen mit Embryoidkörper (EB), aber dieses Verfahren ist nicht effizient bei der Herstellung von Herzmuskelzellen, da oft weniger als 25% der Zellen in einem EB schlagen Kardiomyozyten ^2,3. Vergleichsweise, eine Monobasis Differenzierungsprotokoll unter Verwendung der Zytokine Aktivin A und BMP4 angezeigt einen höheren Wirkungsgrad als EBs, aberDieses Protokoll ist immer noch relativ ineffizient und erfordert eine teure Wachstumsfaktoren und funktioniert nur in einer begrenzten Anzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien ^4. Vor kurzem wurde eine hocheffiziente, hiPSC Monolayer-basierte Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll durch Modulation Wnt / β-Catenin-Signalweg ⁵ entwickelt. Diese hiPSC-CMs auszudrücken Troponin T und Alpha Actinin, zwei sarkomerischen Proteine, die Standard-Marker von Herzmuskelzellen ^6. Das Protokoll beschreibt hier ist eine Anpassung dieser niedermolekulare, Feeder zellfreie, Mono Differenzierung Verfahren ^5,7. Wir sind in der Lage zu schlagen Kardiomyozyten aus hiPSCs nach 7-10 Tagen (Abbildung 1) zu erhalten. Jedoch nach einer Kardiomyozytendifferenzierung einer 50% schlagen Zellen, Immunfärbung zeigt einheitlich das Vorliegen einer Population von Nicht-Herzmuskelzellen, die negativ für Kardiomyozyten-spezifische Marker wie Herz-spezifisches Troponin T und alpha-Actinin sind. Um fueitere reinigen Kardiomyozyten und die Beseitigung nicht-Kardiomyozyten wurden heterogene differenzierten Zellpopulationen unterzogen, um Hunger, indem sie mit einem extrem niedrigen Glukosekulturmedium für mehrere Tage (Abbildung 2) Glukose. Diese Behandlung selektiv eliminiert nicht Kardiomyozyten aufgrund der Fähigkeit von Kardiomyozyten, aber nicht nicht-Kardiomyozyten, Lactat als Primärenergiequelle, um in einer niedrigen Glucoseumgebung ⁸ überleben metabolisieren. Nach diesem Reinigungsschritt wird eine 40% ige Zunahme im Verhältnis von Kardiomyozyten nicht Kardiomyozyten beobachtet (Figur 3, Figur 4) und der nachgeschalteten Genexpressionsanalyse, Krankheitsmodelle und Wirkstoff-Screening-Assays können diese Zellen verwendet werden.

Protokoll

HINWEIS: Lieferanteninformationen für alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 1 aufgeführt und Materialliste. Alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit Zellen, müssen steril sein, und aseptisches Verfahren entsprechend verwendet werden. Führen alle Kultur Inkubationen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator, sofern nicht anders angegeben. In diesem Protokoll werden alle Unterscheidungen in 6-Well-Platten durchgeführt, bei dem die hiPSCs ausgesät. Nach Differenzierung und Reinigung können Zellen dissoziiert und zur späteren Verwendung erneut plattiert werden.

1. Mittelvorbereitung

1. Für die E8 Medium, stellen eine Stammlösung für jedes Medium Komponente (NaHCO _3, L-Ascorbinsäure-2-phosphat, Natrium-Selenit, Transferrin, Insulin, FGF2, TGFB1) und die Lösungen bei -20 ° C lagern. Fügen Sie entsprechende Menge an Stammlösungen in die Flasche DMEM / F12 und filtern, um zu sterilisieren. Die Lösung Konzentration und Reaktionsansatz für die Aktienkomponenten und E8 Medium kann in Tabelle 1 zu finden.
2. Für die extrazelluläre Matrix-Lösung, auftauen Basalmembranmatrix (allgemein bei 10 mg / ml enthalten) bei 4 ° CO / N. Matrigel ist allgemein für pluripotente Stammzellkultur verwendet werden, weil die menschliche pluripotente Stammzellen können auch auf dieses Material unter Verwendung des alpha-6-beta-1 Integrin ⁹ haften. Einmal aufgetaut, machen 2,25 mg (250 ul) Aliquots auf Eis mit eiskaltem Pipettenspitzen und Schläuche und die Aliquots bei -80 ° C.
   1. Wenn Vorbeschichtung Platten mit ECMS, auftauen und aliquotieren die extrazelluläre Matrix-Lösung (ECMS) auf Eis. Mischen Sie das ECMS und eiskalten DMEM / F12-Medium in einem Verhältnis von 1: 200 auf Eis. Keep cool, um vorzeitige ECMS Erstarrung zu verhindern.
3. Für die RPMI / B27 ohne Insulin Medium, 10 ml B27 Minus Insulin in 500 ml RPMI-Medium.
4. Für die RPMI / B27 (mit Insulin) Medium, 10 ml B27 Supplement (mit insulin) und 5 ml Pen-Strep-Antibiotikum in 500 ml RPMI-Medium.
5. Für den niedrigen Glucose-Medium, 10 ml B27 Supplement und 5 ml Pen-Strep Antibiotikum in 500 ml Glukose-freiem RPMI-Medien.
6. Das Einfrieren / Kryokonservierungsmedium mischen fötalem Rinderserum mit Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Verhältnis 9: 1. Das Einfriermedium kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
   Hinweis: alle Medien sollten gefiltert und gespeichert werden in 4 ° C und innerhalb von 2 Wochen verwendet werden, wenn nicht anders angegeben. Alle Reagenz / Lösungsvolumina unter Verwendung eines einzigen gut in einer 6-Well-Platte bestimmt, sofern nicht anders angegeben.

2. Pre-Beschichtung 6-Well-Platten mit ECMS

1. Make ECMS durch Mischen Basalmembranmatrix (zB Matrigel) mit eiskaltem DMEM / F12-Medium in einem Verhältnis von 1: 200, dann gelten 2 ml frisch hergestellter ECMS in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Jedes der gut in einer 6-Well-Platte wird ca. 90 mg ECMS erhalten.
2. Inkubieren Sie die ECMS-beschichteten Platten für 1 h bei 37 ° C. Unmittelbar vor dem Beschichten Zellen, absaugen DMEM / F12-Lösung aus jeder Vertiefung. Die Platten werden dann bereit sind, Zellen zu empfangen.

3. Auftauen der Tiefkühl hiPSCs

HINWEIS: Eng an diese Vorgehensweise, wie sie können, um eine optimale Kultivierung und Differenzierung von nachgeschalteten hiPSCs in hiPSC-CMs nach dem Frost / Tau-Zyklus führen.

1. Tauwetter ein Fläschchen hiPSCs für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Vorbereiten einer 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml kaltem E8 Medium mit ROCK-Inhibitor (10 & mgr; M) für jedes Fläschchen. ROCK-Hemmer verbessert hiPSCs Überlebensrate nach Kryokonservierung ^10. Die Durchstechflaschen im 37 ° C Wasserbad, um die Zellen, bis eine ca. 5 mm Durchmesser Eis Kristall überlassen auftauen.
2. Besprühen Sie die Außenseite der Fläschchen mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Fläschchen mit Seidenpapier, bevor er sie an den sterilen laminaren Haube.
3. Übertragen Sie die Zellen, in die vorbereitete konischen Rohr. Spülen ter einmal mit 500 ul E8 Medium Fläschchen und übertragen Sie das Medium, das die aufgetauten Zellen auf den gleichen konischen Rohr. Zentrifuge bei RT für 4 min bei 200 x g.
4. Saugen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und sanft Zellpellet mit 2 ml Medium mit E8 ROCK-Inhibitor (10 uM). Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit ECMS vorbeschichtet.
5. Ersetzen Sie das Medium mit E8 Medium ohne ROCK-Hemmer nach 24 Stunden der Kultivierung. Die Zellen sollten bis zu diesem Zeitpunkt eingehalten haben.

4. Passagieren von hiPSCs

1. Typischerweise Gang hiPSCs nach Erreichen 75% bis 80% Konfluenz in einer 6-Well-Platte. Saugen Sie das Kulturmedium. Waschen schnell Vertiefungen mit 1 ml sterilem, RT PBS. Absaugen PBS.
   1. Fügen Sie 500 ul 0,5 mM EDTA oder 1x Zellablösung Lösung (zB Accutase) und Inkubation für 1-7 min bei RT. Gegebener Zeit für EDTA Inkubation variiert mit der hiPSC Linie. Erwarten Sie, um zu sehen Curling o sehenr Verdickung Kolonien an den Rändern, da dieses anzeigt, daß EDTA oder Zellentfernungslösung bereit, entfernt werden.
2. Saugen Sie das EDTA oder die Zellablösung Lösung. 1 ml der E8-Medium mit 10 & mgr; ROCK-Hemmer ergänzt. Verdrängen hiPSC Kolonien in der auch durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und Spritz Kolonien mit einem P1000 Pipette. Kolonien sollte in 5-10 Zellklumpen nach Abschluss gebrochen werden.
3. Übertragen Sie die Kolonien, die in 1 ml Medium mit E8 ROCK-Inhibitor in einen 15 ml konischen Röhrchen suspendiert sind.
4. Stören die große Zellklumpen in kleine Klumpen in der E8 Medium. Fügen Sie einen entsprechenden Volumen von E8 Medien mit Inhibitor der Zellsuspension, um die Zellen zu verdünnen. Das Medienvolumen, um die Verdünnung hinzuzufügen, hängt von der Zelldichte und die Zahl der Brunnen ausgesät werden. Im Idealfall sollte eine einzige, 80% konfluent auch von hiPSCs 01.12 verdünnt werden.
   1. Fügen Sie 11 ml Medium mit E8 ROCK-Hemmer zu den bestehenden 1 ml cell-Lösung in den oben erwähnten 15 ml konischen Röhrchen, um eine Verdünnung zu erhalten 01.12.
5. Weitere verreiben die Zellklumpen in kleine Zellfragmente (etwa 50 bis 200 Zellen in jedem Fragment am besten). Vermeiden Sie zu Verreiben da dadurch das Überleben der Zelle.
6. Saugen Sie ECMS von den Pre-beschichteten Platten und 2 ml resuspendierten Zellen in jede Vertiefung. Etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ist ideal. Ziel ist es, die Zellen gleichmäßig um den gut verzichten zu Clusterbildung von Zellen, die in der Mitte der Vertiefung zu vermeiden.
7. Nach 24 Stunden der Kultivierung, ersetzen Sie das Medium mit E8 Medium ohne ROCK-Hemmer. Ändern Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden, bis die Zellen zu 80% konfluent. Dann werden die Zellen wieder bereit, Durchgang. Es dauert normalerweise 3-6 Tage zwischen den Kanälen zu 80% konfluent.

5. Einfrieren hiPSCs

HINWEIS: Eng an diese Vorgehensweise, wie sie können, um eine optimale Kultivierung und Differenzierung von nachgeschalteten Hüfte führenSCs in hiPSC-CMs nach dem Frost / Tau-Zyklus.

1. Beschriften Sie Kryoröhrchen mit der Zelllinie Name, Zelltyp, Durchgang Nummer und Einfrieren Tag. Als allgemeine Richtlinie, verwenden Sie eine Flasche für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Vorbereiten einer 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml E8 Medium mit ROCK-Inhibitor (10 & mgr; M) befüllt. Bereiten Gefriermedium mit 90% FBS und 10% DMSO, und halten Sie das Medium bei 4 ° C bis zur Verwendung.
2. Saugen Sie das Kulturmedien, 500 ul 0,5 mM EDTA oder 1x Zellablösung Lösung und Inkubation für 2-7 min bei RT. Die Dauer der EDTA oder Zellentfernungslösung Belichtung variiert von Zelllinie zu Zelllinie.
3. Saugen Sie EDTA oder Zellablösung Lösung. 1 ml der E8 Medium.
4. Verdrängen hiPSC Kolonien in der gut durch Auf-und Abpipettieren und Spritz Kolonien mit einem P1000 Pipette. Kolonien sollten nicht in weniger als 100 Zellklumpen zerlegt werden. Übertragen Sie die suspendierten Zellen auf die vorbereitete konische Röhrchen mit E8. Zentrifuge bei RT für 4 min bei 200 x g.
5. Saugen Sie den Überstand und fügen Sie 500 ul kaltem Einfriermedium zu dem Pellet. Das Pellet pipettiert ein- bis zweimal. Das Überleben der Zellen ist, indem sie Zellen in großen Klumpen verbessert.
6. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein beschriftetes kryogenen Rohr. Bewegen sich schnell die Fläschchen in einen Gefrierbehälter, Isopropanol, die allmähliche Abkühlung ermöglicht. Das Behältnis mit Zellen bei -80 ° C für 24 Stunden, dann übertragen die Zellen in flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung.

6. Herz Differenzierung von humanen iPS

HINWEIS: Alle Medien sollten mindestens bei Raumtemperatur, wenn hinzugefügt.

1. Nach Dissoziation mit EDTA oder 1x Zellablösung Lösung, Samen rund 100.000 menschlichen iPS-Zellen auf ECMS beschichtete 6-Well-Kulturplatten zur Differenzierung (dieselben Schritte wie Zell Passagieren Verfahren). Wenn die Zellen bis 85% Konfluenz, ändern Sie die mittel- bis RPMI / B27 ohne Insulin-Medium mit 6uM GSK3-beta-Hemmer CHIR99021 (CHIR) und halten für 48 Stunden.
2. Nach 48 Stunden, ersetzen Sie den CHIR haltigen Kulturmedium mit RPMI / B27 ohne Insulin Medium und in Ruhe zu lassen für 24 Stunden (bis zum Tag 3).
3. Am Tag 3, ändern Sie die Medien, um RPMI / B27 ohne Insulin mit 5 uM Wnt-Inhibitor IWR1 und halten für 48 Stunden (bis zum Tag 5).
   HINWEIS: Wnt Hemmung kann auch unter Verwendung anderer Verbindungen mit kleinen Molekülen versucht werden, wie in früheren Studien ¹¹ beschrieben. IWR1 wurde über andere kleine Molekül Wnt Inhibitoren wegen der erhöhten Bereich, in dem es sich gezeigt hat, bei der Hemmung der Wnt signal ¹¹ werden ausgewählt.
4. Am Tag 5, ändern Sie das Medium wieder in RPMI / B27 ohne Insulin Medium und lassen für 48 Stunden (bis zum Tag 7).
5. Am Tag 7, ersetzen Sie das Medium mit RPMI / B27 Medium (mit Insulin) und ersetzen Medium alle 3 Tage danach mit dem gleichen Medium. Spontane Schlagen Kardiomyozyten zunächst sichtbar bei ca. 8. Tag zu Tag10.

7. Reinigung von humanen Kardiomyozyten durch Glucose Starvation

1. Am Tag 10 nach der Differenzierung, ändern Sie das Medium in jeder Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen bis 2 ml niedrigen Glucose-Medium und Aufrechterhaltung der Zellen in diesem Medium für 3 Tage (bis zum Tag 13).
2. Am Tag 13, zurück Zellen RPMI / B27 Medium (mit Insulin).
3. Optional Ausstrich Kardiomyozyten vor der zweiten Runde der Glukose Hunger zu helfen, lösen nicht-Kardiomyozyten von der Kulturplatte, die ein einfacheres, Dissoziation von nicht-Kardiomyozyten während Glukose Hunger.
   1. Am Tag 13, absaugen Medium einmal mit PBS waschen und distanzieren die Zellen in einzelne Zellen unter Verwendung von 500 ul Zell Disassoziierung Enzyms für 5 min bei 37 ° C. Insbesondere wird nach 5 min der Enzymbehandlung, mit einem 1000 ul-Pipette Kardiomyozyten aus der 6-Well-Platte manuell dissoziieren durch wiederholtes Ziehen des Zell Disassoziierung Enzym und Sprühen gegen die cardiomyocyte Monolage. Bis zu 30 Pipettieren Wiederholungen erforderlich sein, um die Herzmuskelzellen in einzelne Zellen distanzieren werden.
   2. Nachdem die Zellen dissoziiert und in Einzelzellform, sammeln sämtliche Zellen in einer 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml RPMI / B27 Medium mit Insulin gefüllt, um für 4 min bei 200 x g verdünnt das Zell Disassoziierung Enzym und zentrifugiert. Absaugen und den Überstand verwerfen.
   3. Resuspendieren der Zellen mit 2 ml RPMI / B27 Medium und der Platte auf einen neuen ECMS beschichteten 6-Well-Platte. Typischerweise höherer Konfluenz von Kardiomyozyten hilft bei der Zellüberleben bei Neubelegung. Ziel ist es, zwei Millionen Zellen pro neue 6-Well-Platte für optimale Überleben während Neubelegung Ausstrich.
4. Am Tag 14, ändern Sie das Medium wieder in 2 ml niedrigen Glucose-Medium für eine zweite Glukoseentzug-Zyklus. Kultur die Zellen in diesem niedrigen Glukose Zustand für 3 Tage. Die meisten der nicht-Kardiomyozyten in diesem niedrigem Glucosekulturbedingungen sterben.
5. Am Tag 17, ändern Sie das Medium bis 2 ml RPMI / B27 Medium mit Insulin. Die verbleibenden Zellen werden hoch gereinigte Kardiomyozyten sein. Diese Kardiomyozyten zur Genexpressionsanalyse, Arzneimittel-Screening, metabolische Analyse und verschiedene andere Downstream-Assays verwendet werden.

Ergebnisse

Die morphologischen Veränderungen während hiPSC Differenzierung.

Die hiPSC in Feeder-freien Platten kultiviert wuchs als flache, zweidimensionale Kolonien. Bei Erreichen etwa 85% Konfluenz wurden hiPSCs mit 6 uM CHIR zur ​​Differenzierung (1A) behandelt. Erhebliche Mengen von Zelltod, eine normale und weit verbreitetes Phänomen, wurden nach 24 Stunden von CHIR Behandlung beobachtet. Nach zwei Tagen CHIR Behandlung die hiPSCs weiter in Richtung eines mesoderm...

Diskussion

Erhalten einer großen Menge von hochgereinigtem hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten ist kritisch für die Grundherzforschung sowie klinische und translationale Anwendungen. Cardiac Differenzierungsprotokolle haben enorme Verbesserungen in den letzten Jahren, um Kleinmoleküle moduliert und Monolayer-basierte Methoden ⁵ unterzogen, den Übergang von Embryoidkörper-basierte Verfahren, die einen kardiogenen Wachstumsfaktoren ^2, um Sandwichverfahren ¹² Matrix und schließlich. Der vorstehend genann...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Matrigel (9-12 mg/ml)	BD Biosciences	354277
RPMI-Medien	Invitrogen	11835055
Glukosefreie RPMI-Medien	Invitrogen	11879-020
B27 Minus Insulin	Invitrogen	A1895601
B27 Supplement (mit Insulin)	Invitrogen	17504-044
Pen-Streptokokken-Antibiotikum	Invitrogen	15140122
Fötales Rinderserum	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK-Inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Zellheber	Fisher	08-100-240
Kryofläschchen	Fisher (NUNC Röhrchen)	375418
TrypLE Select Enzym	Invitrogen	12563-011