Methodenartikel

Synchronisation Caulobacter crescentus Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

DOI:

10.3791/52633

⸱

8. April 2015

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Synchronisation von Bakterienzellen ist essentiell für die Erforschung des bakteriellen Zellzyklus und der Entwicklung. Caulobacter crescentus ist durch Dichtezentrifugation synchronisierbar und ermöglicht so ein schnelles und leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Synchronisation von Caulobacter-Zellen zur Verfügung.

Zusammenfassung

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Der Zellzyklus ist wichtig für das Wachstum, die Genomreplikation und die Entwicklung in allen Zellen. Bei Bakterien haben sich Studien des Zellzyklus weitgehend auf unsynchronisierte Zellen konzentriert, was es schwierig macht, die zeitlichen Ereignisse zu ordnen, die für das Fortschreiten des Zellzyklus, die Genomreplikation und die Teilung erforderlich sind. Caulobacter crescentus stellt ein hervorragendes Modellsystem für den bakteriellen Zellzyklus dar, bei dem Zellen durch Dichtezentrifugation schnell in einen G0-Zustand synchronisiert werden können. Experimente zur Zellzyklussynchronisation wurden verwendet, um die molekularen Ereignisse zu ermitteln, die die Chromosomenreplikation und -segregation steuern, um ein genetisches regulatorisches Netzwerk zu kartieren, das die Zellzyklusprogression steuert, und um die Etablierung polarer Signalkomplexe zu identifizieren, die für die asymmetrische Zellteilung erforderlich sind. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Synchronisation von Caulobacter NA1000 Zellen zur Verfügung. Die Synchronisation kann sowohl in einem großmaßstäblichen Format für die Erstellung von Genexpressionsprofilen und Western-Blot-Assays als auch in einem kleinen Format für Mikroskopie oder FACS-Assays durchgeführt werden. Die schnelle Synchronisierbarkeit und die hohen Zellausbeuten von Caulobacter machen diesen Organismus zu einem leistungsfähigen Modellsystem für Untersuchungen des bakteriellen Zellzyklus.

Einleitung

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Die bakterielle Zellzyklus steuert sowohl die Replikation des Genoms und die Teilung der Tochterzellen. Wichtig ist, wie Antibiotika-Resistenz ist eine wachsende Bedrohung der öffentlichen Gesundheit stellt der bakteriellen Zellzyklus eine ungenutzte Ziel für Antibiotika-Entwicklung.

In dem Bakterium Caulobacter crescentus, führt jede Zellzyklus in einer asymmetrischen Teilung, wodurch zwei Tochterzellen unterschiedlicher Schicksal (1A) 1,2. Eine Tochterzelle erbt eine Geißel und ist beweglich, während die andere Tochter erbt einen Stiel und sitzend. Eine integrierte genetische Schaltung steuert Zellzy....

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Protokoll

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1. Groß Synchrony - Optimal für Western Blot, Microarray / RNA-Seq und Sonstiges Material Intensive Tests

  1. Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen einem 5 ml O / N-Kultur des Stammes NA1000 durch Schütteln bei 28 ° C in PYE Medium.
  2. Beimpfen von 0,5 ml der Zellen aus Schritt 1 in 25 ml M2G (Tabellen 1-2) und schüttelt bei 28 ° C, bis die Kultur eine OD 600 zwischen 0,5 und 0,6 erreicht.
  3. Impfen Sie die Zellen in 1 l M2G und schütteln bei 28 ° C.
  4. Sobald OD 600 erreicht 0,5 bis 0,6, bestätigen das Vorhandensein von Zellen mit Hilfe swarmer montiert flüssigen Phase Mikroskopie. Spot 1 ul der Ze....

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Ergebnisse

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Synchronisations ergibt typischerweise zwei Banden von Zellen (1B): der swarmer Band, das eine höhere Dichte hat, und eine gestielte / predivisional Zellenband mit geringerer Dichte. Um sicherzustellen, dass effiziente Synchronisation gemeinsame Kontrollen umfassen die Überwachung der OD 600 und Messung der Konzentrationen von Ctra Protein durch Western-Blot auf verschiedene Zellzykluszeitpunkten. Die OD 600 sollte um etwa 2-fach im Verlauf des Zellzyklus (Figur 2).......

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Diskussion

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Der bakterielle Zellzyklus ist ein grundlegender Prozess im Leben und wichtig für die Erforschung des Wachstums und als Angriffspunkt für Antibiotika der nächsten Generation. In dieser Arbeit haben wir die Schnellsynchronisationsverfahren für C. crescentus NA1000, einen Modellorganismus für die Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus und der asymmetrischen Zellteilung, detailliert beschrieben. Diese Methode eignet sich für Western Blot, Genexpressionsprofilierung und Fluoreszenzmikroskopie-Assays, um die raumz.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Shapiro-Labors und Erin Schrader für ihre Kommentare zum Manuskript. Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung aus: NIH-Postdoktorandenstipendium F32 GM100732 an JMS und NIH-Stipendien R01 GM51426 und R01 GM32506 an LS.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PVP-beschichtete kolloidale Kieselsäure (Percoll)Sigma-AldrichP4937
kolloidale Kieselsäure (Ludox AS-40)Sigma-Aldrich420840
JA10 RotorBeckman-Coulter369687
JA20 RotorBeckman-Coulter334831
Eisensulfat-ChelatlösungSigma-AldrichF0518
30 ml ZentrifugenröhrchenCorning8445
Na2HPO4EMDSX0720-1
KH2PO4VWRBDH9268-500G
NH4ClAmresco0621-500g

Referenzen

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  1. McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
  2. McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
  3. McAdam....

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Schlagwörter

Zellzyklussynchronisationdifferenzielle ZentrifugationIsolation von Swarmer ZellenPhasenkontrastmikroskopieWestern Blot AssaysGenexpressionsprofilierungCTRA Proteinanalyseasymmetrische Zellteilung

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