Methodenartikel

Synchronisation Caulobacter crescentus Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

DOI:

10.3791/52633

⸱

8. April 2015

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Synchronisation von Bakterienzellen ist essentiell für die Erforschung des bakteriellen Zellzyklus und der Entwicklung. Caulobacter crescentus ist durch Dichtezentrifugation synchronisierbar und ermöglicht so ein schnelles und leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Synchronisation von Caulobacter-Zellen zur Verfügung.

Zusammenfassung

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Der Zellzyklus ist wichtig für das Wachstum, die Genomreplikation und die Entwicklung in allen Zellen. Bei Bakterien haben sich Studien des Zellzyklus weitgehend auf unsynchronisierte Zellen konzentriert, was es schwierig macht, die zeitlichen Ereignisse zu ordnen, die für das Fortschreiten des Zellzyklus, die Genomreplikation und die Teilung erforderlich sind. Caulobacter crescentus stellt ein hervorragendes Modellsystem für den bakteriellen Zellzyklus dar, bei dem Zellen durch Dichtezentrifugation schnell in einen G0-Zustand synchronisiert werden können. Experimente zur Zellzyklussynchronisation wurden verwendet, um die molekularen Ereignisse zu ermitteln, die die Chromosomenreplikation und -segregation steuern, um ein genetisches regulatorisches Netzwerk zu kartieren, das die Zellzyklusprogression steuert, und um die Etablierung polarer Signalkomplexe zu identifizieren, die für die asymmetrische Zellteilung erforderlich sind. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Synchronisation von Caulobacter NA1000 Zellen zur Verfügung. Die Synchronisation kann sowohl in einem großmaßstäblichen Format für die Erstellung von Genexpressionsprofilen und Western-Blot-Assays als auch in einem kleinen Format für Mikroskopie oder FACS-Assays durchgeführt werden. Die schnelle Synchronisierbarkeit und die hohen Zellausbeuten von Caulobacter machen diesen Organismus zu einem leistungsfähigen Modellsystem für Untersuchungen des bakteriellen Zellzyklus.

Einleitung

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Die bakterielle Zellzyklus steuert sowohl die Replikation des Genoms und die Teilung der Tochterzellen. Wichtig ist, wie Antibiotika-Resistenz ist eine wachsende Bedrohung der öffentlichen Gesundheit stellt der bakteriellen Zellzyklus eine ungenutzte Ziel für Antibiotika-Entwicklung.

In dem Bakterium Caulobacter crescentus, führt jede Zellzyklus in einer asymmetrischen Teilung, wodurch zwei Tochterzellen unterschiedlicher Schicksal (1A) 1,2. Eine Tochterzelle erbt eine Geißel und ist beweglich, während die andere Tochter erbt einen Stiel und sitzend. Eine integrierte genetische Schaltung steuert Zellzyklus und Zellschicksal von Transkriptionsregulation, Phospho-Signalisierung und regulierte Proteolyse 3. Zusätzlich Chromosomenreplikation und gleichzeitige Trennung Ausbeute Tochterzellen, die genau eine Kopie des Chromosoms 4 enthalten. Wichtig ist, dass diese beiden Zelltypen schnell durch collo getrennt werdenidal Silicateilchen Dichtezentrifugation im synchronisierbar NA1000 Stamm 5-7 ermöglicht die Isolierung der swarmer Zellen aus dem Rest der Population mit hohen Ausbeuten (1B). Isoliert swarmer Zellen dann synchron gehen durch asymmetrische Zellteilung. Hier haben wir ausführlich das Protokoll für die Synchronisierung von Caulobacter Belastung NA1000. Wir bieten Protokolle und gemeinsame Tipps zur Fehlerbehebung für Klein- und angelegte Synchronisationen. Das experimentelle Verfahren bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die räumlich-zeitliche Kontrolle der Caulobacter Zellzyklus und Zellschicksal zu verhören.

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Protokoll

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1. Groß Synchrony - Optimal für Western Blot, Microarray / RNA-Seq und Sonstiges Material Intensive Tests

  1. Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen einem 5 ml O / N-Kultur des Stammes NA1000 durch Schütteln bei 28 ° C in PYE Medium.
  2. Beimpfen von 0,5 ml der Zellen aus Schritt 1 in 25 ml M2G (Tabellen 1-2) und schüttelt bei 28 ° C, bis die Kultur eine OD 600 zwischen 0,5 und 0,6 erreicht.
  3. Impfen Sie die Zellen in 1 l M2G und schütteln bei 28 ° C.
  4. Sobald OD 600 erreicht 0,5 bis 0,6, bestätigen das Vorhandensein von Zellen mit Hilfe swarmer montiert flüssigen Phase Mikroskopie. Spot 1 ul der Zellen auf einen Objektträger, Deckel mit einem Deckglas und Bild durch Phasenmikroskopie. Bestätigen des Vorhandenseins von swarmer Zellen durch Visualisierung schneller schwimmen Zellen in der Population.
  5. Spin-Zellen für 15 min bei 7 KXG bei 4 ° C in einem JA-10-Rotor.
  6. Überstand verwerfen und fügen Sie 180 ml kaltes M2 (Tabellen 1-2) und sanft resuspend alle Zellen mit einer serologischen Pipette. Entsorgen Sie lose pelletierten Zellen; sie sind predivisional und stolzierte Zellen.
  7. 60 ml kalte Kolloidales Siliciumdioxid-Lösung (unbedingt die Kolloidales Siliciumdioxid-Suspension auch vor der Zugabe zu den Zellen mischen) und mischen Sie die Zellsuspension gut.
  8. Gießen Sie die Zellsuspension in acht 30-ml-Röhrchen und Spin für 30 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20 Rotor.
    HINWEIS: Man sollte zwei verschiedenen Bands zu sehen; die swarmer Band ist das untere Band während stolzierte / predivisional Zellen sind in der Top-Band (Abbildung 1B).
  9. Die Top-Band vorsichtig absaugen und entfernen Sie die Flüssigkeit auf ca. 1 cm über dem swarmer Band (das untere Band).
  10. (Kritisch) Mit einer Pasteur-Pipette, entfernen Sie vorsichtig die swarmer Band aufnehmen und in ein sauberes Röhrchen. Abzuwaschen Kolloidales Siliciumdioxid, oben das Rohr mit kaltem M2 und Schleudern für 10 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor.
  11. Vorsichtig den Überstand verwerfen und Resuspendieren derZellen in 20 ml kaltem M2 und Schleudern für 10 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor.
  12. Resuspendieren alle Pellets in 30 ml kaltem M2 und messen Sie die OD 600 mit einem Spektralphotometer und leere mit kaltem M2 Medium. Sparen Sie 1 ul für Phase-Bildgebung für swarmer Zellen überprüfen; 90-95% der Zellen sollten Schwärmer sein.
  13. Anzentrifugieren die Zellen für 5 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor. Zellen in 28 ° C M2G Medium, so dass der A 600 ist ~ 0,3-0,4 und beginnen bei 28 ° C schüttelnd.
    HINWEIS: Typische Ausbeuten zwischen 30 und 60 ml swarmer Zellkultur von 1L unsynchronisierten Zellen.
  14. Fangen Sie an, Zeitpunkte (Wildtyp-Kultur wird in etwa 135 bis 140 Minuten in Anspruch nehmen zu teilen) 8,9. Zu jedem Zeitpunkt, messen Sie die OD 600. Prüfen, ob die OD 600 nach der Teilung ist ungefähr 2X die Anfangs-OD 600.
  15. Für Western-Blot oder Genexpressionsassays entfernen 1 ml Aliquots der culture zu den gewünschten Zeitpunkten, Spin-down bei max Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für 30 Sekunden, schnell Dekantieren des Mediums, und Flash Einfrieren des Zellpellets in flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die Zellen bei -80 ° C bis Downstream-Analyse.

2. Kleines Synchrony - Optimal für die Mikroskopie

  1. Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen ein 5 ml O / N-Kultur unter Schütteln bei 28 ° C im M2G.
  2. Verdünnen Sie in 15 ml M2G (Tabellen 1-2) und wachsen, bis mid-log (OD 600 = 0,5-0,6).
  3. Spin 6,4 KXG für 10 min bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor und Resuspension in 1 ml kaltem M2 (Tabellen 1-2) und in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. Spin bei 15 KXG für 3 min in ein Mikrozentrifugenröhrchen Zellen zu pelletieren, absaugen Überstand, legen Sie die Tablette auf Eis, und resuspendieren in 900 ul kaltem M2.
  5. Hinzufügen 900 ul kaltem PVP beschichtet kolloidales Siliciumdioxid und Spin für 20 min bei 15 KXG bei 4 ° C in einem Mikrofonrocentrifuge Rohr.
  6. (Critical) Verwerfen Sie pipettieren aus der Spitze marschierte / predivisional Zellband und sammeln Sie die unten swarmer Band in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. Waschen der swarmer Zellen zwei Mal in 1 ml kaltem M2 während der Zentrifugation bei 15 KXG für 3 min.
  8. Vor dem letzten Spin, verschieben Sie die Zellen in eine vorgekühlte 1 ml Reagenzglas und messen Sie die OD 600 der Zellen im Vergleich zu einem Rohling aus M2.
  9. Resuspendieren die endgültige Zellpellet in 28 ° C M2G bei einer OD von 0,3 bis 0,4 und schütteln / Roll-Zellen bei 28 ° C.
    Anmerkung: Typische Ausbeuten liegen zwischen 2 und 4 ml swarmer Zellkultur.
  10. Für die Mikroskopie Experimente, zum gewünschten Zeitpunkt Punkten Platz 1 ul der Zellen auf eine M2G Agarose-Pad für die Bildgebung.

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Ergebnisse

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Synchronisations ergibt typischerweise zwei Banden von Zellen (1B): der swarmer Band, das eine höhere Dichte hat, und eine gestielte / predivisional Zellenband mit geringerer Dichte. Um sicherzustellen, dass effiziente Synchronisation gemeinsame Kontrollen umfassen die Überwachung der OD 600 und Messung der Konzentrationen von Ctra Protein durch Western-Blot auf verschiedene Zellzykluszeitpunkten. Die OD 600 sollte um etwa 2-fach im Verlauf des Zellzyklus (Figur 2)...

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Diskussion

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Der bakterielle Zellzyklus ist ein grundlegender Prozess im Leben und wichtig für die Erforschung des Wachstums und als Angriffspunkt für Antibiotika der nächsten Generation. In dieser Arbeit haben wir die Schnellsynchronisationsverfahren für C. crescentus NA1000, einen Modellorganismus für die Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus und der asymmetrischen Zellteilung, detailliert beschrieben. Diese Methode eignet sich für Western Blot, Genexpressionsprofilierung und Fluoreszenzmikroskopie-Assays, um die raumz...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Shapiro-Labors und Erin Schrader für ihre Kommentare zum Manuskript. Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung aus: NIH-Postdoktorandenstipendium F32 GM100732 an JMS und NIH-Stipendien R01 GM51426 und R01 GM32506 an LS.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PVP-beschichtete kolloidale Kieselsäure (Percoll)Sigma-AldrichP4937
kolloidale Kieselsäure (Ludox AS-40)Sigma-Aldrich420840
JA10 RotorBeckman-Coulter369687
JA20 RotorBeckman-Coulter334831
Eisensulfat-ChelatlösungSigma-AldrichF0518
30 ml ZentrifugenröhrchenCorning8445
Na2HPO4EMDSX0720-1
KH2PO4VWRBDH9268-500G
NH4ClAmresco0621-500g

Referenzen

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Schlagwörter

Zellzyklussynchronisationdifferenzielle ZentrifugationIsolation von Swarmer ZellenPhasenkontrastmikroskopieWestern Blot AssaysGenexpressionsprofilierungCTRA Proteinanalyseasymmetrische Zellteilung

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