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Methodenartikel

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat

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⸱

DOI:

10.3791/52746

⸱

9. Mai 2015

 , 
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

C. elegans ist ein attraktiver Modellorganismus zur Untersuchung von Signaltransduktionswegen, die an der oxidativen Stressresistenz beteiligt sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der oxidativen Stressresistenz von C. elegans-Tieren in der Flüssigphase unter Verwendung mehrerer Oxidationsmittel in 96-Well-Platten zur Verfügung.

Zusammenfassung

Oxidativer Stress, der die Folge eines Ungleichgewichts zwischen der Erzeugung und Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies ist, ist ein wesentlicher Faktor, um chronische Humanerkrankungen, kardiovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes, Altern und Krebs. Daher ist es wichtig, oxidativen Stress nicht nur in Zellsystemen als auch mit ganzen Organismen zu studieren. C. elegans ist eine attraktive Modellorganismus, um die Genetik von oxidativem Stress Signaltransduktionswege, die sehr evolutionär konserviert sind zu studieren.

Hier stellen wir ein Protokoll, um oxidativen Stress Widerstand in C messen elegans in Flüssigkeit. Kurz gesagt, ROS-induzierenden Reagenzien wie Paraquat (PQ) und H 2 O 2 in M9-Puffer und Lösungen werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen aliquotiert. Synchronisiert L4 / jungen Erwachsenen C. elegans Tiere werden zu den Vertiefungen transferiert (5-8 Tiere / Vertiefung) und das Überleben wird gemessenjede Stunde, bis die meisten Würmer sind tot. Bei der Durchführung eines oxidativen Stressresistenz-Test unter Verwendung einer niedrigen Konzentration von Stressfaktoren in Platten, Alterung könnte das Verhalten der Tiere auf oxidativen Stress, was zu einer falschen Interpretation der Daten führen könnten, zu beeinflussen. In dem hier beschriebenen Assay Dieses Problem ist jedoch nicht wahrscheinlich, da nur L4 / junge Tiere verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll kostengünstig und Ergebnisse werden in einem Tag, die diese Technik attraktive für genetische Screens rendert erhalten. Insgesamt wird dies dazu beitragen, um oxidativen Stress Signalübertragungswege, die in bessere Charakterisierung des oxidativen Stress-assoziierten menschlichen Erkrankungen übersetzt werden konnte verstehen.

Einleitung

In Eukaryoten ist die oxidative Phosphorylierung, die sich in der Elektronentransportkette der Mitochondrien der Haupttreiber der Energieproduktion in Form von ATP. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind ein natürliches Nebenprodukt des Prozesses. Trotz ihrer wichtigen Rolle als Signalmoleküle, können übermäßige ROS auf DNA-Schäden, Protein-Carbonylierung und Lipidoxidation führen. Ein Ungleichgewicht zwischen ROS-Produktion und Entgiftung verursacht oxidativen Stress, was zu Energiemangel, Zellschäden führt, und löst den Zelltod 1,2. Oxidativer Stress trägt zur Alterung und auf die Entwicklung von vielen lebensbedrohlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Herz-Kreislauf- und neurodegenerative Erkrankungen 3-9.

Zellen enzymatischen und nicht-enzymatischen Abwehrstrategien entwickelt, um die ordnungsgemäße ROS Niveau zu halten und ihre Bestandteile vor oxidativen Schäden schützen 1,2. Superoxid-Dismutase (SOD) Enzyme wirken Erste convert Superoxid zu H 2 O 2, die später in Wasser umgewandelt wird von Katalase oder Peroxidase-Enzyme. Nicht enzymatischen Abwehrstrategien beinhalten meist Moleküle, die schneller mit ROS im Vergleich zu zellulären Makromolekülen, zum Schutz wesentlicher Zellkomponenten reagieren. Trotz der schützende Rolle von ROS Entgiftungsenzyme, einige ROS-Moleküle entweichen die antioxidativen Abwehrmechanismen und führen zu oxidativen Schäden. Erkennung, Reparatur und Abbau der beschädigten zellulären Komponenten sind wesentliche Verteidigungsstrategien während oxidativem Stress 1,2.

Signalwege in Stressresistenz und speziell oxidativem Stress beteiligt sind hoch evolutionär konservierte 10,11. Im Gegensatz zu Zellkulturexperimenten, wo organismal Bedingungen nur teilweise wiedergegeben werden, die Untersuchung von oxidativem Stress in Modellorganismen 12,13 hat eine große Bedeutung. C. elegans ist ein freilebenden Nematoden, die einfach und kostengünstig sein kann culnissen auf einem Bakterienrasen auf Agar-Medien. Es ist klein (ca. 1 mm in der Länge) und in der Regel wächst als selbstDünge Zwitter, die genetische Manipulationen erleichtert. Es hat eine schnelle Lebenszyklus und eine hohe Fortpflanzungsfähigkeit, die rund 300 Nachkommen pro Generation, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug, um groß angelegte genetische Screens 14 durchzuführen. C. elegans Genom vollständig sequenziert und 40-50% der Gene vorhergesagt werden, um Homologe des humanen krankheitsassoziierten Genen 15-18 sein. Der Knockdown von Genen von Interesse unter Verwendung von RNAi ist eine schnelle und einfache in C. elegans. Gene Herunterregulierung könnte durch Füttern von Tieren der E. erreicht werden coli-Bakterien, die ein Plasmid, das das doppelsträngige RNA, die die mRNA von Interesse 19 zielt exprimieren beherbergen. Daher hat die Bestimmung der Genfunktion mit Groß RNAi-Screens großen Einfluss auf das Verständnis der menschlichen Krankheiten, darunter Krebs 20,21.

Studium der oxidative Stressresistenz in C. elegans haben zur Identifizierung von konservierten Mechanismen der Resistenz gegen oxidative Belastung 13,22 geführt. Einige Wege identifiziert normale Wege, die Langlebigkeit und Beständigkeit zu modulieren anderen Belastungen als auch, wie Hypoxie, Wärme und osmotischen Stress. Diese Wege sind die Insulin-Signal, TOR-Signalisierung und Autophagie. Weitere wichtige Signalwege beinhalten Entgiftung von ROS wie Superoxid-Dismutase Enzyme und Enzyme Katalase, oder in Schaden zu reparieren, wie Hitzeschock und Chaperon-Proteine ​​11,13,22.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Widerstandsfähigkeit gegenüber oxidativem Stress von C. bestimmen elegans in Flüssigkeit. Wir verwendeten FLCN-1 (ok975) und Wildtyp-Tieren, das Protokoll zu zeigen, da wir zuvor in C gezeigt, eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Stress bei Verlust der FLCN-1 (ok975) elegans 23. Wir haben auch gezeigt, dass dieser Widerstand hängtauf AMPK und Autophagie, einen Signalisierungs Achse, die zelluläre Bioenergetik verbessert und fördert die Stressresistenz 23. PQ ist eine oxidative Stressfaktor, der mit der Elektronentransportkette an reaktiven Sauerstoffspezies produzieren 24 stört. Das gleiche Assay könnte angepasst werden und andere ROS Quellen oder ROS erzeugende Verbindungen könnten als H 2 O 2 und Rotenon verwendet werden, so. Ähnliche Tests wurden auf Platten, wo niedrige Konzentrationen von PQ verwendet 25,26 entwickelt. Der Vorteil dieses Tests ist, dass es sehr schnell ist, und die Ergebnisse können in einem Tag erreicht werden. Zusätzlich ist das Gesamtvolumen der Flüssigkeit verwendet, um den oxidativen Stress Resistenzassay in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt gering, verglichen mit der zur Bestimmung PQ-enthaltenden Platten herzustellen Volumens. Daher ist die Menge des verwendeten PQ im flüssigen Assay gering ist, was den Assay macht preiswerte und begrenzt die Erzeugung von Giftmüll. , Grenzen dieses Tests im Vergleich zu Plattentests sind jedoch die lack von Nahrungsmitteln im flüssigen Assay und der geringeren Konzentration an Sauerstoff in flüssiger, im Vergleich zu Luft. Dies sind wichtige Faktoren, die in einigen Fällen die Ergebnisse beeinflussen. Daher bestätigt die Reproduzierbarkeit mit anderen Methoden von oxidativem Stress Widerstand wird empfohlen, die Ergebnisse in diesem Test erhalten unterstützen.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Herstellung von Medien für C. elegans Wachstum (in diesem Fall, Tiere Wildtyp und FLCN-1 (ok975) mutierten Tiere).
    1. Bereiten Geändert Youngren nur Bactopepton (MYOB) Trockenmischung, die 5,5 g Tris HCl, 2,4 g Tris-Base, 31 g Bactopetone, 20 g NaCl und 0,08 g Cholesterin. Gut mischen mit Schütteln.
      Anmerkung: Diese Mischung ist ausreichend, um 10 l MYOB Medium herzustellen.
      HINWEIS: normalem Wachstumsmedium (NGM) Platten könnte statt MYOB Platten 27 verwendet werden. Jedoch sollte die gleiche Art von Platten für gültige Vergleiche zwischen Stämmen und zwischen unabhängigen wiederholt verwendet werden. In diesem Protokoll haben wir nur MYOB Platten.
    2. Bereiten Sie 1 l MYOB Medium durch Zugabe von 6 g MYOB Trockenmischung, 17 g Agar und auf 1 L mit H 2 O und Autoklav für 45 Minuten bei 122 ° C. Platten gießen und lassen bei Raumtemperatur trocken für 2 Tage.
    3. Unter Einhaltung steriler Techniken impfen 100 ml cultuWieder LB-Brühe-Medium mit E. coli OP50 Bakterien und wachsen O / N bei 37 ° C.
    4. Seed MYOB Platten mit E. coli OP50 Bakterien. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 48 Stunden wachsen.
  2. Vorbereitung für die Gen-Downregulation mit RNAi
    1. Bereiten MYOB RNAi-Zuführung Platten. Gehen Sie wie in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2. Nach dem Autoklavieren Das Medium auf etwa 55 ° C abkühlen gelassen und mit 1 ml 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 1 ml 100 mM Ampicillin.
    2. Streak E. HT115 coli Bakterien, die mit einem Plasmid, das entweder Steuerung EV oder FLCN-1 spezifische RNAi auf Ampicillin (50 ug / ml) / Tetracyclin (15 ug / ml) Agarplatten drückt umgewandelt. Kultur wachsen O / N bei 37 ° C.
    3. Wählen Kolonien und impfen E. coli HT115 Bakterien mit einem Plasmid, das entweder Steuer EV oder FLCN-1 spezifische RNAi und wachsen Kultur in LB / Ampicillin (50 ug / ml) mittel- und O / N bei 37 & # drückt transformiert176; C.
    4. Samen Platten mit E. coli HT115 EV Bakterien oder HT115 FLCN-1 RNAi Bakterien.
      Hinweis: Bewahren Sie Platten 48 Stunden bei Raumtemperatur vor der Verwendung. Wenn RNAi durch Einspeisen in Wirk, andere Verfahren der Abgabe der ds-RNA 28.
  3. Induziert oxidativen Stress mit Paraquat (PQ):
    1. Vorbereitung M9 Puffer durch Mischen von 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl und 0,25 g MgSO 4 · 7 H 2 O. Bringen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser. Autoklaven-Lösung für 45 min bei 122 ° C und zu speichern Flaschen bei RT.
    2. Am Tag des Assays, bereiten Sie die M9 / PQ-haltigen Lösung. Für dieses Protokoll verwenden 100 mM PQ (0,1028 g PQ in 4 ml M9-Puffer füllt ein ganzes 96-Well-Platten mit 40 ul M9 / PQ pro Vertiefung).
      ACHTUNG: PQ ist eine gefährliche und hochgiftige Verbindung. Griff nach entsprechenden Richtlinien.
      HINWEIS: Beim ersten Ausführen eine neue sZug oder ein neuer Zustand, ist es empfehlenswert, um das Überleben in steigenden Konzentrationen von PQ um das beste Konzentration, um die Tiere in 7-10 h zu töten verwenden bestimmen, zu untersuchen.

2. Herstellung von Age-synchronisiert L4 Bevölkerung

  1. Transfer 20 gravid Erwachsenen Hermaphroditen auf eine frische Platte mit MYOB E. ausgesät coli OP50 Bakterien. Vorbereitung mehrere Platten auf der Basis der Anzahl der Würmer bei den Assay benötigt.
  2. Lassen Sie sie Eier für 6 Stunden und dann mit einem Platindraht Wurm Pick entfernen Sie die Mütter legen. Überprüfen Sie die Platten unter dem Mikroskop, um die Anzahl der gelegten Eier zu bewerten.
  3. Lassen Sie die Eier schlüpfen und wachsen bei 20 ° C für 48 Stunden. Zu dieser Zeit sind die Tiere in einem späten L4 / junger Erwachsener Bühne. Wählen gleichen Stufe Tiere und Transfer zum PQ Lösung haltigen Brunnen.
    Hinweis: Da 48-stündiger Inkubation nur auf Mutanten, die ähnlich zu den Wildtyp-Tieren wachsen, ist es wichtig, zu überwachen EntwicklungsRate der neu getesteten Mutanten, um sicherzustellen, es erfüllt die Entwicklungsrate Wildtyp, sonst sollten andere Zeitleisten verwendet werden.
  4. Alternativ können Sie Synchronisationstechniken. Generieren synchronisiert Bevölkerung von L1-Larven Würmer mit Hypochlorit-Lösung (25 ml Wasser, 125 ml von 5,25% Natriumhypochlorid, 50 ml von 4 M NaOH; wickeln Flasche mit Aluminiumfolie vor Licht zu isolieren). Für diesen Test ist es nicht empfehlenswert, da intensive Bleich könnte das Verhalten der Tiere während des Assays beeinflussen.
    VORSICHT: Gehen Sie Hypochlorit-Lösung nach den Richtlinien.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von RNAi, um nach unten zu regulieren das Gen von Interesse, die Hermaphroditen zu synchronisieren, wie in Kapitel 2 beschrieben, mit der Ausnahme von der Übertragung von Müttern auf RNAi-Platten mit den spezifischen RNAi Bakterien geimpft. Wenn der Zuschlags mit der RNAi schwach ist, wird Fütterung für mehrere Generationen empfohlen.

3. Durchführung der oxidativen Stressresistenz Assay

  1. Pipette 40 ul der 100 mM PQ-Lösung (frisch zubereitet) auf jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie mindestens 12 Wells als repliziert jeder Bedingung (Behandlung, mutant, etc.). Unter Verwendung einer Platindraht-Wurm Pick, übertragen 5-8 L4-Larven Tiere jeden gut, die die Startzeit und die Endzeit.
  2. Beim Start eine weitere Bedingung, beachten Sie die Startzeit und die Endzeit. Legen Sie die Platte bei 20 ° C in der Inkubationszeit zwischen toten Tieren eine Stunde später die Übertragung der Würmer und Scoring von der Startzeit.
  3. Verwenden des Binokular, zählen Überlebens jeden hr. Die Platte Schütteln Sie vor dem Start zu zählen. Geben Sie Würmer, die sich nicht bewegen, auch nach dem Absetzen einer Licht von hoher Intensität, wie tote Tiere. Auch die Anzahl der Tiere am Leben.
    HINWEIS: Mit Blick auf Schneckenform, Schwänze und Kopfbewegung bei hoher Vergrößerung, um festzustellen, tote Würmer lebendig.
  4. Wiederholen Sie diesen Schritt jede Stunde, bis die meisten Würmer sind tot.

4. Bestimmung der Überlebensprozent zu jedem Zeitpunkt

  1. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Tiere pro Bedingung, indem Sie die Gesamtzahl der Tiere, um jedes über gut. Ignorieren Sie die Tiere, die beschädigt sind oder bei der Übertragung getötet.
  2. Für jeden Zeitpunkt berechnen die Gesamtzahl der toten Tieren pro Bedingung (Summe der toten Tiere in den 12 Vertiefungen). Für jeden Zeitpunkt berechnen Prozentsatz des Todes (Anzahl der toten Tiere dividiert durch die Gesamtzahl der Tiere und multipliziert mit 100) und den Prozentsatz des Überlebens (100 minus Prozent Tod).
  3. Wiederholen Sie diesen Test mindestens 3 unabhängigen Zeiten.

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Ergebnisse

Vergleicht man Wildtyp C. elegans zu FLCN-1 (ok975) mutierten Tiere

Hier haben wir 100 mM PQ, um den Widerstand von Wildtyp-C zu bestimmen elegans Tieren im Vergleich zu FLCN-1 (ok975) von dem gezeigt wurde auf oxidativen Stress, Hitze und Anoxie 23 zu widerstehen. Nach 4 Stunden der Behandlung, 48,3% des Wildtyp-überlebt, im Vergleich zu 77,8% Überlebensrate in FLCN-1 (ok975) Tiere. Wie erwartet, FLCN-1 (ok975) mutier...

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Diskussion

C. elegans ist ein attraktives Modellorganismus genetisch oxidative Stressresistenz in vivo zu untersuchen, da es leicht gezüchtet werden können, und führt zu einer Vielzahl genetisch identischer Nachkommenschaft schnell. Mehrere Methoden zur oxidativen Stress Widerstand zu messen, wurden zuvor beschrieben und sie sind auf die Ergänzung von Kulturplatten mit verschiedenen ROS Quellen wie PQ, Rotenon, H 2 O 2 und Juglon 25,26,29-32 basiert. Hier beschreiben wir ein Proto...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir erkennen die Caenorhabditis Genetics Center for C. elegans-Stämme. Finanzielle Unterstützung durch die Terry Fox Research Institute bereitgestellt. Wir unterstützen EP aus der Rolande und Marcel Gosselin Graduiertenstipendium und der CIHR / FRSQ Ausbildungsförderung in der Krebsforschung FRN53888 der McGill Integrated Cancer Research Training Program gewährt erkennen auch.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agar bakteriologische QualitätMulticell800-010-LG
Bakteriologisches PeptonOxoidLP0037
Natriumchlorid biotechnologische QualitätBioshop7647-14-5
CholesterinSigmaC8503-25G
UltraPure Tris HydrochloridInvitrogen15506-017
Tris AminomethanBio Basic Canada Inc77-86-1
IPTGSanta Cruz Biotechnologysc-202185A
AmpicillinBioshop69-52-3
HefeextraktBio Basic Inc.8013-01-2
Methylviologen DichloridhydratAldrich Chemie856177-1G
Petrischale 60 x15 mmFisherFB0875713A
Pipette 10 mlFisher1367520
Kaliumphosphat einbasischG-BiosciencesRC-084
Magnesiumsulfat HeptahydratSigmaM-5921
Natriumphosphat dibasischBioshop7558-79-4
Discovery v8 Stereo-Zeiss-Mikroskop
96 Well, klare Mikrotiterplatte
flcn-1 RNAi-QuelleAhringer Bibliothek

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A reference was corrected in the publication of Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:

Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).

to:

Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., & Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

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