Scalable Platte mit 96 Vertiefungen Basierend iPSC Kultur und Produktion Mit einem Robotic Flüssigkeitshandhabungssystem

Summary

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen es Laboren, skalierbare, adhärente Stammzellkulturen mit minimalem Arbeitsaufwand, Erfahrung und Ausrüstungsinvestitionen mit einem programmierbaren Liquid-Handling-Roboter und 96-Well-Platten durchzuführen. iPSCs, die mehr als 20 Mal auf diesem System durchlaufen wurden, behielten die Pluripotenz bei, normalisierte Karyotypen und differenzierten sich zu Kardiomyozyten.

Abstract

Kontinuierliche Weiterentwicklung in pluripotente Stammzellkultur ist, die Lücke zwischen Labor und Krankenbett für die Verwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin, Arzneimittelforschung und Sicherheitsprüfung. Zur Herstellung der Stammzell abgeleitet Biopharmazie und Zellen für Tissue Engineering und der Transplantation ist eine kostengünstige Zellfertigungstechnik unerlässlich. Aufrechterhaltung der Pluripotenz und stabile Leistung von Zellen in Downstream-Anwendungen (beispielsweise Zelldifferenzierung) über die Zeit ist von größter Bedeutung, um im großen Maßstab Zellproduktion. Noch so schwer sein kann, zu erreichen insbesondere wenn Zellen kultiviert werden manuell in dem der Betreiber kann erhebliche Variabilität einführen sowie prohibitiv teuer Maßstab übertragbar ist. Hochdurchsatz, groß angelegte Stammzellproduktion zu ermöglichen und zu entfernen Bedienereinfluss neuartigen Stammzellkultur-Protokolle mit einem Tischmultikanal Flüssigkeitshandhabungsroboter entwickelt wurden, die eine minimale Beteiligung Techniker oder Erfahrung erfordern. MitDiese Protokolle menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) wurden in Feeder-freien Bedingungen kultiviert direkt von einem gefrorenen Lager und in 96-Well-Platten gehalten. Abhängig von der Zelllinie und gewünschten Maßstab Aufnahmegeschwindigkeit, kann der Bediener leicht bestimmen, wann die Passage auf der Basis einer Reihe von Bildern, die optimalen Kolonie Dichten zur Aufspaltung. Dann werden die notwendigen Reagenzien sind bereit, eine Kolonie Split auf neue Platten ohne einen Zentrifugationsschritt durchzuführen. Nach 20 Durchgängen (ca. 3 Monate) aufrechterhalten zwei iPSC Linien stabil Karyotypen, ausgedrückt Stammzellmarkern und differenziert zu Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad. Das System kann anschließende Hochdurchsatz-Screening neuer Differenzierungsprotokollen oder genetische Manipulation für 96-Well-Platten entwickelt auszuführen. Diese Technologie wird den Arbeitsaufwand zu verringern und technische, eine große Anzahl von identischen Stammzellen für eine Vielzahl von Anwendungen.

Introduction

^{6 -} Die Verwendung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) hat sich seit ihrer Ableitung im Jahr 2007 für ¹ Verbindung Test, der regenerativen Medizin und Krankheit Modellierung ² erhöht. Dieser Forderung kommt von iPSC die Fähigkeit, eine große Zahl von pluripotenten Zellen, die in somatische Zellen bei einer beispiellosen Quantität differenziert werden kann ergeben. Wie verwiesen Differenzierung Techniken zu verbessern ^7-10 und Entwicklung der menschlichen Zell- oder Gewebemodellierung und Zelltherapie erhöht ^11-14, nimmt auch die Voraussetzung für die Massenproduktion von hochwertigen iPSCs. Es ist weithin zitiert, dass unter anderen Krankheiten, Herzinfarkt oder B-Zell-Funktions Ersatz wird hunderte Millionen erforderlich, um Milliarden von iPSC abgeleiteten somatischen Zellen ^15-18. Außerdem immer komplexer 3D-Gewebemodelle für Wirkstoffforschung und therapy wird eine große Zahl von Zellen ^9,13,19 verlangen. In all diesen Beispielen, definierte, gleichmäßige und reproduzierbare iPSCs müssen verfügbar sein und einfach herzustellen sein.

Zur Herstellung der Stammzell abgeleitet Biopharmazie und Zellen für Tissue Engineering und der Transplantation ist eine kostengünstige Zellfertigungstechnik unerlässlich. ²⁵ oder Suspension mit dem Einsatz von Mikroträgersubstrate ^{26 - - 28} zum Teil, weil diese Techniken erfolgreich für große, nicht-iPSC, eukaryotischen basierte Produktion eingesetzt skaliert Herstellung von iPS-Zellen wurde auf Suspensionskultur ²⁰ konzentriert. Mehrere Gruppen haben Suspensionskultur-Systeme, die pluripotenten Stammzellen ^{20,21,23,24,29} ergeben demonstriert. Allerdings sind diese Ansätze verwenden teure und komplexe Systeme nicht ohne weiteres verfügbar, um Forschern die Entwicklung neuer Differenzierungsprogramme, Fahr Tissue Engineering und tut laboratory Skala Forschung. Außerdem Federung und Mikro iPSC Kulturen erfordern Anpassung und Techniken oder Chemikalien nicht in traditionellen haft iPSC Kultur gefunden, wie kontinuierliche Verwendung von Rho-Kinase-Inhibitor, Antischaummittel und Filtration, um die Aggregation zu regulieren. Körperliche Belastung für die Zellen häufiger in Suspensionskultur, durch mechanische Bewegung als auch bei Mikro Zusammenstoß eingeleitet. Diese Probleme begrenzen die Berechenbarkeit und Geschwindigkeit, mit der neu generierten Stammzelllinien können in Suspension kultiviert werden. Andere haben Roboter-Plattenhandling-Systeme, die Platte Kultur Techniken ^30,31 nachahmen entwickelt, aber diese Plattformen verlangen erhebliche Investitionen für Ausrüstung und Know-how, um zusätzlich zu den grundlegenden Herausforderungen mit Stammzellkultur assoziiert zu betreiben.

Die folgende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Praxis einer skalierbaren iPSC Kultursystem, das eine in sich geschlossene, Standard-8-Kanal-Roboter-Flüssigkeit verwendetHandler und 96-Well-Platten. Diese Methode wurde entwickelt, um Labormaßstab iPSC Kultur und High-Volume-Produktion iPSC brücken (zB 10 ^{7 bis} 1,5 x 10 ⁹ Zellen pro Woche pro Techniker) es denjenigen die Entwicklung neuer Technologien, um iPSC leicht skalieren Produktion ohne große Hardware oder Arbeits Investitionen. Diese Methode ist relativ kostengünstig einzurichten, erfordert wenig bis gar keine Stammzellkultur, Programmierung oder Engineering-Erfahrung, hat eine kleine Stellfläche Ausrüstung, ohne die Notwendigkeit für einen dedizierten Zellkultur Kapuze und nutzt Standard-Zellkulturanlagen zu mittleren bis hohen Durchsatz ermöglichen automatisierte Zellproduktion. Ziel war es, ein System, das skalierbare Stammzellkultur, die von Labors neue Zellkultur Stammzellen verwendet werden können zu entwickeln, die, die manuelle Pflege ein Hindernis für die Entwicklung ihrer Ideen oder diejenigen, die eine wirtschaftliche Möglichkeit, eine große Anzahl von Stammzellen zu produzieren finden. Die hier vorgestellte Plattform entfernt Techniker Einfluss aufStammzellkultur und normalisiert die Fütterung und Passage, um die kontinuierlich Stammzellproduktion zu ermöglichen.

Protocol

Die Roboter-Liquid-Handling-System, das für die folgenden Protokolle war Gilson pipetmaX, erleichtert die automatisierte, skalierbare Stammzellkultur und Produktion unter Beibehaltung traditioneller adhärenten Kulturbedingungen im 96-Well-Plattenformat. Wie traditionelle 6-Well-Platte Kultur werden iPSCs mit diesem Protokoll als eine Monoschicht von verschiedenen Kolonien, aber in der 96-Well-Plattenformat gewachsen. Jedes der gut kann isogenen oder verschieden sein und jeder Konfiguration können parallel kultiviert, da die Roboter einander gut getrennt zu halten. Die typische Roboter iPSC Kultur Routine hat zwei Phasen: ein Ernährungsprogramm, wo Kulturen werden auf einer kundengerechten Zeitplan und einer Passage-Programm, wo der Benutzer die Dissoziation Verfahren und Teilungsverhältnis dadurch Aussaatdichte und Maßstab Rate Steuerung wählt zugeführt. Die folgenden Protokolle beschreiben, wie eine neue Kultur gestartet wird, wie Fütterung und Durchgang erreicht werden und die Zusatzprogramme, die iPSC Kultur zu erleichtern.

Hinweis: Bitte beachten Sie die Materialliste für spezifische Empfehlungen auf der Matrix Beschichtungsmaterial und Dissoziation Reagenzien für die folgenden Protokolle validiert.

1. Vorbereiten extrazellulären Matrix-Gel-beschichteten 96-Well-Platten

1. Entfernen Sie die Verpackung von sechs neuen, RT 96-Well-Platten und legen Sie sie auf der Flüssigkeitshandhabungsroboter Bett in den Positionen 2, 3, 5, 7, 8, 9 (siehe Abbildung 1A für Bettstellen).
2. Legen Sie eine vorgekühlte, 4 ° C 4-Well-Mulde im Bett Position 6.
3. Last Spalte 12 des Spitzengestell im Bett Position 1 mit vorgekühlten, 4 ° C 200 ul Pipettenspitzen.
4. Füllen Sie den ersten (linken meisten) trough gut im Bett Position 6 mit 25 ml 4 ° C DMEM / F12 durch Gießen eines Aliquots mit steriler Technik. Alternativ können Sie eine Pipette, um die Übertragung abzuschließen.
5. Entfernen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen Deckel und schieben Sie jeweils in die speziell entwickelte Plattendeckelhaltegestell (PLHR, siehe 1A). Kontakt vermeidenmit der Innenseite der Platte Deckel.
   Achtung: Die Zuführung des Inneren einer Platte Deckel oder Stapeln der Plattendeckeln in dem das Innere eines Deckels berührt die Außenseite des anderen ist ein ausgezeichneter Weg zur Verschmutzung.
6. Unter Verwendung der Robotersteuerung Touch-Pad, drücken Sie die folgende Reihe von Tasten, um die gut Vorbenetzung zu starten:
   1. Tippen Sie auf "Ausführen eines Protocol".
   2. Wählen Sie "extrazelluläre Matrix-Gel vornässen" und tippen Sie auf Weiter.
   3. Benutzerentscheidung: Tippen Sie auf "Testlauf", um die Schritt-für-Schritt-Assistenten verwenden, um Pre-Test des ausgewählten Programms.
      Anmerkung: Der Roboter wird nicht ausgeführt, sondern die Software prüft das Protokoll für Softwareprobleme. Mit etablierten Protokollen, Gewindeschneiden, "überspringen Setup" ist akzeptabel.
   4. Tippen Sie auf "Run Protocol".
7. Während der Pre-Netzprozess (Schritt 1.6) fahren Sie mit Schritt 1.8.
8. Auftau auf Eis einer 4 mg-Aliquot Wachstumsfaktor reduziert extrazellulären Matrix-Gel (GFRM) in einem 50 ml enthaltenkonische Röhrchen bei -80 ° C gelagert. Halten Sie das Aliquot auf Eis bis zum Gebrauch.
   Anmerkung: Die GFRM verfestigt, wenn man sie auf RT kommen und nicht sinnvoll.
9. Resuspendieren 4 mg GFRM Aliquot in 24 ml 4 ° C DMEM / F12 mit einem 25 ml Glaspipette. Bei der Übertragung des DMEM / F12, Pause für 2-3 sec, damit die Pipette zu kühlen, bevor die GFRM aliquoten resuspendiert.
10. Wenn die Pre-Benetzungsprozess (Schritt 1.6) abgeschlossen ist, fahren Sie mit Schritt 1.11.
11. Übertragen Sie die 24 ml DMEM / F12 GFRM Mischung auf der vierten und der Mulde im Bett Position 6.
12. Unter Verwendung der Robotersteuerung Touch-Pad, drücken Sie die folgende Reihe von Tasten, um die extrazelluläre Matrix-Gel-Beschichtungsverfahren zu starten:
    1. Tippen Sie auf "Ausführen eines Protocol".
    2. Wählen Sie "extrazelluläre Matrix-Gel aliquoten" und tippen Sie auf Weiter.
    3. Benutzerentscheidung: Tippen Sie auf "Testlauf", um die Schritt-für-Schritt-Assistenten verwenden, um Pre-Test des ausgewählten Programms.
       Hinweis: Der Roboter wird nicht ausgeführt, aber rather die Software testet das Protokoll für Software-Probleme. Mit etablierten Protokollen, Gewindeschneiden, "überspringen Setup" ist akzeptabel.
    4. Tippen Sie auf "Run Protocol".
13. Wenn der Schritt 1.12 abgeschlossen ist, ersetzen Sie die Platte Deckel.
14. Übertragen der extrazellulären Matrix Gel beschichtete 96-Well-Platten mit einem 37 ° C, 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator und halten es für 24 h bei welchem ​​Punkt die Platten gebrauchsfertig oder gespeichert werden.
    Anmerkung: Unter mildernden Umständen können die neu beschichtet Extrazellulärmatrix Gelplatten nach 15-30 min Inkubation aber O / N 24-stündiger Inkubation verwendet wird, empfohlen werden.
15. Wiederholungsprotokollschritte 1.1, 1.3, 1.5-1.6, 1.10, und von 1,12 bis 14, bis die gesamte DMEM / F12 mit GFRM verwendet.

2. Speichern extrazellulären Matrix-Gel-beschichteten 96-Well-Platten

1. Entfernen der extrazellulären Matrix-Gel beschichteten 96-Well-Platten aus dem 37 & deg; C, 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator.
2. Optional: Allow der extrazellulären Matrix-Gel beschichteten 96-Well-Platten, bevor sie zum Schritt 2.3 RT kommen.
   Hinweis: Dieser optionale Schritt wird reduzieren Bildung von Kondenswasser, wenn die Platten bei 4 ° C platziert.
3. Legen Sie die Platten auf der Liquid-Handling-Roboter-Bett in den Positionen 2, 3, 5, 7, 8, 9 (siehe Abbildung 1A für Bettstellen).
4. Last Spalte 12 des Spitzengestell im Bett Position 1 mit RT 200 ul Pipettenspitzen.
5. Legen Sie eine vier Trog Reservoir im Bett Position 6.
6. Füllen Sie auch 4 (ganz rechts) des Reservoirs mit RT DMEM / F12.
7. Entfernen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen Deckel und schieben Sie jeweils in die PLHR.
8. Unter Verwendung der Robotersteuerung Touch-Pad, drücken Sie die folgende Tastenkombination:
   1. Tippen Sie auf "Ausführen eines Protocol".
   2. Wählen Sie "extrazelluläre Matrix-Gel aliquoten" und tippen Sie auf Weiter.
   3. Benutzerentscheidung: Tippen Sie auf "Testlauf", um die Schritt-für-Schritt-Assistenten verwenden, um Pre-Test des ausgewählten Programms.
      Hinweis: Der robot wird nicht ausgeführt, sondern die Software testet das Protokoll für Software-Probleme. Mit etablierten Protokollen, Gewindeschneiden, "überspringen Setup" ist akzeptabel.
   4. Tippen Sie auf "Run Protocol".
9. Wenn Sie fertig sind, ersetzen Sie die Platte Deckel und entfernen Sie die Platten aus dem Maschinenbett.
10. Wickeln Sie um die gesamte Seite jedes extrazellulären Matrix-Gel beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen (wobei der Deckel erfüllt die Platte) mit einem Zoll von 6-Zoll-Paraffin-Filmstreifen. Achten Sie darauf, die Paraffinfilm auf eine luftdichte Abdichtung zu schaffen dehnen.
11. Optional: Beschriften Sie die Platten mit dem Datum abgeschlossen extrazellulären Matrix-Gel-Beschichtung, die extrazelluläre Matrix-Gel Chargennummer, Benutzername und andere Infos.
12. Speichern die Platten bei 4 ° C, wo sie gut für bis zu zwei Wochen zu verwenden.
    Hinweis: Die Platten wurden erfolgreich über die 2 Wochen Grenze verwendet wird, es ist jedoch nicht zu empfehlen.

3. Durchführen einer Stammzellkolonie EinsaatdichteGradient in der 96-Well-Plattenformat von einer Live-oder Gefrierkultur: So starten oder Wiederherstellung des normalen Passage Intervalle auf eine Stammzelllinie

1. Wenn ausgehend von einer Gefrierkultur, fahren Sie mit Schritt 3.2. Wenn mit einer Live-Stammzellkultur bereits auf einem Teller, beginnen Sie mit Schritt 3.5.
2. Auftauen gefrorenen Kultur durch Schwenken des Rohres in einem 37 ° C Wasserbad, bis nur noch ein kleines Stück Eis bleibt.
3. Optional: Verdünnen Sie die aufgetauten Zellen in 10 ml RT für 2 Minuten bei 300 · g Stammzellwachstumsmedien (SCGM), Zentrifuge, den Überstand aspirieren Medien und resuspendieren Stammzellpellet in 7 ml frisch SCGM, das 10 & mgr; M Y27632.
   Anmerkung: Dieser Schritt eliminiert Verschleppung des Gefriermedien.
4. Fahren Sie mit Schritt 3.6.
5. Als normale Durchgang die Zellen unter Verwendung von enzymatischen oder nicht-enzymatischen Dissoziation: Wenn mit Live, bereits überzogen Stammzellen. Versuchen Sie, insgesamt 1,5 bis 3.000.000 Zellen zu ernten; gewöhnlich eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Zentrifugieren der geernteten Zellen2 Minuten bei 300 · g, den Überstand aspirieren Medien und resuspendieren Stammzellpellet in 7 ml frisch SCGM, das 10 & mgr; M Y27632. Fahren Sie mit Schritt 3.6.
6. Sicherstellen, dass die Zellen, entweder aus einem gefrorenen oder lebende Kultur werden in 7 ml RT SCGM mit 10 uM Y27632 suspendiert.
7. Last Spalte 12 des Spitzengestell in Bettposition eines mit RT 200 ul Pipettenspitzen.
8. Legen Sie eine vier Trog Reservoir im Bett Position 2.
9. Legen Sie eine neue extrazelluläre Matrix-Gel beschichteten 96-Well-Platte auf 37 ° C vorgewärmt in Bettposition 5 und den Deckel entfernen Sie sie in den PLHR.
10. Übertragen Sie die 7 ml resuspendierten Zellen, um gut 3 des Reservoirs mit einer Pipette oder sterile gießen.
    1. Unter Verwendung der Robotersteuerung Touch-Pad, drücken Sie die folgende Tastenkombination:
    2. Tippen Sie auf "Ausführen eines Protocol".
    3. Wählen Sie "Seeding Density Gradient" und tippen Sie auf Weiter.
    4. Benutzerentscheidung: Tippen Sie auf "Testlauf", um die Schritt-für-Schritt-Assistenten verwenden, um vor der Prüfung die Auswahled-Programm.
       Anmerkung: Der Roboter wird nicht ausgeführt, sondern die Software prüft das Protokoll für Softwareprobleme. Mit etablierten Protokollen, Gewindeschneiden, "überspringen Setup" ist akzeptabel.
11. Tippen Sie auf "Run Protocol".
12. Wenn der Verdünnungsreihe abgeschlossen ist, re-die Platte abgedeckt und in einen 37 ° C, 5% CO _2, befeuchteten Inkubator bis zur nächsten Fütterung.
13. Optional: Beschriften Sie die Platte mit dem Datum, Dehnungsinformationen, Benutzername, Medientyp und andere wichtige Informationen.
14. Im Laufe der nächsten Tage, füttern die 96-Lochplatte als mit Protocol 4 unten erforderlich.
    Hinweis: Ein typischer Stammzellplatte wird eine vollständige Medienwechsel erfordern alle 24 h und der SCGM enthält keine Y27632 für die Fütterung; nur während der ersten Aussaat nach dem Durchgang. Vor der Fütterung, überprüfen Sie die Platte auf Verschmutzung und Koloniedichte. Siehe Schritt 3.16 für mehr über die Überwachung der Kolonie Dichte.
15. Im Laufe der nächsten Tage, mehrere Spalten in der Nähe der cgeben der Platte (in der Regel Spalten 5-8) wird eine optimale Dichte für den Durchgang zu nähern; um diese Dichte zu identifizieren, vergleichen Sie die 96-Lochplatte auf die in 3B mit den folgenden Informationen im Hinterkopf gezeigt Dichtebereich:
    1. Durchgang, wenn der Raum zwischen der Mehrzahl der Kolonien beträgt etwa 25% der benachbarten Koloniedurchmesser.
       Anmerkung: Das Grundprinzip, um die Zeit um den Durchgang zu identifizieren ist, dass ein weiterer Zyklus der Fütterung und hätte das Wachstum Kolonien Kontaktaufnahme, die vermieden werden sollten.
16. Um eine gleichmäßig verdünnte Platte starten und regelmäßige Kultur, wählen Sie eine Spalte, die in der idealen Dichte und Durchgang ist. Siehe Protokoll 5 zum Durchgang.

4. Feeding Platte mit 96 Vertiefungen Stammzellenkolonien

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Fütterung von einem 96-Loch-Stammzell-Kolonien. Die Technik kann skaliert werden, um insgesamt 6 Platten parallel unterzubringen.

1. Entfernen Sie den 96-Loch-sTEM-Zelle-Kolonien aus dem 37 ° C, 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator.
2. Überprüfen Sie die Platte auf Verunreinigungen und Zelldichte. Um zu füttern, zu gewährleisten, dass die Kolonie Dichte unterhalb der idealen Kanaldichte. Siehe 3B Informationen zur Dichte.
   Hinweis: Die Kontamination kann als trüben Medien zu präsentieren und von einem unangenehmen Geruch begleitet werden. Klein, offensichtlich nicht iPSC Aggregate können auch unter mikroskopische Untersuchung sichtbar sein. Um Zelldichte zu bewerten, siehe Schritt 3.16.1 oben.
3. Legen Sie die 96-Loch-Stammzellkolonie Platte im Bett Position 3 auf einer geneigten, 37 ° C Rampe.
4. Last Spalte 12 des Spitzengestell im Bett Position 1 mit RT 200 ul Pipettenspitzen.
5. Legen Sie eine 4-Loch-Trog in Bettposition 2.
6. Füllen gut 3 der Wanne im Bett Position 2 mit 8 ml frisch, RT SCGM ohne Y27632 entweder durch sterile gießen oder Pipette Übertragung.
7. Entfernen Sie den 96-Loch-Stammzellkolonie Platte Deckel Einlegen in das PLHR.
8. Verwendung derRobotersteuerung Touch-Pad, drücken Sie die folgende Tastenkombination:
   1. Tippen Sie auf "Ausführen eines Protocol".
   2. Wählen Sie "Colony Feed-One Plate" und tippen Sie auf Weiter.
   3. Benutzerentscheidung: tippen Sie auf "Testlauf", um die Schritt-für-Schritt-Assistenten verwenden, um Pre-Test des ausgewählten Programms.
      Hinweis, der Roboter nicht ausgeführt, sondern die Software prüft das Protokoll für Softwareprobleme. Mit etablierten Protokollen, Gewindeschneiden, "überspringen Setup" ist akzeptabel.
   4. Tippen Sie auf "Run Protocol".
9. Wenn die Fütterungsprotokoll abgeschlossen ist, Wiederbedeckung der 96-Well Stammzellenkolonieplatte und zum 37 ° C, 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator, bis zur nächsten Fütterung oder eine Passage ist nicht erforderlich. Dieser ist in der Regel nach 24 Stunden erforderlich.
   Hinweis: Es wird empfohlen, die Verfütterung Ereignis auf dem Plattenabdeckung mit dem Datum, Medientyp, den Benutzernamen und andere relevante Informationen zu erfassen.

5. Passagieren 96-Loch-Plaß Stammzellenkolonien

1. Nach mehreren Zyklen der Fütterung 96-Loch-Stammzellkolonie Platte bereit sein wird, Durchgang sein. Dieses Protokoll beschreibt Gang von einer Spalte in einer Platte mit 96 Vertiefungen, die ein Teilungsverhältnis 1.12. Der Benutzer kann das Aufteilungsverhältnis definieren und eine beliebige Anzahl von Vertiefungen oder Spalten zu teilen, einschließlich der Auswahl Wells, die nicht benachbart sein können.
2. Vergleichen Sie die 96-Loch-Stammzellkolonie Plattendichte auf 3B, ob um den Durchgang zu bestimmen. Die ideale Kanaldichte ist, wenn der Zwischenraum zwischen der Mehrzahl der Kolonien oder eine nachfolgende Förderung nicht in den Kolonien, die ineinander führen etwa 25% der benachbarten Koloniedurchmesser.
3. Untersuchen Sie den 96-Loch-Stammzellkolonie Platte unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, gibt es keine Verschmutzung.
4. Legen Sie die 96-Loch-Stammzellkolonie Platte im Bett Position 3 auf einer geneigten, 37 ° C Rampe.
5. Last Spalten 8-12 in der Spitze Befüllungsrack im Bett Position 1 mit RT 200 ul PipetteTipps.
6. Legen Sie eine 4-Loch-Trog in Bettposition 2.
7. Lassen Trog gut 1 leer, legte 8,5 ml SCGM + 10 uM Y27632 in gut 2, legte 3,5 ml 30% proteolytischen und kollagenolytische Dissoziation Reagenz (oder EDTA basiert Dissoziation Reagenz) in gut 3, legte 4,5 ml PBS in gut 4.
   Hinweis: Alle Reagenzien können bei RT oder 37 ° C liegen. RT proteolytischen und kollagenolytische Dissoziation Reagenz bei 30% verdünnt mit PBS wurde für die Fettgewebe verwendet und Fibroblasten abgeleitet iPSC Kultur beschrieben.
8. Legen Sie eine neue, vorgewärmte 37 ° C extrazellulären Matrix-Gel beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen in Bettposition 5.
9. Entfernen Sie den 96-Loch-Stammzellkolonie Platte Deckel, als auch die neue Platte mit 96 Vertiefungen Deckel und legen Sie sie beide in der PLHR.
10. Unter Verwendung der Robotersteuerung Touch-Pad, drücken Sie die folgende Tastenkombination:
    1. Tippen Sie auf "Ausführen eines Protocol".
    2. Wählen Sie "Colony Split 1.12 Spalte 1" und tippen Sie auf Weiter.
    3. Benutzerentscheidung: Tippen Sie auf "Testlauf" zu verwendender Schritt-für-Schritt-Assistenten, um Pre-Test des ausgewählten Programms.
       Anmerkung: Der Roboter wird nicht ausgeführt, sondern die Software prüft das Protokoll für Softwareprobleme. Mit etablierten Protokollen, Gewindeschneiden, "überspringen Setup" ist akzeptabel.
    4. Tippen Sie auf "Run Protocol".
11. Nachdem der Durchgang-Protokoll beendet ist, re-decken beide Platten.
12. Optional: Beschriften Sie die neue Platte mit der erforderlichen Informationen (dh, Datum, Zelllinie, Durchgangszahl, Medientyp, Benutzernamen etc.).
13. Zurückzukehren beide Platten an den 37 ° C, 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator, bis zur nächsten Fütterung oder Durchgang erforderlich. Hinweis: Das nächste Fütterung ist in der Regel nach 24 Stunden.
    Hinweis: Zellen und Kolonien auf die Platte innerhalb von 2-3 h Aufspaltung legen und sehen sehr ausgebreitet. Dies ist aufgrund der Anwesenheit von Rho-Kinase-Inhibitor und die Zellen kondensiert und die charakteristischen Stammzellmorphologie (dh gepflasterten gepackten Kolonien witen kleinen Zellvolumen zu großen Kern-Verhältnis) nach dem ersten Rho-Kinase-Inhibitor freie Fütterung.

6. Ernte Platte mit 96 Vertiefungen Stammzellen für die Produktion

Anmerkung: Stammzellenkolonien können zur Verwendung an einem beliebigen Punkt während der Kultur geerntet werden. In der Regel geschieht dies, wenn die Zellen sind bereit, um den Durchgang (siehe Protokoll 5). Dieses Protokoll beschreibt, wie elf Spalten aus einer 96-Well-Stammzell-Kolonien zu ernten.

1. Untersuchen Sie den 96-Loch-Stammzellkolonie Platte unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, gibt es keine Verschmutzung.
2. Legen Sie die 96-Loch-Stammzellkolonie Platte im Bett Position 3 auf einer geneigten, 37 ° C Rampe.
3. Last Spalten 11 und 12 in der Spitze Befüllungsrack im Bett Position 1 mit RT 200 ul Pipettenspitzen.
4. Legen Sie eine 4-Loch-Trog in Bettposition 2.
5. Lassen Trog gut 1 leer, legte 8,5 ml SCGM in gut 2, legte 3,5 ml 30% proteolytischen und kollagenolytische Dissoziation Reagenz (oder EDTA basiert Dissoziation Reagenz) in gut3, legte 4,5 ml PBS in gut 4.
   Hinweis: Alle Reagenzien können bei RT oder 37 ° C liegen.
6. Entfernen Sie den 96-Loch-Stammzellkolonie Platte Deckel und Platz in der PLHR.
7. Unter Verwendung der Robotersteuerung Touch-Pad, drücken Sie die folgende Tastenkombination:
   1. Tippen Sie auf "Ausführen eines Protocol".
   2. Wählen Sie "Colony Ernte Spalten 2-12" und tippen Sie auf Weiter.
   3. Benutzerentscheidung: Tippen Sie auf "Testlauf", um die Schritt-für-Schritt-Assistenten verwenden, um Pre-Test des ausgewählten Programms.
      Anmerkung: Der Roboter wird nicht ausgeführt, sondern die Software prüft das Protokoll für Softwareprobleme. Mit etablierten Protokollen, Gewindeschneiden, "überspringen Setup" ist akzeptabel.
   4. Tippen Sie auf "Run Protocol".
      Hinweis: Sobald das Inkassoverfahren abgeschlossen ist, werden die Zellen in Trog gut 2 und abholbereit.

Results

Entwicklung einer Platte auf der Basis Roboterstammzellkultur-Plattform.

Die Nachfrage nach iPSCs wird wegen ihrer Nützlichkeit in der Medikamentenentwicklung und der regenerativen Medizin wächst. Doch skalierbare Produktion ist auf Suspensionskultur ³² in relativ komplexe Geräte, die viele Forscher schließt und weicht von festhaftenden Kulturverfahren konzentriert. Anstatt bewährte Platte auf der Basis der Stammzellkulturverfahren, wie zum Beispiel die Umstellung auf eine Suspensionskultur oder mit Hilfe eines Mikro drastisch verändern, konzentrierten wir uns auf die Miniaturisierung und Automatisierung unserer bestehenden haft iPSC Kulturtechniken. Das erste Ziel war es, zu automatisieren Fütterung und Passagieren, die gesamte Kulturverfahren zu normalisieren. Eine Plattform, die schnelle Scale-up mit bestehenden Technologie wurde ebenfalls erforderlich. Um diese Ziele wurde eine Methode zur Kultur Stammzellen entwickelt, bei einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystem (Figur 1) zu erreichen. Die protocols hier mit der Liquid-Handling-Roboter für die Fütterung und Gang entwickelt kein Zentrifugationsschritt oder kontinuierliche Überwachung durch einen Techniker erforderlich. Diese Protokolle wurden mit zwei Feeder-freien iPSC Linien entwickelt; eine von Fibroblasten abgeleitet und der andere von Fettzellen ^33.

Das computergesteuerte Flüssigkeitshandhabungssystem (1A) aus einem Flachbett, die vorne und hinten bewegt. Das Bett hat neun, ca. 5 x 3,3 Zoll nummerierten Vertiefungen mit Druckhalteklammern zur Standard-Zellkulturplatten, Flüssigkeitsbehälter und andere kundenspezifische Hardware zu akzeptieren. Die Pipettenkopf bewegt sich von links nach rechts (senkrecht zur Bewegungsbett) sowie nach oben und unten. Zusammen mit dem Bett kann der Pipettenkopf so programmiert werden, zu entfernen oder zu liefern Medien überall auf dem Bett nach dem Aufnehmen Pipettenspitzen aus einem nachfüllbaren Racks. Falls erforderlich, kann jede der 96 Vertiefungen getrennt gehalten werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Bei der vorliegenden Ausgestaltung, 0 bis200 ul Medien können von jedem Spitze des Pipettenkopf bewegt werden, aber auch andere Volumenbereiche sind möglich, basierend auf Spitzengröße.

Wenn das Passagieren Stammzellen in Standardplatten, enzymatische oder chemische Spaltung erfordert typischerweise Inkubation bei 37 ° C. Anfängliche Tests bestätigt Dissoziation mit einem proteolytischen und kollagenolytischen Dissoziation Reagenz oder einer EDTA Reagens, um eine Dissoziation und Homogenität der Koloniegröße für unsere zwei 96 Vertiefungen iPSC Linien produziert eine bessere Leistung bei 37 ° C als RT sowohl zur Zeit (Daten nicht gezeigt). Um die Teilung Prozess zu automatisieren und zu vermeiden beweglichen Platten in und aus einem Inkubator, abgeschrägt, temperaturgesteuerte Rampen, die zu akzeptieren und reproduzierbar zu positionieren Standardkulturplatten wurden (Abbildung 1A) gebaut. Wenn die Rampen wurden auf 37 ° C, einem proteolytischen und kollagenolytischen Dissoziation Reagens oder EDTA basierend Dissoziation der iPSCs von 96-Well-Platten erhitzt war vergleichbar mit Platten in einem Inkubator bei 37ºC (Daten n platziertot gezeigt). Die geneigten Rampen wurden auch genutzt, um Pipettenspitzen ermöglichen, Inhalte eines ganzen gut ist (weniger als 5 & mgr; l Restvolumen) durch das Erreichen der tiefsten Stelle in der Erwägung, dass auch Aspiration aus einer flachen Platte sammeln links ein Restvolumen von ca. 10-15 & mgr; l, was in Zellverlust. Die geneigte Rampe erlaubt auch die Wells durch Ausstoßen von Medien am oberen Ende des Bohrloches geneigt gewaschen werden (zerrieben), und um es am Boden zu sammeln.

Roboter Kultur von Stammzellen in der 96-Well-Plattenformat; Fütterung und Passagieren.

Kultur iPSCs mit der Roboter-Flüssigkeitshandhabungssystem hat zwei Phasen; Durchgang und Fütterung. Wenn eine Kolonie ist bereit, Durchgang, wird sie in einem vorbestimmten Verhältnis aufgeteilt, um eine neue Platte, die dann in regelmäßigen Abständen zugeführt Saatgut, bis er bereit ist, Durchgang ist wieder (Abbildung 1B). Gefrorenen oder nicht-96-Well-Kulturen können im 96-well Format gestartet werden, und geben Sie den Durchgang / feed sofortZyklus. Zellen, die nicht verwendet werden, um die Kolonie, die die Mehrheit der eine Platte zu erhalten, werden für andere Zwecke entnommen und für die Herstellung Bestandteil dieses Systems.

Zuführung 96 Vertiefungen kultiviert iPSCs wird erreicht, wenn einige oder alle der Medien ist nach einer Zeit der Kultur entnommen und in einem Abfallbehälter abgelegt. Dann frisches Medium wird auf der gleichen Platte aliquotiert. Der Roboter kann neue Tipps und Medientröge verwenden, um jeder für völlig kunden Ernährung, einschließlich Mischen konditionierten Medien mit neuen Medien gut zu trennen.

Typische Durchgang von Stammzellen erfordert ein Verfahren zur Dissoziation und oft einen Zentrifugationsschritt. Die hier beschriebenen Protokolle zielt darauf ab, die Dissoziation zu normalisieren und zu beseitigen Zentrifugation. Die Passage Protokoll beginnt, wenn der Roboter liefert Dissoziation Reagenz zu 96-Well-Platten auf 37 ° C geneigten Rampen montiert. Nach einer vorgegebenen Zeit werden die dissoziierten Zellen mit einem Waschvorgang, wobei der Anwender contro gesammeltenl die Position, die Wiederholung, die Lautstärke und Verreiben Rate. Enzym Zeit Verreiben Rate und die Anzahl der Wiederholungen Verreiben waren ausreichend, um dissoziierte Koloniegröße und Homogenität (Abbildung 2) variieren, aber jeder Parameter einstellbar ist, um die Anforderungen eines bestimmten Zelllinie geschaffen. Diese Steuerung entfernt Variabilität durch Techniker, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten, Positionen und Wiederholungen pipettieren eingeführt. Sobald die dissoziierten Zellen werden gesammelt und in einem Behälter mit frischem Medium vereinigt, sie auf eine neue Platte verteilt sind. Zentrifugiert und Aussaat Probleme von Substratabbau oder Zelltod aufgrund Aktion Enzym zu vermeiden, wurde die Dissoziation Reagenz auf den Minimalpunkt akzeptabel Dissoziation, die in zuverlässigen Impfen führte verdünnt. Diese Technik war wirksam für einen proteolytischen und kollagenolytischen Dissoziation in Reagens mTeSR1 Medium ^34, das einen relativ hohen Proteingehalt hat, sondern auch wirksam bei niedrigen Proteinmedien wie Essential-8 ³⁵

Steuerung der Aussaatdichte von Stammzellen nach dem Durchgang ist von größter Bedeutung, um Routine und erfolgreiche Stammzellkultur. Seeding zu niedrig oder hoch in Eileiter Differenzierung und Verlust der Pluripotenz zusätzlich zu verursachen unregelmäßigen Durchgang Abständen führen. Typische Stammzellkultur stützt sich auf Verhältnis Spaltung, wo eine Vertiefung einer 6-Well-Platte wird verwendet, um eine ganz neue 6-Well-Platte Saatgut (a 1: 6 split). Mit der Flüssigkeitshandhabungsroboter dieses Verhältnis kann eingestellt werden, um den Bedürfnissen des Benutzers zu entsprechen (zum Beispiel 1: 6, 1: 9, 1:12 usw.) und es den größten Einfluss auf den Durchgang Intervall. Der Roboter kann weniger als eine Spalte, eine gesamte Spalte (8 Wells) oder mehr als eine Spalte ernten je nach den Anforderungen des Benutzers, die empirisch bestimmt werden sollte. Die Fett- und Fibroblasten abgeleitet iPSCs halten einen regelmäßigen 3 Tage Fütterung Zeitplan mit Durchgang am vierten Tag, wenn aufgeteilt 1.12. In diesem Fall wurde eine Spalte geerntet und verwendet werden, um eine neue Platte mit 96 Vertiefungen Samen, die Schaffung eines 1.12 Split mit jedem Zyklus (3A). Die restlichen 11 Vertiefungen wurden dann für Downstream-Anwendungen zur Verfügung. Um diese 11 Produktionsbohrungen Ernte wurde der Durchgang außer Protokoll wurden die Zellen in einen Trog zum Einzug wiederholt. Alternativ können die Zellen auf der Platte gelassen und direkt verwendet werden.

Um konsistente Aussaatdichte Durchgang zu Durchgang, ohne zu zählen zu erreichen, und die Aufrechterhaltung eines Routinespalt Zeitplan, können Sie unsere Protokolle zur Aufspaltung des gleichen vorbestimmten Anzahl von Spalten, wenn die Kolonie ist in einem idealen Dichte für den Durchgang. , Damit die Benutzer die richtige Dichte für den Durchgang zu identifizieren, wurde eine Serie von Bildern erzeugt, die einen Bereich von Dichten mit einem hervorgehoben ideal Kanaldichte (3B). Zu bestimmen, wann Gang, untersucht ein Techniker ihre Platte und vergleicht sie mit der Bilddichte Maßstab. Die Ideel Dichte um einen Durchgang aus der Kultur der Fett- und Fibroblasten abgeleitet iPSCs ermittelt und festgestellt, dass, wenn der Raum zwischen den meisten Kolonien betrug etwa 25% von benachbarten Koloniedurchmesser. Es ist wichtig, daß die Kolonien homogen verteilt werden. Diese Menge an Kolonie Trennung korreliert mit der maximalen Dichte wünschenswert, weil eine zusätzliche Fütterung Zyklus würde in Kolonien zu berühren, was ein Auslöser für Eileiter Differenzierung führen.

Eine notwendige Protokoll hier entwickelten Adressen, wie man eine Kultur im 96-well Format zu starten und wie man eine Kultur nach einer Dichte Problem zurückzusetzen. Wenn eine neue Kultur begonnen wird, die beste Einsaatdichte und Anzahl der Vorschubzyklen Passagierung sind unbekannt. Um eine brauchbare Dichte nach der Aussaat zu gewährleisten, bestehenden oder aufgetauten Zellen in einer 96-Well-Platte verteilt sich der Roboter in einer seriellen Verdünnung (4A). B. Ergebnisse eines solchen Farbverlauf sind in Abbildung 4B-E gezeigt ist. Nach mehreren FütterungZyklen, nähern einige Spalten die ideale Dichte zu spalten, an welcher Stelle ein Techniker verwendet den Roboter, um eine einheitlich verdünnte Platte Saatgut regelmäßig Kultur beginnen. Dieser Dichtegradient-Protokoll wurde auch zur regelmäßigen Intervallen und Koloniepassage Homogenität zu einer unregelmäßigen Platte wiederherzustellen. Wenn der Durchgang verzögert oder verfehlt, Kolonie Dichte und Größe zu hoch, während wenn der Durchgang zu früh ist, ist Koloniedichte zu niedrig, und einzelne Kolonien zu groß werden, ohne daß gleichmäßig über die gut verteilt. Der Dichtegradient-Protokoll löst diese Probleme und ermöglicht dem Benutzer, durch Abheben eine ideal ausgesät Satz von Vertiefungen erneut starten.

Zwei iPSC Linien blieb pluripotenten nach 3 Monaten der Roboter Kultur.

Pflege der Stammzell Pluripotenz kann nachteilig von Kulturbedingungen ^36,37 betroffen sein. Zu beurteilen, ob Fett- und Fibroblasten abgeleitet iPSC Linien (a-iPSC, f-iPSC, respectively) gehalten pluripotency wenn robotisch in 96-Well-Platten für eine längere Zeitdauer kultiviert werden, sind die beiden Leitungen auf der Flüssigkeitshandhabungsroboter, wie oben beschrieben, für 3 Monate, und dann wurden Pluripotenzmarker sucht kultiviert. Für diesen Zeitraum werden beide Leitungen wurden mit einem proteolytischen und kollagenolytischen Dissoziation Reagenz mehr als 20 mal, ohne Zentrifugation agiert. Festen Platten mit 96 Vertiefungen von a-iPSC und F-iPSC Leitungen für Oct4 und Nanog gefärbten zeigte Kernakkumulation dieser Marker während SSEA-4 wurde auf der Zelloberfläche (5A-L) beobachtet. Dies steht im Einklang mit früheren Berichten für pluripotente iPSCs ^38-41. Gegenfärbung mit DAPI ergab keine zusätzlichen Zellen, die nicht auch positiv für die drei Pluripotenzmarker waren. Chromosomenanomalien sind üblicherweise während Stammzellkultur ^42,43 beobachtet, jedoch nicht auf die Verteilung der Pluripotenzmarker wie in Abbildung 5A-L gezeigt ist. Karyotype Analyse ergab, beide Roboter agierten iPSC Linien hatten 46 normalen Chromosomen, was auf die Roboter-Kulturverfahren nicht chromosomale Instabilität hinaus, was normalerweise auftreten könnten (Abbildung 5 M-N) einzuführen.

Zu sondieren etablierten Stammzellgenexpressionsmarker ^1,41,44,45 in den Roboter kultiviert iPSC Linien wurde Gesamt-RNA in parallel zur Färbung und Karyotyp-Analyse gesammelt. Beide 96-Well-Platte iPSC Linien hatten ähnliche Ausdruck Pluripotenzmarker NANOG, POU5F1 und REX1 wohin Kardiomyozyten aus jeder Zeile unterschieden nicht taten, noch eine separate Linie von humanen dermalen Fibroblasten (HDF) (Abbildung 6). Die von beiden Linien abgeleitet Kardiomyozyten wurden MYL7 positive während die HDFs und Stammzellen nicht MYL7 auszudrücken. Beide iPSC Linien wurden in Kardiomyozyten mit dem kleinen Molekül unterscheiden, Wnt-Signalweg Manipulationstechnik kürzlich beschriebenen ⁴⁶ (Abbildung 7). Differenzierung in Kardiomyozyten in dem Format mit 96 Vertiefungen wurde erfolgreich in mehr als 80% der Vertiefungen (Daten nicht gezeigt). Zusammen deuten diese Daten 3 Monate und mehr als 20 Passagen von Roboterkultur ergab chromosomal normalen Zellen, die eine Transkriptions-Programm in Übereinstimmung mit Pluripotenz, die auch in der Lage Differenzierung zu Kardiomyozyten wurden.

Abbildung 1. Übersicht über die Roboter-Stammzellkultur Ausrüstung und typische iPSC Kultur Routine. (A) Robotic Liquid Handling mit typischen Bett Layout für gezeigte System 96-Loch-Stammzellkultur. New sterile Pipettenspitzen (Tips), entfernbare Spitze Abfallbehälter (Waste), Multi-Well autoklavierbar Trog erforderlich halten flüssigen Reagenzien (Liquids), 96-Well-Platten positioniert sind eine d auf einem temperaturgesteuerten unterstützt, geneigte Rampe (96-Well-Platten), 8-Kanal-Pipette Roboterkopf, der links / rechts und oben / unten (Pipet Kopf) bewegt. Platte Deckel Haltegestell (PLHR). Bed Positionsnummern in der folgenden Tabelle dargestellt. (B) Robotic iPSC Kultur hat zwei Phasen: Fütterung und Passage. Der Kreislauf der Zellproduktion beginnt, wenn eine Kolonie Platte ist bereit, Durchgang. Der Benutzer wählt das gewünschte Verhältnis zu Durchgang an, und der Roboter Samen eine neue Gruppe von Platten mit 96 Vertiefungen dann in regelmäßigen Abständen wieder zugeführt, bis sie zur Passage. Wenn die Platten sind bereit, Durchgang, die meisten von jeder Platte wird nicht verwendet, um nachfolgende Kolonieplatten Samen und ist für andere Zwecke zur Verfügung, damit die die Produktionsphase des Systems. Gefroren oder bestehende Zelllinien können jederzeit eingebracht und in der Zufuhr / Passage-Zyklus eingehalten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Robotic Liquid-Handling-Parameter können verwendet werden, um iPSC Kolonie Dissoziation Eigenschaften steuern. Jeder Vertreter Bild zeigt Fibroblasten abgeleitet iPSCs dissoziiert nach der angegebenen Behandlung noch im 96-well suspendiert. (Obere Reihe, A - C) Enzymzeit, kein Zerreiben. Fibroblasten abgeleitet iPSCs in 96-Well-Platten gezüchtet wurden zunehmenden Zeiten von proteolytischen und kollagenolytischen Dissoziation Reagenz Dissoziation und ohne Roboter Verreiben wurde unter unterzogen. (Mittlere Reihe, D - F) Verreiben Rate, nur 3 Minuten Enzym. Die Zellen wurden bis drei Minuten von proteolytischen und kollagenolytische Dissoziation Reagenz Behandlung ausgesetzt und dann 175 & mgr; l Wachstumsmedium aufgebracht wurde und jede Vertiefung auf und ab sofort bei der angegebenen Geschwindigkeit pipettiert. ul / sec = Mikroliter per Sekunde. (Untere Reihe, G - I) Verreiben Wiederholungen, nur 3 Minuten Enzym, 160 ul / Sek. Die Zellen wurden auf proteolytische und kollagenolytische Dissoziation Reagenz für 3 Minuten ausgesetzt wurden 175 & mgr; l Wachstumsmedium aufgetragen, dann bei 160 l / s für die angezeigte Anzahl der Wiederholungen verrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Typische Fett- und Fibroblasten iPSC Kolonie Wartungsschema und eine Reihe von Kolonie Dichte Bilder zu bestimmen, wann eine regelmäßige Fütterung Gang / Durchgangszyklus zu halten. (A) Beginnend mit einer fetthaltigen oder Fibroblasten-96-Well-iPSC Kolonie bereit, Durchgang, eine Spalte von Zellen wurde auf den Roboter ohne Zentrifugation agiert und verwässert12 neue Spalten, die in bestimmten Zeitabständen danach gefüttert wurden, bis die Platte war wieder bereit, Durchgang. Für die Zellproduktion, wurden Spalten nicht verwendet werden, um die Kolonie zu erhalten agiert und für die anschließende Verwendung gesammelt. Eine beliebige Anzahl von Spalten agiert, um Expansionsrate zu steuern. (B) zu bestimmen, wann Gang eine Reihe von Dichtebilder erfasst alle 24 Stunden wurde für Benutzer zur Verfügung gestellt. In der oberen roten Feld (innerhalb 72 Stunden nach der ersten Aussaat) die Kolonie ist nicht dicht genug, um den Durchgang und sollte gefüttert werden. Wenn die Dichte übereinstimmt, in die grüne Box (bei ~ 96 h) gezeigt, ist die Kolonie zu einem idealen Dichte für den Durchgang. 120 h ist die Kolonie zu dicht, um Durchgang und dieses Szenario zu vermeiden. Letzteres kann mit einer Aussaatdichte gradient aber Routinekultur bei dieser Dichte wird dringend abgeraten gelöst werden. Weiße Balken entspricht 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere versi ansehenauf dieser Figur.

4. 96-Loch-Roboter-Kultursystem ermöglicht es Benutzern, Kulturen von gefrorenen oder aktive Zelllinien zu starten und führen Sie eine Aussaat Gradienten. (A) A Zellenlösung wird durch den Benutzer aus einer gefrorenen Zell Lager oder nach der Ernte eine aktive Kultur vorbereitet und platziert am Roboter. Der Roboter führt dann eine Verdünnungs Protokoll, um die anfängliche Zelllösung auf der Platte mit 96 Vertiefungen mit dem Dichtegradienten nach der Kolonne verteilt zu verteilen. (B - E) Beispiele für Zelldichte von vier der zwölf Spalten von A, 48 h nach dem Impfen Dichtegradienten Protokoll. Weiße Linien gleich 225 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehenAbbildung.

Abbildung 5. Pluripotenz ist für Fett- und Fibroblasten abgeleitet iPSC Leitungen während 96-Loch-Roboter-Kultur für 22 (Fettgewebe) oder 23 (Fibroblasten) Passagen (~ 3 Monate) erhalten. (A - L) Fett- und Fibroblasten abgeleitet iPSC Zelllinien Roboter zugeführt werden und wie im Text, ohne Zentrifugation in 96-Well-Platten für 22 oder 23 Durchgänge dann fixiert und für Pluripotenzmarker Oct4, Nanog oder Ssea4 befleckt mit DAPI Gegenfärbung beschrieben agiert. Weiße Balken entspricht 100 & mgr; m. (M - N). Parallel-Kulturen wie in A beschrieben, wurden zur Karyotyp-Analyse, die einen normalen Zahl von 46 Chromosomen zeigte eingereicht Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen of dieser Figur.

Abbildung 6. Adipose (96-A) und Fibroblasten (96-F) abgeleitet iPSCs kultiviert für mehr als 20 Passagen im 96-well Format Roboter gehalten Pluripotenz Genexpression und zu Kardiomyozyten differenziert. Gesamt-mRNA wurde aus beiden Roboter kultiviert iPSC Linien extrahiert sowie Kardiomyozyten aus beiden Linien differenziert (CM-A = Fett iPSC abgeleitete Kardiomyozyten, abgeleitet CM-F = Fibroblasten iPSC Kardiomyozyten, sammelte 14 Tage nach der Differenzierungsinduktion) und für die RT-PCR verwendet werden, um Pluripotenzmarker NANOG, POU5F1, REX1 sondieren, Kardiomyozyten Marker MYL7 und Ladekontrolle GAPDH. Humane dermale Fibroblasten (HDF) wurden gesammelt und als eine nicht-iPSC nicht cardiomyocyte Kontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7 Fibroblast und Fettgewebe abgeleiteten iPSCs behielt die Fähigkeit, in Kardiomyozyten nach Langzeit 96 Vertiefungen Roboter Kultur unterscheiden (A - H). Fett- und Fibroblasten iPSCs in 96-Well-Roboter-Format für mehr als 20 Passagen kultiviert wurden in Kardiomyozyten differenziert . 14 Tage nach der Differenzierung Induktion wurden 96-Well-Platte gebunden Kardiomyozyten dissoziiert und bei einer niedrigen Dichte auf Glasobjektträger für Immunfärbung von Troponin T (rot), F-Aktin (grün) und Zellkerne (blau) erneut plattiert. Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.

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Abbildung 8. Scaling up Platte mit 96 Vertiefungen Stammzellkultur. Scale up der Stammzellproduktion ist abhängig von der Anzahl der Platten verwendet werden, um die nachfolgende Gruppe von Platten Samen. Der Benutzer kann ein Produktionsniveau aufrecht zu erhalten entweder durch Passagieren die gleiche Anzahl von Platten in jedem Split Gelegenheit oder Produktion zu erweitern durch Impfen mehr Platten. Zum Beispiel im Zyklus 0, einer 96-Well-Platte ist mit zwölf neuen Platten agiert (Zyklus 1), die Schaffung eines 12-fache Expansion. Dieser Satz kann beibehalten werden, wenn einer der zwölf Platten ist mit einem neuen Satz von zwölf Platten (Zyklus 1 bis 2) passagiert oder durch Passagieren mehrere Platten (Zyklus 2-3) erweitert. Während des Durchgangs, irgendwelche Platten nicht verwendet werden, um die Kolonie zu halten für Downstream-Anwendungen zur Verfügung. Für andere Anwendungen 12 zur Kolonie Wartung und 132: Deshalb routine Passagieren 12 Platten könnte so viele wie 144 Platten in zwei Durchgänge ergeben."> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 9. Wirkungsgrad von 96-Well-Platte auf Basis Kultur zur Zellproduktion manuelle Pflege bei weitem übersteigt. Wie in 8 angegeben, kann eine Platte agiert bis zwölf Platten, die dann zu 144 Platten agiert werden kann Saatgut werden. Dieser Expansionsrate kann auf zwei Split-Möglichkeiten erreicht werden. Ein Techniker benötigt etwa 3,5 Minuten bis zu einer 6-Well-Platte zu ernähren während sie etwa 30 s zu verbringen mit einer Platte mit 96 Vertiefungen, um es auf dem Mikroskop zu untersuchen und auf den Roboter. Wenn der Techniker 144 Platten tragen, sie etwa 1,2 hr Handhabung Platten verbringen werden bei der Fütterung mit dem Roboter in der Erwägung, Hand Kultur wird eine spezielle 8 Stunden zu füttern müssen. Bitte klicken Sie hier, um vIEW eine größere Version dieser Figur.

Discussion

In der vorliegenden Studie ein Verfahren zur Roboterkultur für iPSC Produktion, die miniaturisiert und automatisiert die Fütterung und Durchgang in eine 96-Well-Plattenformat und gleichzeitig eine effiziente Scale-up haben wir. Ein Flüssigkeitshandhabungsroboter wurde verwendet, um routinemäßig zu füttern iPSC Kolonien und Gang sie in regelmäßigen Abständen durch enzymatische Spaltung. Der Roboter wurde so programmiert, dass der extrazellulären Matrix-Gel-beschichteten Platten produzieren und führen Sie eine Aussaat Dichtegradienten. Wenn Fibroblasten und Fettgewebe abgeleiteten iPSCs wurden in diesem System für mehr als 20 Passagen, etwa 3 Monate lang kultiviert wurde Pluripotenz aufrechterhalten, wie auch stabilen Karyotyp. Beide Zelllinien wurden in der Lage Differenzierung zu Kardiomyozyten. Zusammen, die Sammlung von Protokollen hier beschriebenen können Anwender mit sehr wenig Stammzellkultur Erfahrung oder nur begrenzten Zugang zu spezialisierten Kulturanlagen, die Kultur Stammzellen und eine hohe Zellproduktion oder mehreren Leitungen Umgang mit minimaler Arbeit und Kosten.

Die Roboter-Protokolle hier detailliert ein Verfahren zum wirtschaftlichen Maßstab aus iPSC Herstellung und Handhabung. Ein Vorteil ist, skalierbaren Stammzellkultur in einem etablierten Platten basiertes Format hier gezeigt und zuvor ^{44,47 - 49,} um Pluripotenz aufrechterhalten. Während andere Formate von skalierbaren Stammzellkultur Ausbeute pluripotenten Zellen ^20,23,29 diese Platte basierte Methode erfordert im wesentlichen keine Veränderung der Kultur-Format, wie die Anpassung an Suspension, die Verwendung von Antischaum Chemikalien oder längerer Verwendung von Rho-Kinase-Inhibitor ^20. Diese Platte basierend Verfahren kann daher schnell und vorherzusehen war, unterzubringen neuen Linien, weil die Kulturbedingungen sind ähnlich. Da der Einsatz von iPS für Krankheit Modellierung erhöht ^4,6,19,50 werden neue iPSC Linien kontinuierlich erzeugt. Die hier beschriebenen Techniken sind am besten geeignet zur Kultur neue Zeilen in mittleren bis hohen Volumen und den Durchsatz, da die Schranke auf dem Format Übergang low. Dies gilt auch für die Arbeit und Ausrüstung notwendig, um die Kolonien zu erhalten. Schließlich, da das Format und Handhabung ähnlich der zur Ableitung und Validierung iPSC Leitungen Kultur Leistung, wie eine gerichtete Differenzierung Umwelt sind, ist wahrscheinlich mehr vorhersagbar.

Figur 8 veranschaulicht eine Strategie zur Maßstabsvergrößerung der Herstellung von Stammzellen in 96-Well-Platten. Eine Platte (Zyklus 0) wird verwendet, um Roboter Saatgut 12 neue Platten, eine 12-fache Erhöhung (Zyklus 0-1). Nach einigen Tagen der Fütterung, eine der zwölf Platten agiert, um einen weiteren Satz von zwölf Platten (Zyklus 1 Zyklus 2) Samen. Die verbleibenden elf Platten sind nun für andere Verwendungen verfügbar sind und für die Herstellung Komponente des Systems. Bei diesem Tempo wird Gang von einer Platte bieten 11 Platten pro Zyklus oder alle 3-4 Tage. Diese Methodik kann mehr skaliert, wenn mehrere Platten werden passagiert, wie in dem Übergang von Zyklus 2 Zyklus 3 gezeigten Zyklus 3 ist, sind zwei Plattenimmer dann verwendet, um die Kolonie zu erhalten und Saatgut 24 neue Platten. Die verbleibenden 22 Platten werden dann zur Verwendung nach jedem Durchgang Zyklus zur Verfügung. An irgendeiner Stelle in der Wartungszyklus kann der Benutzer mehrere Platten zur Steigerung der Produktion Samen. Ein Beispiel wäre, um Durchgang jede Spalte für zwei Wachstumsperioden betragen. Der erste Durchgang wandelt einen Platte in zwölf Platten und jeder der zwölf Platten verwendet wird, um Platten 144 Samen. In diesem Fall beginnt ein Benutzer mit einer Platte und nach zwei Durchgängen oder etwa 1,5-2 Wochen Kultur mit 144 Platten. Beispielsweise ergeben die Fibroblasten und Fett iPSC Linien etwa 25 bis 75.000.000 Zellen pro Platte mit 96 Vertiefungen, wenn bereit, Durchgang. 144 Platten könnte daher repräsentieren etwa 4-7 x 10 ⁹ Zellen.

Was ist der Arbeitsaufwand für die 144 Platten mit 96 Vertiefungen Roboter trägt? Eines der Ziele für diese Arbeit war skalierbaren Stammzellproduktion, die Arbeit reduziert im Vergleich zu herkömmlichen (dh 6-Well-Platte) Stammzellkultur. Der Roboter accomplishes dies durch die Linderung der Notwendigkeit, jede Platte physisch hand während Fütterung und Passagieren. Während 96-Well-Platte Produktion Skalen linear, wie es wäre in der traditionellen 6-Well-Platten, ist die Zeit, ein Techniker verbringt die Arbeit mit den Platten deutlich weniger mit Roboter-Kultur. Die Produktionseffizienz von Roboterkultur aus dieser Differenz (Figur 9) abgeleitet wird. Es wurde festgestellt Techniker konnten eine 6-Well-Platte aus dem Inkubator der Platte in etwa 3,5 Minuten zu entfernen, überprüfen Sie es auf dem Mikroskop, dann absaugen und zu füttern. Demgegenüber verbringen Techniker etwa 30 sec eine 96-Well-Platte aus dem Inkubator entfernt und deren Prüfung unter dem Mikroskop auf Dichte und Verunreinigungen vor der Platzierung auf den Roboter. Mit einem erweiterten Fütterungsprotokoll ähnlich dem oben beschriebenen können sechs Platten mit 96 Vertiefungen geladen und zugeführt werden, was in etwa 21 min, bzw. 3,5 min pro Platte erfolgt. Die Gesamtzeit, um eine Platte zu ernähren ist vergleichbar zwischen Roboteric und manuellen Methoden, sondern auf Handanlage 6 Platten ein Techniker wird für alle 21 min benötigt, während die Techniker nur 3 min Umgang mit den sechs Platten für den Roboter (30 sec Inspektion pro Platte) verbringt. Wie Abbildung 9 zeigt, ist die Zeit ein Techniker verbringt Handhabung 144 Platten mit dem Roboter ist etwa 1,2 Stunden, im Gegensatz zu 8 Stunden von Hand und der Roboter werden nie einen Fehler machen, die Handhabung der Platten oder Überleiten von Flüssigkeiten.

Die hier beschriebenen 96-well iPSC Kulturmethoden eine tractable Plattform für komplexe Screening-Aufgaben. Weil jede Vertiefung genetisch identisch und mit der gleichen Dichte aus der gleichen Ausgangspool ausgesät können Variablen über die Platte verteilt sind und durch den Roboter mit handelsüblichen Behältern, um Bedingungen zu trennen aufrechterhalten werden. Dies wäre nützlich für Experimente wie Stammzellenwachstumsmedien Entwicklung ^34,35,47, Substrat oder Kulturbedingung Prüfung und Toxizitätsstudien unter Verwendung von Stammzellen^51. Da jede Stammzelllinie ist in Bezug auf die optimale Koloniegröße und Durchgang Anforderungen einzigartig, kann man dieses System nutzen, um Aussaatdichte, Fütterung Frequenzgang und Handhabung durch die Manipulation der Spalten geerntet, die mechanische Bewegung während des Durchgangs und die Fütterung Frequenz zu modulieren. Durchlaufen dieser Variablen ermöglicht es dem Benutzer, eine Reihe von Bedingungen, die zur Kultur einer neuen Linie schnell zu finden oder neue Kulturtechniken. Das Robotersystem ist auch in der Lage ist die Aufrechterhaltung 96 parallel aber unabhängig Stammzellenkolonien. Wenn iPSC aus somatischen Zellen abgeleitet oder nach genetischer Manipulation kloniert werden viele parallel Klone gescreent, um potenzielle iPSC Linien ergeben. Sobald einzelne Zellen werden in 96-Well-Platten ausgesät, kann dieses System zu füttern und Durchgang der 96-Well-Platten halten jede Kolonie getrennt. Dies ermöglicht einen sehr hohen Durchsatz bei der Auswahl der potentiellen Klonen und beseitigt die Schwierigkeiten bei der Kultivierung von 96 körperlich parallelen Linien. Diese Methode auch einellows Produktion jedes Klons so skaliert, dass Material für die parallele Analyse ohne weiteres verfügbar ist. Schließlich stellen wir uns Integration dieser Kulturtechniken mit einer Roboter-Plattensystem, das Handels Platten zu und von den Inkubator ermöglicht vollautomatische Kultur liefert. Dies könnte mit komplexeren Robotik, die für eine größere Ausdehnung zu ermöglichen, da die hier beschriebenen grundlegenden Protokolle sind auf andere Platte basierte Systeme übertragbar erreicht werden.

Die ersten wichtigen Schritte, die in den Protokollen zu adressieren sind diejenigen, die verhindern, und überprüfen Sie die Verunreinigungen wie die Schritte 1.5 und 4.2. Verunreinigungen, wie oben erörtert, kann erfolgreich vermieden werden, wenn gute steriler Technik und gesundem Menschenverstand eingesetzt werden wird. Es ist zwingend notwendig, unabhängig von Stammzellkultur-Format, dass der Betreiber-Check für Kontamination und damit in diesem Protokoll an den angegebenen Schritte wird deutlich das Risiko für die Kontamination zu verringern. Proper extrazellulären Matrix-Gel-Anwendung ist eine zweite esszielle Schritt zum Erfolg dieses Protokolls. Ohne den 96-Well-Platten richtig Beschichten werden die Stammzellen nicht wachsen. Ein häufiges Problem ist unvollständig und Beschichtung. Die Erfahrung hat gezeigt, dass Luftblasen, elektrostatische Anziehung und Kapillarwirkung behindern auch komplette Beschichtung. Das Vornässen Schritt (1,6) entwickelt, um auch Seitenbeschichtung deutlich verbessern und sollte nicht übersprungen werden. Diese Vorbenetzung Schritt erscheint, um die scheinbare Hydrophobie des Kunststoff 96-Well-Platte, so daß zu reduzieren, wenn die extrazelluläre Matrix-Gel-Beschichtung aufgebracht wird gleichmäßig über den Boden und die Seiten gut verteilt. Es wird auch empfohlen, um leicht auf die 96-Lochplatten gegen eine saubere Hand einmal beschichtet, um auch extrazelluläre Matrix-Gel-Lösung Verteilung zu gewährleisten. Die Dissoziation Parameter sind auch wichtig, um zu optimieren. Erweiterte Inkubation mit Enzym oder EDTA basiert Dissoziation Reagenz wird in einzelnen Zellen, die möglicherweise nicht das Ziel während des Durchgangs werden die Folge sein. Daher der Betreibersollte besonderes Augenmerk auf wie Dissoziation Zeit, Verreiben Kraft und Wasch Wiederholungen beeinflussen Koloniemorphologie und Gesundheit und passen zu zahlen.

Das Verständnis der Beschränkungen in Bezug auf den hier beschriebenen Techniken sind ausschlaggebend für die erfolgreiche Operation. Wie in irgendeinem anderen Zellkultur-Einstellung, die Verwendung von 96-Well-Platten zeigt eine relativ hohe Kontaminationsgefahr. Wie oben beschrieben, ist ein Techniker Handhabungs jede Platte während der Zuführung und die Passage; beispielsweise beim Öffnen des Deckels, indem die Platte auf dem Roboter-Bett, und Prüfen der Platte auf dem Mikroskop. Daher ist, wie nach dem Schritt 1.5 erwähnt, ist es unerlässlich, die Innenseite jeder Platte Deckel nicht zu berühren oder aussetzen, diesen Teil zu einer potenziell kontaminierten Fläche wie die geneigte Heizblöcke oder vertikale Stifte auf dem Bett. Während der Protokollentwicklung wurde diese Einschränkung entdeckt und war der Anstoß, um eine Zahnstange, um Platte Deckel zu halten, um die Sterilität zu erhalten entwickeln. Ebenso sind die Trog Stauseen, Pipettenspitzen und other Lieferungen auf der Liquid-Handling-Roboter Bett sind potentielle Kontaminationsquellen, da sie offen für Umwelt und durch den Techniker behandelt sind. Daher sollten gute sterile Technik, die als Reduktionsbewegungen über ausgesetzt Kultur Materialien oder Flüssigkeiten offen angelegt, so werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass, wenn das Protokoll skaliert, visuelles Prüfen jedes gut> 100 96-Well-Platten ist umständlich. Dies kann mit durch Sichtkontrolle die ganze Platte auf Anzeichen von Kontamination, wie trüben Medien behandelt werden, um verdächtige Brunnen zu identifizieren. Für zukünftige Maßstab up wird die Verwendung eines automatisierten Mikroskop und Indikator für Zellwachstum und mögliche Verunreinigungen eingebracht werden.

Zusammenfassend ist die hier beschriebene Hochdurchsatz-96-Well-basierte Plattform bietet eine reproduzierbare, hohe Wiedergabetreue Verfahren zur Stammzellkultur und Produktion in einem Plattenformat. Dieses Verfahren reduziert die erforderliche Erfahrung, Ausrüstung notwendig und Arbeitszeit gewidmet Stammzellkultur, währenddie Aufrechterhaltung der Vorteile der traditionellen adhärenten Kultur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well-Platten	: Corning	3596	96-Well; Well-Volumen: 360  μ l; Zellwachstumsfläche: 0,32  cm2; Einzeln verpackter
Seahorse Trog	SeahorseBio	201308-100	Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips	Gilson	F167023	10 Racks Gilson 96 Tips D200 Tips
DMEM/F12	Life Technologies	12500062	DMEM/F12 Pulver. In 1 l gereinigtem Wasser in Zellkulturqualität und Sterilfilter resuspendieren.
Wachstumsfaktor reduziert Matrigel	Corning	354230	Wird im Text als "extrazelluläres Matrixgel" bezeichnet. Matrigel GFR, 10  ml
mTeSR1	StemCell Technologies	5857	mTeSR1 Komplettset für die hES-Erhaltung.
E8 Media	StemCell Technologies	5940	TeSR-E8 Kit für die hESC/hiPSC-Wartung
Y27632	AdooQ BioScience	A11001-50	Gesteinsinchinitor Y-27632 2HCI
Accutase	Innovative Cell Technologies	ACCUTASE	Wird im Text als "proteolytisches und kollagenolytisches Dissoziationsreagenz" bezeichnet. Accutase 500  ml sterile Zelllösung
PBS	Fisher SH30256FS		PBS ohne Ca Mg 500  ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX	Gilson	PIPETMAX	http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk