Anwendung der DNA-spezifisches Färbemittel, Methyl Green in der Fluoreszenzmarkierung von Embryos

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur Fluoreszenzfärbung von fixiertem biologischem Material mit der spezifischen DNA-Markierung Methylgrün beschrieben. Methylgrün wird in einer verdünnten wässrigen Lösung verwendet und ist sehr beständig gegen Photobleichung. Seine dunkelrote Emission ermöglicht die Bildgebung tiefer Proben und eignet sich daher besonders gut für ganze Embryonen.

Zusammenfassung

Methylgrün ist seit langem als histologischer Farbstoff mit einer spezifischen Affinität zur DNA bekannt, obwohl seine fluoreszierenden Eigenschaften bis vor kurzem unerforscht geblieben sind. In diesem Artikel veranschaulichen wir das Verfahren zur Herstellung einer methylgrünen wässrigen Stammlösung, die nach Verdünnung als sehr praktische fluoreszierende Kernmarkierung für fixierte Zellen und Gewebe verwendet werden kann. Einfache Verfahren zur Beschriftung ganzer Zebrafisch- und Kükenembryonen werden detailliert beschrieben, und Beispiele für erhaltene Bilder werden gezeigt. Methylgrün wird durch rotes Licht bei 633 nm maximal angeregt und emittiert mit einem relativ scharfen Spektrum, das bei 677 nm seinen Höhepunkt erreicht. Es ist sehr preiswert, ungiftig, sehr stabil in Lösung und sehr beständig gegen Photobleichung, wenn es an DNA gebunden ist. Seine rote Emission ermöglicht eine unveränderte, hochauflösende konfokale Rasterbildgebung von Zellkernen in dicken Proben. Schließlich ist dieses Methylgrün-Färbeprotokoll mit anderen Zellfärbeverfahren kompatibel, wie z. B. der Antikörpermarkierung oder der Markierung von Aktinfilamenten mit Fluorophor-konjugiertem Phalloidin.

Einleitung

Die Fluoreszenzfärbung von DNA wird sowohl in der biologischen Forschung als auch in der klinischen Diagnose weit verbreitet und routinemäßig eingesetzt, entweder für die detaillierte Untersuchung der Kern- und Chromosomenstruktur, für die Gegenfärbung von Geweben und Zellen oder für die Untersuchung von Zellzyklusparametern¹. Obwohl mehrere DNA-Färbungen verfügbar sind, sind die am weitesten verbreiteten diejenigen, die durch UV-Licht angeregt werden und in Blau emittieren, die in die üblichen Drei-Filter-Systeme passen, die in den meisten herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskopen verwendet werden, wenn sie mit grün und orange-rot emittierenden Fluorophoren kombiniert werden, wie z. B. fluoreszierenden Proteinen oder kleinen Molekülen, die an Antikörper gebunden sind. Unter diesen bläulich emittierenden DNA-Färbungen sind DAPI und Hoechst Minor Groove Binding Agents^{die häufigsten 2,3}. Nichtsdestotrotz hat die Einbeziehung einer Vielzahl von Laseremissionslinien und die spektrale Detektion in Laser-Scanning-Mikroskope es den Forschern ermöglicht, sich für die Verwendung von tiefrot emittierenden Kernfärbungen wie Propidiumiodid (PI) oder TO-PRO 3⁴ zu entscheiden. Ein Vorteil dieser Färbungen besteht darin, dass sie das Problem der Autofluoreszenz überwinden, das in vielen Zellen und Geweben zu finden ist, insbesondere bei Embryonen⁵, aber viele von ihnen haben unterschiedliche Probleme, wie z. B. breite Emissionsprofile oder eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Photobleiche⁶.

Der Schweizer Forscher Friedrich Miescher entdeckte 1869 die DNA, indem er sie aus den Kernen der weißen Blutkörperchen extrahierte, die im Eiter gefunden wurden. Er nannte es Nuclein und zeigte einige Jahre später, dass es Ausfällungen mit der relativ neuen Färbung Methylgrün bildete. Methylgrün besteht aus drei Anilinringen mit unterschiedlichem Methylierungsgrad und hat zwei positive Ladungen, die es ihm ermöglichen, stark an die Hauptrille der DNA^{zu binden 7,8}. Die DNA-Färbung durch Methylgrün erwies sich sehr früh als spezifisch, was dazu führte, dass Unna und Pappenheim eine kombinierte Färbung mit Pyronin entwickelten, das spezifisch RNA markiert. Methylgrün-Pyronin wird seitdem in großem Umfang in der histologischen Routinetechnik^{eingesetzt 9}.

Bis vor kurzem war sehr wenig über die fluoreszierenden Eigenschaften von Methylgrün bekannt. Unsere früheren Arbeiten haben jedoch einige der spektralen Vorteile von Methylgrün⁶ aufgedeckt, wie z. B. seine Anregung bei 633 nm, eine günstige Stokes-Verschiebung, seine Emission im nahen Infrarotbereich des elektromagnetischen Spektrums, eine höhere Photostabilität als kommerziell erhältliche DNA-Färbungen mit ähnlichen spektralen Eigenschaften und zu sehr geringen Kosten. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden, es für die Verwendung als sehr hochaffine und spezifische Fluoreszenzmarkierung für DNA auf embryonalen Geweben und in ganzen Embryonen zu testen. Darüber hinaus wurde die Methylgrün-Kernfärbung bisher bei niedrigem pH-Wert durchgeführt, was die Kombination mit der Antikörperfärbung erschwerte. Das Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist es, ein Protokoll für die Fluoreszenz-Kern-DNA-Färbung zu haben, das die oben genannten Unannehmlichkeiten überwindet, indem das Färbeverfahren bei physiologischem pH-Wert durchgeführt wird, wodurch es zu einer geeigneten Gegenfärbung für die Immunmarkierung von Schnitten und ganzen Geweben wird.

Protokoll

1. Reinigung des Dye

1. Bereiten Sie einen 4% igen wässrigen Lösung von Methylgrün durch Auflösen von 0,4 g Fleck Pulver in 10 ml destilliertem Wasser. Gründlich mischen, bis sie vollständig gelöst wird.
2. Unter einer Abzugshaube, mischen Sie es mit mindestens 2 Teilen Chloroform. Es ist wichtig, vorher zu prüfen, ob die Rohre sind Chloroform beständig.
3. Gründlich mischen und zentrifugieren für 1 min bei 2.000 xg um die Phasentrennung zu beschleunigen.
4. Nach dem Zentrifugieren eine obere wässrige Phase mit Methyl-grün und eine untere organische Phase mit Chloroform und die üblichen Schadstoffkristallviolett erhalten.
5. Wiederherstellen der oberen Phase, und wiederholen Sie diesen Schritt, bis untere Phase völlig frei von Kristallviolett wird angezeigt.
6. Am Ende wird die obere Phase abgetrennt und in Wasser auf eine Endkonzentration von 2% Methylgrün verdünnt. Diese Stammlösung ist auf der Werkbank über Monate stabil ist und nicht den Inhalt vor Licht geschützt werden müssen.

2. Fluorescent Kernfärbung von Whole Zebrafischembryonen mit Methylgrün

1. Fixieren die Embryonen über Nacht in 4% Formaldehyd (aus Paraformaldehyd) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
   HINWEIS: Das kann von ein paar Stunden, um über Nacht abhängig von der Dicke der Embryonen. In dem Beispiel fest wir 48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) Zebrafischembryonen über Nacht.
2. Dreimal 5 min waschen die Embryonen in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS). Die erhöhte Konzentration des Reinigungsmittels permeabel die Nagelhaut.
3. Bereiten Sie eine 1: 5,000-1: 10.000 Lösung von Methyl-grün (2% Stammlösung) in PBS-T. Die Gegenwart von Detergens während der Inkubation ist nützlich für dicke Proben, wie Zebrafischembryonen und Larven.
4. Die Embryonen in der Lösung für mindestens 6 h Inkubation bei 4ºC unter leichtem Schütteln. Auch die Dicke des Embryos ist die Kalibrierparameter für die Dauer der Inkubationszeit.
5. Waschen Sie die Embryonen 3 times mit PBS für 30 min, um die Reinigungsmittelüberschuß zu entfernen. Methyl grüne Fluoreszenz ist nur offensichtlich, wenn die DNA gebunden ist, zu vernachlässigen ist somit Hintergrund von dem ungebundenen Molekül.
6. Berg auf einem ausgegrabenen Dia oder einem hausgemachten Kammer mit Montagelösung (75% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
   HINWEIS: Wenn die Kernfärbung ist es, nach Immunmarkierung durchgeführt werden, kann Methylgrün an der Montagelösung in der Arbeitskonzentration eingebracht werden, ohne die Notwendigkeit, es abzuwaschen.
7. Einer Lagerung oder starten Bildgebung sofort. Führen Bildgebung mit einem konfokalen Laserraster (oder andere Fluoreszenz) Mikroskop mit einer Anregung bei 633 nm und Emissionsfilter eingestellt, um bei 650 bis 750 nm unter Berücksichtigung, dass grüne Emission sein Maximum bei 677 nm erreicht Methyl registrieren.
   Anmerkung: Wir stellen die Messdaten des Methylgrün Emissionsprofil, in das Erfassungssoftware geladen werden, als Zusatzmaterial.

3. Fluorescent Nuclear Staining von Whole Hühnerembryonen mit Methylgrün

1. Befruchtete Hühnereier Inkubieren auf die Bühne von Interesse. Befestigen Sie die Embryonen über Nacht in 4% Formaldehyd (von Paraformaldehyd) in PBS bei 4 ° C. Waschen Embryonen 3 mal in PBS-T für 2 Std.
2. Bereiten Sie eine 1: 5,000-1: 10.000 Lösung von Methyl-grün (2% Stammlösung) in PBS-T. Die Embryonen in der Färbungslösung beimpft und über Nacht bei 4 ° C. 3 mal in PBS, jeweils 1 Stunde Waschen Sie die Embryonen. Berg in der Kammer mit 75% Glycerin, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging fluoreszierend markierten Zellkerne in Whole-montiert Embryos

1. Bereiten Sie eine Imaging-Kammer durch Kleben mehreren Lagen Isolierband über einen Objektträger und vorsichtig ein Loch in sie mit einem Skalpell, um die Embryonen im Rahmen zu platzieren. Dies wird Embryonen aus Brechen während der Bilderzeugung zu verhindern.
2. Die Embryonen vorsichtig in die Abbildungskammer und füllt die Kammer bis zum Rand mit 75% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8, um eineLeere Blasenbildung.
3. Deckel mit einem # 0 Deck Vermeidung oder Beseitigung von überquellenden Medium. Verschließen Sie diese mit Nagellack.
4. Erwerben Bilder der Probe auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Anregungsfilter 633 bzw. Laserlinie ausgestattet.
   HINWEIS: Emissionsfilter sollten die 677 Emissionsmaximum von Methylgrün decken.

Ergebnisse

Kernfärbung von dicken Proben. Das Protokoll beschrieben gestattet das Erreichen einer homogenen Färbung von tiefen Strukturen in ganzen Embryonen. Entwicklungslinsenkerne Form 48 HPF Zebrafischembryonen homogen markiert (Abbildung 1).

Methylgrün DNA-Färbung erlaubt die Unterscheidung von Zellzyklus-abhängigen morphologischen Unterschiede, wie beispielsweise die Identifizierung von Mitosen oder apoptotischen Kernen (2A). Subnuklearen Strukturen mit hoher Auf...

Diskussion

Die fortschreitende Entwicklung der Mikroskopietechniken in den letzten Jahrzehnten, mit besonderem Schwerpunkt auf Variationen der Fluoreszenzmikroskopie, hat dazu geführt, dass die Dynamik und Struktur intakter Gewebeproben, einschließlich ganzer Embryonen, erforscht werden^{kann 10,11}. Eine große Einschränkung war jedoch die Verfügbarkeit von Fluorophoren von guter Qualität, die zur direkten und schnellen Färbung subzellulärer Strukturen verwendet werden können.

Die am häufigsten ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glycerin	Sigma-Aldrich	G5516
Methylgrün	Dr. G. Grü bler		Getestet auch Sigma-Aldrich 323829, das kristallviolettfrei ist
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin– Tetramethylrhodamin B-Isothiocyanat	Sigma-Aldrich	P1951
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Zentrifuge 5810 R	eppendorf	5811 000.010
Objektträger	Deltalab	D100004
Deckgläser	Esco optics	R525025