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Methodenartikel

Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik

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DOI:

10.3791/52782

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3. Mai 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Transporter in Zellmembranen ermöglichen die differentielle Segregation von Ionen über Zellmembranen oder Zellschichten hinweg und spielen eine entscheidende Rolle bei der Physiologie, Reparatur und Pathologie des Gewebes. Wir beschreiben die ionenselektive selbstreferenzierende Mikroelektrode, die die Messung spezifischer Ionenflüsse an einzelnen Zellen und Geweben in vivo ermöglicht.

Zusammenfassung

Zellen von Tieren, Pflanzen und Einzelzellen durch eine Barriere genannt Zellmembran in das Cytoplasma von außen trennt umschlossen. Zellschichten wie Epithelien bilden ebenfalls eine Barriere, die von außen nach innen oder verschiedenen Kompartimenten mehrzelligen Organismen trennt. Ein Schlüsselmerkmal dieser Hindernisse ist die differentielle Verteilung der Ionen über die Zellmembranen oder Zellschichten. Zwei Eigenschaften erlauben diese Verteilung: 1) Membranen und Epithelien zeigen selektive Permeabilität auf bestimmte Ionen; 2) Ionen werden durch Pumpen durch die Zellmembranen und Zellschichten transportiert. Diese Eigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebephysiologie und fungieren als Signal Hinweise nach der Beschädigung während der Reparatur oder unter pathologischen Zustand. Die ionenselektive selbst verweisMikroElektrode ermöglicht Messungen bestimmter Flüsse von Ionen, wie Calcium, Kalium oder Natrium auf Einzelzell und Gewebespiegel. Die Mikroelektrode enthält ein Ionophor Cocktail, der istselektiv durchlässig, um eine bestimmte Ion. Die interne Fülllösung enthält eine Reihe Konzentration des Ions von Interesse. Das elektrische Potential der Mikroelektrode wird durch die Außen Konzentration des Ions bestimmt. Da die Ionenkonzentration variiert, ändert sich das Potential der Mikroelektrode in Abhängigkeit von dem Logarithmus der Ionenaktivität. Wenn vor und zurück in der Nähe einer Quelle oder Senke des Ions (dh in einem Konzentrationsgradienten aufgrund Ionenfluß) bewegt die Mikroelektrodenpotential schwankt mit einer Amplitude proportional zu der Ionenfluss / Steigung. Der Verstärker verstärkt das Mikroelektrodensignal und das Ausgangssignal wird auf dem Rechner aufgezeichnet. Ionenflusses kann dann durch Fickschen Diffusionsgesetz unter Verwendung der Elektrode Potentialschwankung, die Auslenkung der Mikroelektrode und andere Parameter, wie die spezifische Ionenmobilitäts berechnet werden. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail das Verfahren zur Berechnung der extrazellulären Ionenflüsse zu messen unter Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektrode eind präsentieren einige repräsentative Ergebnisse.

Einleitung

Alle Tierzellen sind durch eine Lipiddoppelschicht-Membran, die das Zytoplasma von der äußeren Umgebung trennt umgeben. Die Zelle hält einen elektrischen Membranpotentials negativ innen, durch aktiven Transport von Ionen 1. Das Membranpotential ist eine gespeicherte Energiequelle, die die Zelle zu verwenden, um verschiedene molekulare Vorrichtungen in der Membran 2 zu betreiben. Neuronen und anderen erregbaren Zellen verfügen über große Membranpotentialen. Schnelles Öffnen von Natriumkanälen kollabiert das Membranpotential (Depolarisation) und erzeugt das Aktionspotential, das entlang der Länge des Neurons 2 transportiert wird. Abgesehen von diesen schnellen elektrischen Veränderungen, viele Gewebe und Organe erzeugen und aufrechtzuerhalten signifikante langfristige elektrische Potentiale. Zum Beispiel, Haut und Hornhaut-Epithel erzeugen und aufrechtzuerhalten transepitheliale Potenziale und extrazelluläre elektrische Ströme durch gerichtetes Pumpen von Ionen (vor allem Natrium und Chlorid) 3.

Zelt "> Während Messungen von endogenem extrazellulären elektrischen Strom unter Verwendung des vibrierenden Sonde 4-6 und Messungen der Membran oder transepithelialen Potentiale mit der Mikroelektrodensystem 7-10 ermöglichen die Messung der elektrischen Parameter der Zellmembranen und epithelialen Zellschichten, geben sie keinen Angabe der beteiligten Ionenspezies.

Mikroelektroden mit selektive Ionophor können bestimmte Ionenkonzentration in der Lösung zu messen. Ionengradienten oder Flußmittel könnte mit zwei oder mehr Elektroden, die an verschiedenen Positionen gemessen werden. Jedoch würde die intrinsische Spannungsdrift jeder Sonde unterschiedlich sein, was zu ungenauen Messungen oder Detektion eines Gradienten, der nicht vorhanden war. Eine einzelne Elektrode in "selbstverweis" -Modus verwendet werden, wobei es bei niedrigen Frequenzen bewegt zwischen zwei Punkten löst dieses Problem. Nun ist die Ionenfluss kann vor dem Hintergrund einer relativ langsamen und stabilen Signaldrift zu sehen ist (siehe 3B).

Die ionensensitiven Messsystem verwendet ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden auf kleine extrazellulären Flüsse von Ionen in der Nähe von Gewebe oder einzelne Zellen zu erkennen. Das System besteht aus einem Verstärker, der das Signal von der Mikroelektrode und einem Mikro-Schrittmotor und Treiber, um die Bewegung des Mikrokontrollverfahren. Die ionenselektive Mikroelektroden und die Referenzelektrode, die den Stromkreis zu schließen sind, um den Verstärker über einen heads Vorverstärker (1A) verbunden ist. Computer-Software bestimmt, welche Parameter der Mikrobewegung (Frequenz, Entfernung) und zeichnet den Ausgang des Verstärkers. Der Schrittmotor steuert die Mikrobewegung über eine dreidimensionale Mikropositionierers. Ein Niederfrequenzvibrationsionenselektive Mikroelektroden wurde erstmals 1990 entwickelt, die spezielle Calciumfluss 11 zu messen. Sowie Calcium, sind kommerziell zugänglich Ionophor Cocktails jetzt für MICR machenoelectrodes empfindlich Natrium, Chlorid, Kalium, Wasserstoff, Magnesium, Nitrat, Ammonium, Fluorid, Lithium oder Quecksilber.

Grundsätzlich wandelt das selbst verweisende ionenselektive Mikroelektroden-Technik die Aktivität eines spezifischen Ions in einer Lösung gelöst, in ein elektrisches Potential, das von einem Voltmeter gemessen werden kann. Das Ionophor Cocktail ist eine nicht mischbare Flüssigkeit (organisch lipophile Phase) mit Ionenaustauscheigenschaften. Das Ionophor selektiv Komplexe (bindet) spezifische Ionen reversibel und überträgt sie zwischen der in der Mikroelektrode (Elektrolyt) enthaltenen wässrigen Lösung und der wässrigen Lösung, in der die Mikroelektrode eingetaucht ist (Figur 1D). Diese Ionentransfer führt zu einer elektrochemischen Gleichgewichts und eine Änderung des elektrischen Potentials zwischen der Mikroelektrode und der Referenzelektrode wird durch das Voltmeter gemessen. Die Spannung ist proportional zu dem Logarithmus der spezifischen Ionenaktivität nach der Nernst equation ermöglicht die Berechnung der Ionenkonzentration (2A und B).

Derzeit mehrere Systeme ermöglichen die Messung von Ionenfluss mit einem ähnlichen Konzept oder Prinzip. Zum Beispiel kann die Scanning ionenselektive Elektrode Technique (SIET) 12,13 oder der Mikroelektrode Ion Flux Estimation (MIFE) Technik, die von Newman und Shabala 14-16 entwickelt sind im Handel erhältlich und weit von der Forschungsgemeinschaft, um bestimmte Ionen zu bestimmen Flüsse an Zellmembran und Gewebe vorkommenden in einer Vielzahl von Tieren, Pflanzen und einzelnen lebenden Zellmodellen. Ionenselektive Mikroelektroden wurden verwendet, um Wasserstoff, Kalium- und Calciumflusses über die Pflanzenwurzeln 17, Chlorid Flussmittel in Ratten zu messen Hirnarterien 18 und in Pollenschläuchen 19, Wasserstofffluss in Skate Retinazellen 20, Calcium-Fluss in Mausknochen 21, verschiedene Ionen Flüsse in Pilzhyphen 22 und in rbei Hornhaut 23 und schließlich Calciumfluss während der einzelnen Zelle Wundheilung 12,24. Siehe auch die folgende Rezension für detaillierte Informationen über ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden 25.

Der folgende Artikel beschreibt im Detail, wie die Vorbereitung und durchführen Messung der endogenen extrazellulären Ionenflüsse mit der ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden-Technik auf Einzelzellebene.

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Protokoll

1. Ionenselektive selbst verweisende Mikroelektroden-Vorbereitung

  1. Herstellung von ionenselektiven Mikro
    1. Wärme dünnwandigen Borosilikatglas Kapillaren zu ziehen, ohne Filament (1,5 mm Außendurchmesser, 1,12 mm Innendurchmesser) mit einem Mikroelektroden-Abzieher.
      Hinweis: Diese gibt Tipps 3-4 & mgr; m im Durchmesser. Kleinere Spitzen haben höhere Widerstand, der Mikroelektroden anfälliger für elektronisches Rauschen macht und ist auch mit einer langsameren Reaktion auf eine Änderung in der Ionenkonzentration verbunden. Nützliche Informationen finden Sie in dem von Smith et al. 26 veröffentlichte Papier gefunden werden.
    2. Silanisiert werden die Elektroden, die Innenfläche hydrophobe Retention des lipophilen lonophor Cocktail Hilfe zu leisten. Platzieren der Mikroelektroden in einem Metallgestell und Wärme O / N in einem Ofen bei> 100 ° C zu trocknen. Die Zahnstange ist eine Metallplatte mit 2 mm Durchmesser Bohrungen einen Teil des Weges durch. Platzieren Sie die Elektroden in die Löcher Spitze nach oben mit einem 250 ml glass Becher über sie.
    3. Am Morgen, schalten Sie den Backofen ausschalten und während isolierte Handschuhe tragen, entfernen Sie vorsichtig die Metallgestell mit den Elektroden und Becher in Position. Schließen Sie die Ofentür, um die Wärme zu halten.
    4. Anlegen von Latex oder Nitril Handschuhe, Kittel und Schutzbrille. Mit einem Kunststoff-Pasteurpipette einen Tropfen Silanisierung Lösung, die ich an der Basis jeder Elektrode (halten den Becher in Ort, verwenden Sie den Ausguss für Pipettenzugang). Die Silanisierung Lösung durch die Heizplatte verdampft und silanizes die Innenseite der Elektroden. Verwenden Sie einen chemischen Dunstabzugshaube für diese Stufe. Platzieren Sie die Zahnstange / Becher / Elektroden wieder in den heißen Ofen für ein paar Stunden, damit der verbleibende Silanisierung Lösung zu verdampfen.
      Hinweis: Aus Sicherheitsgründen nicht drehen Sie den Ofen wieder ein. Legen Sie ein Etikett auf dem Ofen anzeigt, muss nicht eingeschaltet werden, da es schädlich und entzündbare Dämpfe enthalten.
    5. Nach dem Abkühlen, speichern Sie die Mikroelektroden in einem Mikroelektroden-Vorratsglas inside ein Glas Exsikkator mit 400 g Trockenmittel. Mikroelektroden kann somit für viele Wochen gelagert werden.
      Hinweis: Eine alternative Methode der Silanisierung ist in Smith et al 26.
    6. Zutückgeben die Mikroelektrode mit 50 bis 100 ul (eine Länge von etwa 1 cm) einer Lösung, die 100 mM des Ions gemessen werden (siehe Tabelle 1 und 1B). Verwenden Sie eine Einweg-Kunststoff-Pasteurpipette Wärme in einem Bunsenbrenner zog zu einem feinen Faden. Spülen Sie die Pipette in dH 2 O danach zur Verstopfung zu verhindern.
      Hinweis: Alternativ Einstellen der Ionenkonzentration der Verfüllung Lösung, die Konzentration der Ionen in der externen Lösung 27 entsprechen.
    7. Beachten Sie die Mikroelektrode unter einem Binokular, um die Abwesenheit von Luftblasen sicherzustellen.
      1. Wenn Luftblasen vorhanden sind, tippen Sie auf die Mikroelektrode leicht mit einem Fingernagel, während die Elektrode senkrecht halten (Spitze nach unten) und / oder drücken Sie die Blases die Spitze, indem Gegendruck unter Verwendung einer Spritze mit einem Silikonschlauch Auswechseln der Nadel geändert.
    8. Tip-füllen die Mikroelektrode mit 15 bis 20 nl (eine Länge von 30-50 um) der ionenspezifischen Ionophor-Cocktail (siehe Tabelle 1). Setzen Sie einen kleinen Tropfen der Ionophor-Cocktail an der kurzen Seite eines Objektträgers. Beachten Sie die Mikroelektrodenspitze unter einem Binokular und verschieben Sie sie in Richtung der Objektträger, bis der Mikroelektrodenspitze das Ionophor Cocktail berührt nur etwa eine halbe Sekunde. Zeichnen Sie das Ionophor Cocktail in der Mikroelektrode durch Kapillardruck.
      Hinweis: Vermeiden Sie eine lange Kolonne von Ionophor Cocktail, da dies erhöht die elektrische Widerstand der Sonde die sie anfällig für elektronische Störungen (Rauschen) machen können und verlangsamt auch die Reaktionszeit.
    9. Montieren Sie die Mikroelektrode in einer geraden Mikroelektrodenhalter mit einem gold 1 mm Stecker und AgCl (Ag +) Draht (1B).
    10. Bringen Sie den Mikroelektrodenhalter auf den Kopf der Bühne auf einem dreidimensionalen computergesteuerten elektronischen Mikropositionierer (Abbildung 1A) montiert.
    11. Setzen Sie den Mikroelektrodenspitze in Messlösung angemessen, dass die zu messende Probe (physiologische Kochsalzlösung, Kulturmedium, etc.), damit der Mikroelektroden, für eine oder zwei, oder sogar über Nacht hr stabilisieren.
  2. Herstellung der Referenzelektrode
    1. Referenzelektroden (1C) sind die gleichen wie oben Kapillaren. Schneiden Sie die Kapillare mit einem Diamantstift in 5 cm Länge und an jedem Ende für 1-2 sec in einer Bunsenflamme feuerpoliert.
    2. Füllen dieser Elektroden mit ~ 200 & mgr; l einer 3 M Lösung von NaCl, CH 3 CO 2 K (Kaliumacetat) oder KCl mit 2% Agarose ist. Wählen Sie die Lösung in Abhängigkeit von der zu messenden Ions (der Bezugselektrode nicht den Ionen gemessen enthalten, siehe Tabelle 1). Mischendie Agarose und die Lösung und Wärme fast Kochen in der Mikrowelle. Rühren Sie die Agarose aufzulösen (die Lösung geht klar).
    3. Befestigen Sie die Referenzelektrode auf einem Kunststoffpasteurpipette und zeichnen Sie die heiße Lösung in die Kapillare.
    4. Löschen Sie die Elektrode in kaltem 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K oder KCl-Lösung und speichern Sie in diesem 3-M-Lösung in verschlossenen Röhrchen vor der Verwendung. Entsorgen Sie alle Referenzelektroden mit Luftblasen.
    5. Montieren Sie die Referenzelektrode in einer geraden Mikroelektrodenhalter (vorgefüllt mit 3 M Lösung) mit einem AgCl (Ag +) Pellet im Inneren und eine Gold 2 mm-Stecker (1C) und befestigen Sie die Elektrode und den Halter an einer manuellen Mikrostellungs auf einem Magnetständer montiert.

2. Ionenselektive selbst verweisende Mikroelektroden-Kalibrierung

  1. Vorbereiten der Kalibrierung Lösungen, die die Ionen von Interesse als in der Referenzlösung; siehe Tabelle 1 . Halterung Die Konzentration, die in der Lösung wird die Probe in (zB Kulturmedien, physiologische Kochsalzlösung) ist. Das heißt, eine Kalibrierungslösung muß eine niedrigere Ionenkonzentration als in der Messlösung enthalten, und eine höher.
    1. Verwenden Sie beispielsweise Kochsalzlösung, die 1 mM K + enthält. Um diese Konzentration einklammern auflösen KCl-Pulver in entionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 10, 1 und 0,1 mM in seriellen Verdünnungen. Verwenden Sie diese Kalibrierungslösungen. Alternativ können mindestens zwei dieser Lösungen.
  2. Tauchen Sie die ionenselektiven Mikroelektroden und der Referenzelektrode in die Eichlösungen und lassen Sie den Spannungswert für 1 bis 3 Minuten stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung mit Hilfe der speziellen Software (siehe Tabelle 1).
  3. Da die Software speichert die Daten (Verstärkerausgang) als txt-Datei, kopieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei. Zur Erstellung der Mikroelektrodenausgang (mV) gegen den Logarithmusdas molare Ionenkonzentration (2A).
  4. Tragen Sie eine lineare Regression und berechnen die Nernst-Steilheit, abfangen und R 2 Wert. Übernehmen Sie die Mikroelektrode, wenn die Nernst-Steilheit ist 58 ± 11 mV / Dekade für einwertige Ionen und 29 ± 11 mV / Dekade für zweiwertige Ionen (Kationen ist die Nernst-Steilheit positiv, für Anionen ist negativ). Darüber hinaus sollten gute Mikroelektroden haben eine starke lineare Korrelation (R 2> 0,9; 2B).
    Hinweis: Das mV Ausgang des Verstärkers verwendet hier gibt mV Lesung mit einem zehnfachen Gewinn. Werte um einen Faktor zehn geteilt werden.
  5. Verwenden Sie die lineare Regression Formel, um die rohen mV-Ausgang der Mikroelektrode in tatsächliche Ionenkonzentration (2B) zu konvertieren.

3. Die Validierung der ionenselektiven Mikroelektroden-Technik

  1. Herstellung eines künstlichen Quelle
    1. Künstlichen Quelle Kapillaren sind die gleichen wie Kapillarenüber. Hitze ziehen die Kapillare mit einer Mikroelektrode Puller, wie in Schritt 1.1.1.
    2. Verfüllen diese Kapillaren mit 200 ul einer 1 M Lösung von NaCl, KCl, CaCl 2 2 H 2 O oder pH 4 Puffer. Wählen Sie das künstliche Source-Lösung in Abhängigkeit von der zu messenden Ionen (siehe Tabelle 1).
      Hinweis: Alternativ können Elektroden mit größeren Spitzendurchmesser (~ 20 & mgr; m) und ziehen Spitze seitig mit den gleichen Lösungen, sondern enthält 0,5-1% Agarose (Agarose wird jeden Großlösungsstrom zu verhindern).
    3. Montieren Sie den künstlichen Quelle Kapillare auf einem Mikromanipulator und tauchen sie in die verwendet werden, um den Fluss der Ionen in den Proben zu messen Lösung. Verlassen die künstliche Lichtquelle in der Lösung für 30 min bis 1 h, um eine Stabilisierung des Gradienten zu ermöglichen.
  2. Validierung der ionenselektiven Mikro
    1. Eintauchen der ionenselektive Mikroelektroden etwa einen Zentimeter entfernt von der künstlichen Quelle Kapillare in der Lösung verwendet, diese Maßere der Fluss von Ionen an den Proben und schließen Sie die Schaltung mit der Bezugselektrode wie zuvor. Ließ sich der Spannungswert für 1-3 min stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung über das dedizierte Software für 1 bis 2 min. Dieser Wert entspricht der Pufferwert (in der Literatur auch als Referenz, Hintergrund oder Blindwert bezeichnet).
    2. Bewegen Sie den ionenselektiven Mikroelektroden bis etwa 5 um von der künstlichen Quelle und lassen Sie den Spannungswert für 1 bis 3 Minuten stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung mit Hilfe der Software für 1 bis 2 min.
    3. Das obige Verfahren wird durch Anordnen des ionenselektive Mikroelektroden 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 und 1280 & mgr; m entfernt von der künstlichen Quelle Kapillare.
    4. Extrahieren Sie die Daten als txt-Datei und kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei.
  3. Berechnung der Ionenkonzentration entsprechend den mV Werte in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungswerte. Zeichnen Sie den Wert.
    Neinte: Wird ein Ionenfluss vorhanden ist, erkennt der Mikroelektrode einen Unterschied in der Ionenkonzentration zwischen den zwei Positionen (3B). Wenn die künstlichen Quelle enthält mehr Ionen der gemessen wird, als die Lösung Arten sollte die Konzentration höher ist nahe an der Quelle als weit entfernt sein, die Validierung der Fähigkeit des ionenselektive Mikroelektroden, die Richtung eines Ionenflusses korrekt zu erfassen (in diesem Fall Auslauf; für eine künstliche Waschbecken, mit geringeren spezifischen Ionenkonzentration als Messmedium, sollte Zustrom sein).
    1. Berechnen Sie den Ionenfluss mit Fickschen Diffusionsgesetz: J = c μ (dc / dx) wobei c die Ionenkonzentration in der Lösung (mol cm -3), μ ist die Ionenmobilität (mol cm N -1 s -1) und dc die Konzentrationsdifferenz über den Abstand dx (cm) (2C). Ionenfluss-Daten werden in der Regel in pmol cm -2 s vorgestellt-1 Oder nmol cm -2 s -1.
      Anmerkung:.. Eine alternative Methode der von Smith et al 26 beschriebene Ionenstromberechnung verwendet werden. Hauptunterschiede sind die Verwendung des Diffusionskoeffizienten anstelle der Ionenmobilität und die Subtraktion der Hintergrundionenflusses (auch Spannungsdrift oder Korrekturfaktor) aus der Messung des Ionenflusses in Kochsalzlösung ohne Probe berechnet.
    2. Plotten der Mittelwert der Ionenflüsse jeder Stufe gegenüber dem Abstand von der Quelle (2D). Weg von der Quelle zu beobachten eine exponentielle Abnahme der Flusswert Validierung der Fähigkeit des ionenselektive Mikroelektroden auf unterschiedliche Größe der Ionenflüsse zu erfassen.
    3. Haben die künstlichen Quelle Validierungs einmal für jeden spezifischen Ions soll, um die korrekte Richtung und Größe Messungen mit einem großen Signal-zu-n validieren aufzuzeichnendenoise-Verhältnis.
      Hinweis: Ion Flussmessung des Puffers ohne Proben gibt die Hintergrundebene oder Lärm. Typischerweise Puffer Messung keine deutlichen Schwankungen der Ionenkonzentration, die zu sehr kleinen Fluß, der unterschiedlichen Richtungen zeigt.

4. Vorbereitung der Messkammer

Hinweis: Vor dem Versuchen, sollten die zu messende Probe und wie die Probe zu befestigen und die Mikroelektroden immobilisiert werden.

  1. Für Xenopus laevis Oozyten Messungen schneiden Sie ein 1 cm Quadrat einer 800 & mgr; m Nylon-Mesh (Nitex mesh) und kleben Sie es in eine Kunststoff-Petrischale (1E).

5. Ion Flussmessung

  1. Messung der Ionenkonzentration in dem Puffer verwendet, um die Messungen auf der Probe in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungslösung auszuführen vorhanden. X. laevis Oozyten benötigen Marks Modifizierte Ringer (MMR). D100 NaCl, 2 KCl, CaCl 2, 1 MgCl und 5 HEPES: issolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl und HEPES in deionisiertem Wasser auf eine Endkonzentration (mM) zu erreichen. Den pH-Wert des Puffers auf 7,5 mit NaOH.
  2. Legen Sie die Probe in die Messkammer und bringen die ionenselektiven Mikroelektroden in der Nähe der Probe (etwa 10 & mgr; m entfernt) mit der Mikropositionierer in die geschlossene Position der Mikroelektrode (3A) zu definieren.
  3. Starten Sie den niedrigen Frequenz (0,3 Hz) Ausflug (100 um) der Mikroelektrode zwischen der geschlossenen Position und einer Position weg von der Probe (fernen) unter Verwendung der speziellen Software. Sicherzustellen, dass die Bewegung der Mikroelektrode senkrecht zur Oberfläche der Probe.
    Hinweis: Der Ausflug der Mikroelektrode kann über die Software eingestellt werden. Große Auslenkung nimmt die Steigung zu lesen erlaubt eine einfachere Erkennung kleiner Flüsse während der Messung, während verlängert die Abtastzeit, und verringert die Zeitauflösung. Sehen 3A ein Beispiel.
  4. Starten Sie die Aufnahme mit Hilfe der Software. Die Mikroelektrode Pausen bei jeder Position und das elektrische Potential in mV auf dem Computer aufgezeichnet. Erhalten Sie Messungen für mindestens 2 min, wodurch Signalstabilisierung. Bei kurzen Zeitraffer-Experimente, Plattenpotentialänderungen an der Stelle von Interesse für den gesamten Zeitverlauf.
  5. Extrahieren Sie die Daten als txt-Datei und kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei.
  6. Berechnung der Ionenkonzentration entsprechend den mV Werte in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungswerte. Zeichnen Sie den Wert.
    Hinweis: Wenn ein Ionenfluss vorhanden ist, erkennt der Mikroelektrode einen Unterschied in der Ionenkonzentration zwischen den zwei Positionen (3B).
  7. Berechnung der Ionenfluss mittels Fickschen Diffusionsgesetz wie zuvor (Schritt 3.3.1).
  8. Wiederholen Sie den Messpuffer vor der Messung einer neuen Probe und wiederholen Sie die Prozedur des Flussmessung und die Berechnung für jedes neueProbe.

6. Statistische Analyse und Datenpräsentation

  1. Testen Sie die unabhängige Wirkung der Position und / oder der Zeit auf Ionenflüsse unter der Kontrolle Zustand mit Hilfe eines ANCOVA-Modell mit gemischten Effekten 28.
    Hinweis: Kovarianzanalyse (ANCOVA) ist eine allgemeine lineare Modell, dass ein normales ANOVA und Regressions mischt, indem sowohl kategorische und kontinuierliche Maßnahmen, um als unabhängige Variable verwendet werden. Zusätzlich wird in der Gegenwart von korrelierten Fehler von wiederholten Messungen pro Individuum und eventuelle verschachtelte Effekte induziert werden gemischte Wirkungen Modelle verwendet werden, um genaue Schätzungen der festen als auch zufällige Effekte zu modellieren.
  2. Berechnen Sie paarweise Vergleiche mit Student t -Test zwischen Gruppenebene mit Bonferroni-Korrektur für multiples Testen 28.
  3. Erzeugen Boxplots zum Ionenfluß Messungen nach Position und Zeit zusammenzufassen. Schließen p-Werte von der beschriebenen paarweisen Student toben (Figur 3D) und bestimmen Signifikanzniveaus von p-Werte wie folgt: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0.001 29

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Ergebnisse

Wir haben bereits gezeigt, dass Calcium-Einstrom erscheint nach Einzelzelle Verwundung 24. Wir haben daher die Frage, ob andere Ionenflüsse auf Einzelzell Verwundung auftritt. Wir haben das X. laevis Oozyten, ein gut etabliertes Modell für einzelne Zelle die Wundheilung 30-34 und elektrophysiologische Ableitung 24,35-39. Interessanterweise sind Kaliumionen mehr in X. konzentrierten laevis Oozyten (ca. 110 mM) 40 als in der extrazellulären Lösung verw...

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Diskussion

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Messung der extrazellulären Ionenflüsse in vivo sind: die Verringerung der Geräusche, die korrekte Herstellung des ionenselektive Mikroelektroden und die Referenzelektrode und die Positionierung der Probe und den beiden Elektroden.

Um den Lärm zu minimieren, sollte das Aufzeichnungssystem in einem geerdeten (geerdet) Faraday-Käfig, vorzugsweise mit einem Metall-Spitze (Schwingungsisolation) Tabelle, die ebenfalls geerdet ist, sein. Darü...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Stipendium MCB-0951199 der National Science Foundation und teilweise durch das NIH-Stipendium EY01910, das California Institute of Regenerative Medicine (Stipendium RB1-01417) und das Stipendium der Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) SFRH/BD/87256/2012.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
IonenAmp   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAohneVerstärker, entwickelt vom BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Ein ähnliches System kann erworben werden bei " Die XBL-Funktion ist wichtig" (http://www.xuyue.org/) oder von " Jüngere USA" (http://www.youngerusa.com/) oder von Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/
)IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAkeineSoftware, die vom BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA, entwickelt wurde; Ein ähnliches System kann erworben werden bei " Die XBL-Funktion ist wichtig" (http://www.xuyue.org/) oder von " Jüngere USA" (http://www.youngerusa.com/) oder von der anwendbaren Elektronik(http://www.applicableelectronics.com/)
Vorverstärker der Kopfstufe  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAINA116BSR Voltage Follower INA116, entworfen vom BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Ein ähnliches System kann erworben werden bei " Die XBL-Funktion ist wichtig" (http://www.xuyue.org/) oder von " Jüngere USA" (http://www.youngerusa.com/) oder von der anwendbaren Elektronik (http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep-Treiber  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAkeinedrei MicroStep-Treiber sind für die X-, Y- und Z-Positionierung erforderlich; entwickelt vom BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Ein ähnliches System kann erworben werden bei " Die XBL-Funktion ist wichtig" (http://www.xuyue.org/) oder von " Jüngere USA" (http://www.youngerusa.com/) oder von der anwendbaren Elektronik (http://www.applicableelectronics.com/)
Manueller Mikropositionierer   World Precision Instruments Modell KITE-REin ähnliches System kann erworben werden bei Applicable Electronics (http://www.applicableelectronics.com/
)Magnetischer Ständer     World Precision InstrumentsModell M10Ein ähnliches System kann erworben werden bei Applicable Electronics (http://www.applicableelectronics.com/
)Schwingungsisolationstabelle   Newport Inc.         Modell VW-3036-OPT-023040Ähnliches System kann erworben werden von Applicable Electronics (http://www.applicableelectronics.com/
)Teil von drei maßigen Mikropositionierern: Winkelhalterung, 90°, geschlitzte FlächenNewport Inc.         Modell 360-90Die Montage des dreidimensionalen Mikropositionierers erfordert außerdem drei Elektromotoren für die X-, Y-, Z-Steuerung, MPH-1 Montagearm mit MCA-2 verstellbarem Winkel und verschiedene Newport-Verbinder und Schrauben zum Anschrauben an den Vibrationstisch
Teil des dreidimensionalen Mikropositionierers: Peg-Joining Schwalbenschwanz Tisch 0,5 Zoll X TravelNewport Inc.         460PD-Xkeine
Teil eines Mikropositionierers mit drei Dimensionen: Quick-Mount Linear Table, 0,5 Zoll XY TravelNewport Inc.460A-XYkeine
Kwik-Fil dünnwandige Kapillaren aus Borosilikatglas ohne FilamentWorld Precision Instruments TW150-4ohne
Elektrodenabzieher Narishige  PC-10keine Metallgestell
Im eigenen Haus hergestelltkeineElektrodenhalter aus Metall durch Bohren von 2 mm breiten Löchern im Abstand von einem halben Zentimeter in einem rechteckigen Sockel aus Stahl 10 cm x 15 cm
OfenQLModell 10 Laborofenkeine
Silanisierungslösung I Sigma-Aldrich85126Gefährlich, Handhabung wie vom Anbieter empfohlen 
Petrischale aus Glas; PyrexFisher Scientific316060keine
Elektroden-/Mikropipetten-VorratsdoseWorld Precision Instruments E215keine
Glas-ExsikkatorFisher Scientific08-595EEnthält Trockenmittel (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Gib Vaseline auf die Versiegelung, um sie luftdicht zu machen.
Kunststoff-Pasteur-Pipette Fisher Scientific11597722keine
BunsenbrennerFisherScientific S97329keine Objektträger
Sigma-AldrichS8902keine
Gerade MikroelektrodenhalterungWarner InstrumentsQSW-A15Pmit einem goldenen 1 mm Stecker und Ag/AgCl-Draht
Gerader Mikroelektrodenhalter World Precision InstrumentsMEH3Smit einem AgCl(Ag+)Pellet im Inneren und einem goldenen 2-mm-Stecker 
6 cm PetrischaleVWR60872-306ohne
Nitex NetzDynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750ohne
Kleber; Loctite EpoxyVWR500043-451Kleber und Härter zu gleichen Teilen in einem Kunststoff-Wiegeschiffchen mischen und gründlich mischen. Härtet schnell aus, lässt aber 24 Stunden lang bei RT zur vollständigen Aushärtung
deionisiertes Wasser Sigma-Aldrich99053keine
NatriumchloridSigma-AldrichS7653keine
KaliumchloridSigma-AldrichP9333keine
CalciumchloridSigma-AldrichC1016keine
MagnesiumchloridSigma-AldrichM8266keine
HepesSigma-AldrichH3375keine
NatriumhydroxydSigma-AldrichS8045keine
KaliumacetatSigma-AldrichP1190keine Agarose
Sigma-AldrichA9539keine

Referenzen

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