Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

Zusammenfassung

Um die molekularen Mechanismen zu bewerten, die der Gallenleberregeneration von Zebrafischen zugrunde liegen, haben wir ein Leberverletzungsmodell etabliert, in dem die Nitroreduktase-exprimierenden Hepatozyten nach einer Behandlung mit Metronidazol genetisch abgetragen werden. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Hepatozytenablation und die gallengetriebene Leberregeneration geschickt manipuliert, überwacht und analysiert werden können.

Zusammenfassung

Die Leber hat eine große Kapazität zu regenerieren. Hepatocyte- oder Gallengetriebenen Leberregeneration: Hepatozyten, die parenchymale Zellen der Leber, in eine von zwei Arten zu regenerieren. In Hepatocyten getriebenen Leberregeneration, regenerieren Hepatozyten aus vorbestehenden Hepatozyten abgeleitet ist, während, in der Gallengetriebenen Regeneration werden Regenerieren von Hepatozyten und Gallen Epithelzellen (BECs) abgeleitet. Für Hepatozyten getriebenen Leberregeneration, gibt es sehr gute Nagermodellen, die wesentlich zum aktuellen Verständnis der Leberregeneration beigetragen haben. Es besteht jedoch keine solche Nagetiermodell für Gallengetriebenen Leberregeneration. Wir haben vor kurzem auf einem Zebrafischleberschäden Modell, in dem BECs weitgehend Anlass zu Hepatozyten bei schweren Hepatozyten-Verlust geben wiesen. In diesem Modell werden die Leberzellen spezifisch durch eine pharmakogenetische Mittel abgetragen. Hier im Detail präsentieren wir die Methoden, um Hepatozyten abzutragen und den BEC-driven Leberregenerationsprozess zu analysieren.Diese Hepatozyten-spezifische Ablation Modell kann weiter verwendet werden, um die zugrunde liegenden molekularen und zellulären Mechanismen der Gallengetriebenen Leberregeneration entdecken werden. Darüber hinaus können diese Verfahren, um chemische Bildschirmen angewendet werden, um kleine Moleküle, erweitern oder die Regeneration der Leber zu unterdrücken identifizieren.

Einleitung

Die Leber ist ein hoch regenerative Organ. Während der Leberregeneration, Regeneration von Leberzellen, die parenchymale Zellen der Leber, sind aus vorbestehenden Leberzellen (Hepatozyten getriebenen Leberregeneration) oder BECs (Gallengetriebenen Leberregeneration) ^1,2 abgeleitet. Leberschäden hervorruft, in der Regel die Verbreitung von bereits bestehenden Leberzellen; Wenn jedoch Hepatozytenproliferation kompromittiert ist, kann dazu beitragen, BECs Hepatozyten ^2-4. Diese beiden Modi der Leberregeneration klinisch signifikant. Nach der operativen Entfernung eines Teils der menschlichen Leber (zB aufgrund von Lebertumoren oder lebenden Leberspender), Hepatozyten im Leberrest vermehren, um die verlorene Lebermasse wiederherzustellen. Dagegen bei Patienten mit schweren Lebererkrankungen, Hepatozytenproliferation stark beeinträchtigt wird, so daß BECs oder Leberstammzellen (LPCs) scheinen zur Regenerierung Hepatozyten ^5,6 beizutragen. Das Nagetier 2/3 Teilhepatektomie Modell, in demHepatozyten vermehren, um die Lebermasse verloren zu erholen, hat wesentlich zum derzeitigen Verständnis der Hepatozyten-driven Leberregeneration ^7,8 beigetragen. Jedoch gibt es keine gültige Nagetiermodell, in dem Regenerieren Hepatozyten werden hauptsächlich aus BECs abgeleitet. Obwohl mehrere Nagetier Lebertoxin Modellen führte zur Identifizierung von Gallengetriebenen Leberregeneration ^2-4, letzten Linienverfolgungsstudien an Mäusen zeigen einen minimalen Beitrag von BECs regenerierendes Leberzellen in diesen Modellen ^9,10. Einige der Nagetiermodellen Leberverletzung, einschließlich partieller Hepatektomie ^11-13 und Acetaminophen induzierten Leberschaden ^14,15 haben Zebrafisch angewandt und führten zur Identifizierung neuer Gene oder Wege bei der Leberregeneration in Verbindung gebracht. Allerdings Hepatozyten-getrieben, aber nicht BEC-getrieben, tritt die Leberregeneration in diesen Zebrafischleberschäden Modelle. Daher ist eine neuartige Leberschäden Modell, in dem BECs weitgehend an Regenerat beitragening Hepatozyten ist für ein besseres Verständnis der BEC getriebenen Leberregeneration benötigt.

Die übergeordneten Ziele des Hepatozyten-Ablation Modell hier beschrieben sind (1), um eine Schädigung der Leber Modell, in dem BECs weitgehend zu regenerierenden Leberzellen beitragen, und (2) Aufklärung der molekularen und zellulären Mechanismen BEC-driven Leberregeneration zugrunde zu generieren. Wir vermuten, dass die Schwere der Verletzung bestimmt den Modus der Leberregeneration; So sagten wir voraus, dass Gallengetriebenen Leberregeneration würde von schweren Verletzungen Hepatozyten zu initiieren. Um diese Hypothese zu testen, ein Zebrafischleberschäden Modell entwickelten wir durch die Erzeugung eines transgenen Linie, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^S931, dass hoch drückt bakterielle Nitroreduktase (NTR) mit cyan fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert unter der Hepatozyten-spezifischen fabp10a Promotor. Da NTR wandelt das nicht-toxische Prodrug, Metronidazol (MTZ), in ein zytotoxisches Arzneimittel, abträgt es nur die beabsichtigte NTR-exprimierenden Zellen ^16-18, in diesem Fall werden die Hepatozyten. Durch Manipulation der Dauer der MTZ Behandlung kann das Ausmaß der Ablation Hepatozyten gesteuert werden. Mit diesem Modell haben wir vor kurzem berichtet, dass bei schweren Hepatozyten Verlust, BECs weitgehend Anlass zu regenerierenden Leberzellen ^19, die durch zwei weitere unabhängige Studien ^20,21 bestätigt wurde. Daher kann im Vergleich zu dem vorgenannten Nagetier und Zebrafisch Leberverletzung Modellen ist unsere Hepatozyten Ablation Modell zum Studium BEC getriebenen Leberregeneration vorteilhafter.

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren für die Durchführung der Leberregeneration Experimente unter Verwendung der Zebrafisch-Hepatozyten-Ablation-Modell. Dieses Modell wird für die Ermittlung der Mechanismen Gallengetriebenen Leberregeneration zugrunde liegenden und für die chemische Bildschirme, um kleine Moleküle, die zu unterdrücken oder zu erweitern Leberregeneration identifizieren können geeignet sein.

Protokoll

Zebrafisch wurden angehoben und nach Standardverfahren gezüchtet; Experimente wurden von der Universität Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Herstellung von Embryos / Larven

1. Um zeitgesteuerte Paarungen, einzurichten erwachsenen männlichen und weiblichen Tg (fabp10a: CFP-NTR) durchführen ^S931 hemizygot oder homozygot Fische O / N und legen Sie eine Trennlinie zwischen ihnen. Entfernen Teiler am nächsten Morgen, als Gegen gewünscht wird. Sammeln Embryonen durch belasten das Wasser mit einem feinen Kunststoffnetz Sieb.
2. Drehen Sie den Filter auf den Kopf und spülen Sie die Netzoberfläche mit einem feinen Strom von Ei Wasser aus einem Squeeze-Flasche abgefüllt. Übertragen Sie 100 Embryonen in eine 100 mm Petrischale mit 25 ml Wasser Ei. Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale und heben Sie sie auf 28 ° C.
3. Pigmentierung hemmen, fügen Phenylthioharnstoff (PTU) in die Petrischalen vor 10 Stunden nach der Befruchtung (HPF), und heben Sie embryos / Larven bis 80 HPF. Die Endkonzentration der PTU beträgt 0,2 mm. ACHTUNG: PTU ist giftig. Verwenden Sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang.
4. Betäuben die Larven durch Zugabe von 3-Aminobenzoesäure-ethylester (Tricaine) bei einer Endkonzentration von 0,016%, in die Petrischalen. Dann, mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop, sortieren GFP-positive Larven. Verwenden Larven mit einer ähnlichen Lebergröße und entsorgen Sie die mit einer kleineren oder größeren Leber.
   Anmerkung: Jeder GFP-positive Larven, egal Intensität kann verwendet werden, da es keinen Unterschied in dem Ausmaß der Ablation Hepatozyten zwischen der hemizygot homozygoten Larven. ACHTUNG: Tricaine ist giftig. Verwenden Sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang.
5. Entfernen Sie das Wasser, das Ei Tricaine und fügen Sie Ei Wasser mit 0,2 mM PTU ergänzt. Halten Sie die Embryonen / Larven bei 28 ° C.

2. Mtz Treatment

1. Bereiten Sie frischen 10 mM Mtz durch Auflösen von 0,171 g Mtz Pulver in 100 ml Ei Wasser ergänzt mit 0,2% DMSO und 0,2 mM PTU. Um die Mtz vollständig zu lösen, mischen Sie die Lösung bei RT unter schnellem Rühren für 20-30 Minuten. Um Ihnen zu helfen zu solubilisieren Mtz und Mtz Permeation in die Larven zu verbessern, fügen DMSO bei der Vorbereitung Mtz. ACHTUNG: längerer Exposition oder erhöhte Konzentration von Mtz ist giftig. Verwenden Sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang.
2. Trenne die Larven in Kontroll- und Versuchsgruppen durch Übertragen gewünschte Anzahl der Larven in zwei 100 mm-Petrischale oder Multi-Well-Platte. Für die Versuchsgruppe, halten Sie die Larven in 10 mM Mtz Lösung; in der Kontrollgruppe, halten sie in Ei-Wasser, das 0,2% DMSO.
3. Umfassen die Platten oder Petrischalen MTZ Lösung mit einer Aluminiumfolie, um den Photo Inaktivierung Mtz verhindern, und Inkubieren bei 28 ° C. Die Dauer der Behandlung hängt von Mtz Larvenstadium und der transgenen Linie.
4. Ähnliche schwere Hepatozyten-Ablation in das beobachten Tg (fabp10a: CFP-NTR) Linie, behandeln die Larven mit der Mtz Lösung von entweder 3,5 Tage nach der Befruchtung (DPF) (für die Dauer von 36 h) oder von 5 dpf (für die Dauer von 24 h).

3. Analyse der Gallengetriebenen Leberregeneration

1. Am Ende der Ablation Zeitraum, entfernen Sie die Mtz Lösung von den Platten. Durch Zugabe von 25 ml Wasser Ei waschen Sie die MTZ-behandelten Larven. Schwenken Sie die Platte 2-3 mal, um die Larven vor der Entsorgung das Ei Wasser zu waschen. Wiederholen Sie drei Mal und dann tauchen die Larven wieder in Ei Wasser. Zu Herzen Ödeme und zum Tod der Larve in der MTZ-behandelten Larven zu vermeiden, fügen Sie eine niedrigere Konzentration von Tricaine, in einer endgültigen Konzentration von 0,008%, um die Larven zu immobilisieren.
2. Für Leberanalyse, Prüfung der Lebergröße der MTZ-behandelten Larven unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit der GFP-Filter. Beurteilen Hepatozyten Ablation Ebenen auf der Grundlage des relativen Lebergröße: groß (nicht abgetragenen; 0-10% Larven), mittel (teilweise abgetragen, 10-20%) und sehr klein (vollständig abgetragen; 80-90%).
3. Entfernen Sie die Larven mit nicht abgetragene oder teilweise abgetragen Lebern. Nur halten Larven mit einer winzigen Leber, die indikativ für schwere Hepatozyten Ablation. Für Leber-Analyse bei der Regeneration 0 hr Zeitpunkt (R0h), ernten die Larven nach Mtz Auswaschen und CFP Sortierung. Ansonsten halten die sortiert Larven im Ei Wasser mit 0,2 mM PTU ergänzt, bis bereit für die Ernte.
4. Transfer geerntet Larven in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Ersetzen ei Wasser mit der Fixierungslösung von 3% Formaldehyd in PEM-Puffer. Das Röhrchen auf einem Rotator O / N bei 4 ° C.
5. Ersetzen Sie die Fixierungslösung mit 1 ml PBSDT und drehen Sie die Röhre mit den Larven auf dem Rotator für 5 min.
6. Übertragen Sie die Fest Larven in eine 100 mm Petrischale mit PBSDT und mit einer Pinzette, Eigelb und Brustflossen unter einem Binokular manuell entfernen. Übertragung von bis tp 20 seziert Larven in ein 1,5-ml-Tube.
7. Ersetzen PBSDT Lösung mit 1 ml Blockierungslösung und Rock das Rohr auf einem Rotator bei RT für 2 h.
8. Ersetzen Blockierungslösung mit 100 ul Blockierungslösung mit primären Antikörpern. Langsam schaukeln Sie das Rohr auf einem Rotator O / N bei 4 ° C.
9. Entfernen Sie den primären Antikörperlösung und wäscht mit PBSDT 5 mal für 10 Minuten jedes Mal. Dann fügen Sie 100 ul Blockierungslösung, die Sekundärantikörper und schütteln Sie sie auf einem Rotator bei RT 2 h.
10. 5 mal mit PBSDT für je 10 min waschen bei RT durch Schaukeln auf einem Rotator.
11. Richten Sie die Larven seitlich auf einen Objektträger und einen Tropfen Eindeckmittel. Sorgfältig decken Sie sie mit einem Deckglas und Dichtung das Deckglas mit einem Nagellack. Jetzt ist es bereit für die konfokale Mikroskopie.

Ergebnisse

MTZ Behandlung für 36 h (A36h, A steht für Ablation) von 3,5 bis 5 dpf drastisch reduziert Lebergröße (1B). CFP-NTR und fabp10a:: Nach dem Auswaschen Mtz, als Beginn der Leberregeneration (R), starke fabp10a als dsRed Ausdruck erschien innerhalb von 30 h (1B). Die intrahepatische Gallen Netzwerk als durch Expression ALCAM die in der Membran von BECs ²² vorliegt beurteilt zunächst zusammenfällt, aber bei 54 Stunden nach der Auswaschung (R54h) (1C)

Diskussion

Ernst, aber nicht mild, entlockt Hepatozyten-Ablation Gallengetriebenen Leberregeneration. Daher wird nach Mtz Behandlung und Auswaschen, ist es wichtig, um die Leber Größe des MTZ-behandelten Larven, die durch intrinsische Fluoreszenz des GFP fabp10a bewertet werden können untersuchen: GFP-Transgen NTR. Da ein kleiner Prozentsatz der MTZ-behandelten Larven wird nicht abgetragenen (0-5%) oder (10-20%) Lebern teilweise abgetragen anzuzeigen, ist es wichtig zu klären, und nur analysieren die Larven mit e...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Aminobenzoesäure-Ethylester (Tricain) -Pulver	Sigma-Aldrich	A5040	Stellen Sie 0,4% (15 mM) Tricain-Bestand her: Bringen Sie 0,4 g Tricain auf 100 mL mit Eiwasser. Auf pH 7 einstellen.
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazol	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	252549
Calciumsulfatdihydrat	Sigma-Aldrich	C3771
N-Phenylthiharnstoff (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Eindeckmittel (Vectashield)	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm Petrischale	Denville Scientific Inc.	M5300
Klarlack	Fisher Scientific	50949071
feine Pinzette	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
Glasobjektträger	Fisher Scientific	12-544-1
Glasdeckglas	Fisher Scientific	12-540-A und 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (Maus anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10 Verdünnung
Ziege anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50 Verdünnung
Ratte anti-RFP	Allel Biotechnologie	ACT-CM-MRRFP10	1:300 Verdünnung
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Ziegen-IgG (H+L)	Jackson Laboratorien	705-605-147	1:500 Verdünnung
AlexaFluor 647 AffiniPure Ziege Anti-Maus IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	1:500 Verdünnung
Cy3 Esel Anti-Ratte IgG	Jackson Laboratorien	712-165-150	1:500 Verdünnungs-Präpariermikroskop
	Leica Microsystems	S6F
Epifluoreszenzmikroskop	Leica Microsystems	M205FA
konfokales Mikroskop	Carl Zeiss	LSM700
Eiwasser			0,3 g/L Meersalz ' Sofortiger Ozean" und 0,5 mM CaSO4 in destilliertem Wasser.
[header]
10X PBS			25,6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Mit destilliertem Wasser auf 1 L bringen. pH-Wert einstellen 7. Autoklav für 20 min bei 121°C.
1X PBSDT,			0,2 % Triton X-100 und 0,2 % DMSO in 1 x PBS.
PEM-Puffer			30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Mit destilliertem Wasser auf 1 L bringen. Stellen Sie den pH-Wert 7 ein.
Blockierungslösung			Mischen Sie 1 ml hitzeinaktiviertes Pferdeserum mit 9 ml 1X PBSDT.