Um die molekularen Mechanismen zu bewerten, die der Gallenleberregeneration von Zebrafischen zugrunde liegen, haben wir ein Leberverletzungsmodell etabliert, in dem die Nitroreduktase-exprimierenden Hepatozyten nach einer Behandlung mit Metronidazol genetisch abgetragen werden. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Hepatozytenablation und die gallengetriebene Leberregeneration geschickt manipuliert, überwacht und analysiert werden können.
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Methodenartikel
Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Leber hat eine große Kapazität zu regenerieren. Hepatocyte- oder Gallengetriebenen Leberregeneration: Hepatozyten, die parenchymale Zellen der Leber, in eine von zwei Arten zu regenerieren. In Hepatocyten getriebenen Leberregeneration, regenerieren Hepatozyten aus vorbestehenden Hepatozyten abgeleitet ist, während, in der Gallengetriebenen Regeneration werden Regenerieren von Hepatozyten und Gallen Epithelzellen (BECs) abgeleitet. Für Hepatozyten getriebenen Leberregeneration, gibt es sehr gute Nagermodellen, die wesentlich zum aktuellen Verständnis der Leberregeneration beigetragen haben. Es besteht jedoch keine solche Nagetiermodell für Gallengetriebenen Leberregeneration. Wir haben vor kurzem auf einem Zebrafischleberschäden Modell, in dem BECs weitgehend Anlass zu Hepatozyten bei schweren Hepatozyten-Verlust geben wiesen. In diesem Modell werden die Leberzellen spezifisch durch eine pharmakogenetische Mittel abgetragen. Hier im Detail präsentieren wir die Methoden, um Hepatozyten abzutragen und den BEC-driven Leberregenerationsprozess zu analysieren.Diese Hepatozyten-spezifische Ablation Modell kann weiter verwendet werden, um die zugrunde liegenden molekularen und zellulären Mechanismen der Gallengetriebenen Leberregeneration entdecken werden. Darüber hinaus können diese Verfahren, um chemische Bildschirmen angewendet werden, um kleine Moleküle, erweitern oder die Regeneration der Leber zu unterdrücken identifizieren.
Einleitung
Die Leber ist ein hoch regenerative Organ. Während der Leberregeneration, Regeneration von Leberzellen, die parenchymale Zellen der Leber, sind aus vorbestehenden Leberzellen (Hepatozyten getriebenen Leberregeneration) oder BECs (Gallengetriebenen Leberregeneration) 1,2 abgeleitet. Leberschäden hervorruft, in der Regel die Verbreitung von bereits bestehenden Leberzellen; Wenn jedoch Hepatozytenproliferation kompromittiert ist, kann dazu beitragen, BECs Hepatozyten 2-4. Diese beiden Modi der Leberregeneration klinisch signifikant. Nach der operativen Entfernung eines Teils der menschlichen Leber (zB aufgrund von Lebertumoren oder lebende....
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Protokoll
Zebrafisch wurden angehoben und nach Standardverfahren gezüchtet; Experimente wurden von der Universität Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Herstellung von Embryos / Larven
- Um zeitgesteuerte Paarungen, einzurichten erwachsenen männlichen und weiblichen Tg (fabp10a: CFP-NTR) durchführen S931 hemizygot oder homozygot Fische O / N und legen Sie eine Trennlinie zwischen ihnen. Entfernen Teiler am nächsten Morgen, als Gegen gewünscht wird. Sammeln Embryonen durch belasten das Wasser mit einem feinen Kunststoffnetz Sieb.
- Drehen Sie den Filter auf den Kopf ....
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Ergebnisse
MTZ Behandlung für 36 h (A36h, A steht für Ablation) von 3,5 bis 5 dpf drastisch reduziert Lebergröße (1B). CFP-NTR und fabp10a:: Nach dem Auswaschen Mtz, als Beginn der Leberregeneration (R), starke fabp10a als dsRed Ausdruck erschien innerhalb von 30 h (1B). Die intrahepatische Gallen Netzwerk als durch Expression ALCAM die in der Membran von BECs 22 vorliegt beurteilt zunächst zusammenfällt, aber bei 54 Stunden nach der Auswaschung (R54h) (1C)
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Diskussion
Ernst, aber nicht mild, entlockt Hepatozyten-Ablation Gallengetriebenen Leberregeneration. Daher wird nach Mtz Behandlung und Auswaschen, ist es wichtig, um die Leber Größe des MTZ-behandelten Larven, die durch intrinsische Fluoreszenz des GFP fabp10a bewertet werden können untersuchen: GFP-Transgen NTR. Da ein kleiner Prozentsatz der MTZ-behandelten Larven wird nicht abgetragenen (0-5%) oder (10-20%) Lebern teilweise abgetragen anzuzeigen, ist es wichtig zu klären, und nur analysieren die Larven mit e.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Hukriede und Dr. Tsang für die Diskussionen. M.K. wurde durch ein NIH-Ausbildungsstipendium (T32EB001026) unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der American Liver Foundation, der March of Dimes Foundation (5-FY12-39) und des NIH (DK101426) an D.S. unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3-Aminobenzoesäure-Ethylester (Tricain) -Pulver | Sigma-Aldrich | A5040 | Stellen Sie 0,4% (15 mM) Tricain-Bestand her: Bringen Sie 0,4 g Tricain auf 100 mL mit Eiwasser. Auf pH 7 einstellen. |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazol | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyd | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calciumsulfatdihydrat | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiharnstoff (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Eindeckmittel (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm Petrischale | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| Klarlack | Fisher Scientific | 50949071 | |
| feine Pinzette | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Glasobjektträger | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Glasdeckglas | Fisher Scientific | 12-540-A und 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (Maus anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 Verdünnung |
| Ziege anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 Verdünnung |
| Ratte anti-RFP | Allel Biotechnologie | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 Verdünnung |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Ziegen-IgG (H+L) | Jackson Laboratorien | 705-605-147 | 1:500 Verdünnung |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Ziege Anti-Maus IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 Verdünnung |
| Cy3 Esel Anti-Ratte IgG | Jackson Laboratorien | 712-165-150 | 1:500 Verdünnungs-Präpariermikroskop |
| Leica Microsystems | S6F | ||
| Epifluoreszenzmikroskop | Leica Microsystems | M205FA | |
| konfokales Mikroskop | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Eiwasser | 0,3 g/L Meersalz ' Sofortiger Ozean" und 0,5 mM CaSO4 in destilliertem Wasser. | ||
| [header] | |||
| 10X PBS | 25,6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Mit destilliertem Wasser auf 1 L bringen. pH-Wert einstellen 7. Autoklav für 20 min bei 121°C. | ||
| 1X PBSDT, | 0,2 % Triton X-100 und 0,2 % DMSO in 1 x PBS. | ||
| PEM-Puffer | 30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Mit destilliertem Wasser auf 1 L bringen. Stellen Sie den pH-Wert 7 ein. | ||
| Blockierungslösung | Mischen Sie 1 ml hitzeinaktiviertes Pferdeserum mit 9 ml 1X PBSDT. |
Referenzen
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. New concepts in liver regeneration. J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 1....
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Nachdrucke und Genehmigungen
