Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir die effizientesten Methoden zum Einfrieren, Einbetten, Kryoschneiden und Färben von Muskelbiopsien, um das Einfrieren von Artefakten zu vermeiden.

Zusammenfassung

Histologische Bewertung von Muskelbiopsien wurde als unverzichtbares Instrument für das Verständnis der Entwicklung und Progression von Pathologie der neuromuskulären Erkrankungen serviert. Um dies zu tun, muss jedoch die richtige Pflege, wenn das Ausschneiden und die Erhaltung Gewebe, um eine optimale Färbung erreichen ergriffen werden. Eine Methode der Gewebekonservierung beinhaltet Befestigungs Gewebe in Formaldehyd und dann Einbettung mit Paraffinwachs. Dieses Verfahren bewahrt Morphologie gut und ermöglicht langfristige Lagerung bei Raumtemperatur, ist aber umständlich und erfordert Umgang mit giftigen Chemikalien. Ferner Formaldehydfixierung ergibt Antigen Vernetzung, die Antigen-Retrieval-Protokolle für eine wirksame Immunfärbung erfordert. Im Gegenteil, ist gefrorene Schnitte nicht Fixierung erfordern und somit behält biologischen Antigen-Konformation. Dieses Verfahren stellt auch einen entscheidenden Vorteil in der schnellen Durchlaufzeit, so dass es besonders hilfreich in Situationen, brauchen schnelle histologische Auswertung wie intraoperative chirurgischen Biopsien. Hier beschreiben wir die effektivste Methode zur Herstellung von Muskelbiopsien zur Visualisierung mit unterschiedlichen histologischen und immunologischen Flecken.

Einleitung

Prüfung der Muskel Histologie spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis der verschiedenen Arten von neuromuskulären Störungen ^1-4. Wenn sie mit anderen Techniken kombiniert, erlaubt es Forschern, eine bessere Vorstellung von der Manifestation und Progression der Pathologie zu bekommen und kann auch wichtig sein, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Interventions ^5-10 bewerten. Jedoch genau zu sein, müssen die Gewebe in der richtigen Art und Weise gespeichert, die den physiologischen Zustand unmittelbar vor dem Herausschneiden erhalten. Dies erfordert große Sorgfalt bei der Entnahme, Konservierung, Schnitte, und Färbung.

Protokoll

1. Tissue Ernte und Einfrieren von Muskelgewebe

1. Euthanize die Maus mit einer Überdosis Isofluran (2-Chlor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan). Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug und verwenden Sie eine Auffangverfahren, wie einem Exsikkator oder einer Glasglocke, die ein Wattestäbchen in Isofluran getränkt.
2. Tod Bestätigen fest drückte Fußballen. Verwenden Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie wie Genickbruch.
3. Befeuchten Sie das Fell mit 70% Alkohol, um das Anhaften von losen Haarsträhnen auf die Muskeln zu reduzieren. Schälen Sie die Haut von dem Schenkel mit einer feinen Pinzette, wie # 5.
4. Trennen Sie vorsicht....

Ergebnisse

Das Set-up für die Ernte und das Einfrieren von Gewebe kann in 1 gesehen werden kann. Entfernte Gewebe sollte auf eine Gaze in PBS eingeweicht, um das Trocknen (1A) zu vermeiden, gespeichert werden. Werden die Gewebe so ausgewählt sind, für die histologische Analyse verwendet werden, sollten in OCT eingetaucht werden und auf Kryo Form gelegt in der richtigen Orientierung und so nahe physiologischen Länge möglichst genaue Morphologie (1B) zu gewährleisten. Aufschlämmung .......

Diskussion

Histologie und Immunhistochemie wurden als wichtige Instrumente für das Verständnis der Manifestation und Progression der Pathologie in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen eingesetzt. Klassischerweise wurden Muskelbiopsien ersten in Formaldehyd fixiert und dann mit Paraffinwachs eingebettet. Während Formaldehydfixierung bewahrt Gewebearchitektur und ermöglicht Gewebe Lagerung und Transport bei RT, inaktiviert es auch Enzyme und Proteine ​​Vernetzungen erfordern weitere Schritte, um genaue Immunfärbung zu erzielen.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., Bürotelefon 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific
Mikroskop	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Telefon: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus
Bildanalysesoftware	Nikon Imaging Software Grundlagenforschung	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Telefon: 1-631-547-8500 Alternativen: Image J, Metamorph
Isofluran	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.
OKT	4583	Sakura Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative Quelle: Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
Einweg-Taschentuchform	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
Colorfrost plus Folien	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
Ethylalkohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
2-Methylbutan	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
Xylole	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific