Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Methode zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen unter Verwendung einer serumfreien Monolayer-Methode. Diese Vorläuferzellen können verwendet werden, um reife neuronale Zelltypen abzuleiten oder den Prozess der neuronalen Spezifikation zu untersuchen, und sind für die Skalierung im Multiwell-Format für das Screening von Verbindungen zugänglich.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fähigkeit, embryonalen Stammzellen der Maus zu differenzieren (ESC) zu neuralen Vorläuferzellen ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen, die neuronale Spezifikation sowie die Erzeugung von reifen neuralen Zelltypen für eine weitere Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Unterscheidung von ESC zu neuralen Vorläuferzellen mit Serum-freien, Monokultur. Das Verfahren ist skalierbar, effizient und führt zur Produktion von ~ 70% neuralen Vorläuferzellen innerhalb 4-6 Tagen haben. Es kann zu ESC aus verschiedenen Stämmen unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen angewendet werden. Neuralen Vorläuferzellen kann zugelassen werden, um weiter in funktionelle Neuronen und Glia differenzieren oder analysiert durch Mikroskopie, Durchflusszytometrie oder molekularen Techniken. Der Differenzierungsprozess zugänglich ist Zeitraffermikroskopie und kann mit der Verwendung von Reporter-Linien, um die neuronale Spezifikationsprozess Überwachung kombiniert werden. Wir bieten Ihnen detaillierte Anweisungen, Medienaufbereitung und Zelldichte-Optimierung, damit der Prozess zu be angelegt, um die meisten ESC Leitungen und einer Vielzahl von Zellkulturgefäßen.
Einleitung
Embryonale Stammzellen sind pluripotente Zellen des frühen Embryos mit der Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in vitro proliferieren, abgeleitet, während die Fähigkeit beibehalten wird (durch Bildung einer Chimäre) in alle adulten Zelltypen folgenden Wiedereinführung in einem geeigneten Stadium Embryos differenzieren, die Injektion in syngene oder immunsupprimierten (durch Bildung einer Teratom) oder in vitro unter Umständen von Cues 1. Die in vitro Differenzierung von embryonalen Maus-Stammzellen zu neuralen Linien wurde erstmals 1995 beschrieben und involviert die Bildung von vielzelligen Aufhängung Aggregate (Embryoid Bodies, EBs....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Medien Vorbereitung
ANMERKUNG: Das Protokoll beruht auf der Verwendung einer Mischung aus zwei getrennten Medien: DMEM / F12 mit modifizierten N2 Ergänzung und Neurobasalmedium mit B27 Ergänzung ergänzt ergänzt, typischerweise in einem 1: 1 Verhältnis.
- Bereiten Sie die modifizierte N2 Ergänzung durch Vermischen der Komponenten in einem 15-ml-Tube. Nicht vortexen oder filtern diese; mischen durch Umdrehen des Röhrchens, bis die Lösung klar ist.
- Starten Sie durch Pipettieren von 7,2 ml DMEM / F12, dann fügen Sie 1 ml 25 mg / ml Insulin (in 0,01 M HCl hergestellt) und gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens. Es dauert....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
In diesem Experiment verwendeten wir den 46C-Zellinie 14, embryonalen Stammzellen der Maus mit einer endogenen SOX1-GFP-Reporter, um neuronale Differenzierung zu verfolgen. Durch die Nutzung dieser Zelllinie Expression von SOX1, ein Marker für neurale Vorläufer, kann durch grüne Fluoreszenz detektiert werden. Plattierungsdichte ist ein kritischer Faktor, um die neuronale Differenzierung zu erreichen. Embryonale Stammzellen der Maus wurden in 6-Well-Platte bei unterschiedlicher Dichte reicht von 10.500 bis 88........
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Monoschicht neuronalen Differenzierung Protokoll wird seit mehr als einem Jahrzehnt 6 gewesen. Das Protokoll ist sehr leistungsfähig, von definiertem Medium zusammengesetzt ist und in einer Monoschicht-System, das das System eher für präklinische macht gemacht (zB Arzneimittel-Screening) verwendet. Es gibt jedoch einige wichtige Faktoren, die die Differenzierung Effizienz zu bestimmen. Dieser Artikel weist darauf hin, die Faktoren und die Lösung für jedes Hindernis.
D.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Arbeit wurde durch ein Stipendium für Entwicklung und Förderung von Wissenschaft und Technologie vom thailändischen Bildungsministerium an W.W. und Zuschüsse von Tenovus und dem Anonymous Trust an M.P.S. finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fötales Rinderserum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasales Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serumfrei | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Rekonstituierung mit sterilem 0,01 M HCl |
| Apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Rekonstituierung mit sterilem Wasser |
| Progesteron | Sigma | P8783 | Rekonstituierung mit Ethanol |
| Putrescin | Sigma | P5780 | Rekonstituierung mit sterilem Wasser |
| Natriumselenit | Sigma | S5261 | Mit sterilem Wasser rekonstituieren |
| Rinderalbuminfraktion V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamin | Life Technologies | 25030-081 | Stellen Sie sicher, dass es sich vor der Verwendung vollständig aufgelöst hat, da Glutamin normalerweise sedimentiert ist |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-Well-Gewebekulturschale | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-Well-Gewebekulturschale | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-Well-Gewebekulturschale | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren | Life Technologies | 11140-050 | |
| Natriumpyruvat | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukämie-Hemmfaktor | im eigenen Haus hergestellt wurde, wie in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti β III Tubulin IgG-Antikörper | Covance | MMS-435P | |
| Fluoreszenzmarkierter Anti-Maus-IgG-Antikörper | Life Technologies | A31571 | Schutz vor Licht |
| 25 cm2 Gewebekulturkolben | ThermoScientific | 156367 |
Referenzen
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
