Abstract
La capacità di differenziare le cellule staminali embrionali di topo (ESC) per progenitori neurali consente lo studio dei meccanismi di controllo specifica neurali nonché la generazione di tipi di cellule neuronali mature per ulteriori studi. In questo protocollo si descrive un metodo per la differenziazione di ESC per progenitori neurali usano senza siero, cultura monostrato. Il metodo è scalabile, efficiente e si traduce in produzione di circa il 70% di cellule progenitrici neurali entro 4-6 giorni. Esso può essere applicato a ESC da vari ceppi coltivate sotto una varietà di condizioni. Progenitori neurali possono essere autorizzati a differenziare ulteriormente in neuroni funzionali e glia o analizzati al microscopio, il flusso delle tecniche di citometria o molecolari. Il processo di differenziazione è suscettibile di microscopia time-lapse e può essere combinato con l'uso di linee giornalista per monitorare il processo di specifica neurale. Noi forniamo istruzioni dettagliate sulla preparazione dei media e l'ottimizzazione della densità cellulare per consentire il processo di Be applicato alla maggior parte delle linee ESC e una varietà di recipienti di coltura cellulare.
Introduction
Le cellule staminali embrionali sono cellule pluripotenti derivate da embrione precoce con la capacità di proliferare indefinitamente in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi cellulari adulti seguenti reintroduzione in un apposito embrione stadio (formando una chimera), iniezione in singenici o immunocompromessi host (formando un teratoma) o in vitro soggetto a segnali appropriati 1. La differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali è stato descritto nel 1995 e prevedeva la formazione di aggregati multicellulari di sospensione (corpi embrionali, EBS) in mezzi di siero contenenti integrati con l'acido retinoico morfogeno 2-4. Da allora una serie di protocolli sono stati sviluppati per permettere la differenziazione neuronale 5. Molti ancora utilizzare l'aggregazione, gli altri co-coltura con induzione tipi di cellule e molti prevedono l'utilizzo di mezzi privi di siero. Tutti i protocolli hanno vantaggi and svantaggi e la natura precisa neurali o cellule neuronali prodotte anche varia secondo il protocollo usato.
Il protocollo ideale sarebbe robusto, scalabile e fare uso di mezzi di comunicazione e substrati completamente definiti, essere suscettibili di monitoraggio non invasivo del processo di differenziazione e causare la generazione delle popolazioni pure di cellule progenitrici neurali in grado di essere modellato da stimoli esterni e per differenziare in tutti i sottotipi neuronali e gliali con elevata efficienza e la resa in un tempo relativamente breve. Negli ultimi dodici anni abbiamo utilizzato un metodo per la generazione di progenitori neurali e neuroni di topo CES in una bassa densità, privo di siero cultura monostrato aderente 6-10. Questo protocollo soddisfa molti dei criteri di cui sopra: nelle nostre mani l'efficienza della differenziazione è stato abbastanza costante nel corso di molti anni, e una varietà di linee cellulari, si può essere scalato verso l'alto o verso il basso (usiamo con successo navi di piastre da 96 pozzetti per 15 centimetri di diametro dishes) ei supporti utilizzati sono ben definiti. Il processo è suscettibile di microscopia timelapse per il monitoraggio della differenziazione e una varietà di segnali patterning può essere aggiunto per indurre la generazione di tipi distinti di sottotipi neuronali (es Shh e Fgf8 per i neuroni dopaminergici 6).
Tuttavia, ci sono alcune sfide per l'efficace applicazione di questo protocollo. Uno degli aspetti chiave è un'attenta preparazione dei media. Abbiamo sempre prepariamo il supporto in-house nonostante la disponibilità di alternative commerciali. Uno degli integratori utilizzati (N2; vedi Protocol) ha modifiche nel corso dello standard versioni disponibili in commercio. Infine, una delle fasi più importanti per il successo di questo metodo è la densità cellulare ottimale placcatura. Questo è principalmente perché mentre la natura autocrina di uno dei segnali che inducono (Fgf4 11) richiede che le cellule sono presenti sufficienti per consentire viabil ottimalelità e la differenziazione, a troppo elevate densità di differenziazione è compromessa (forse in parte a causa della produzione autocrina di LIF 12). È quindi importante che la preparazione sia supporti e placcatura cellule vengono eseguite accuratamente e costantemente per garantire risultati ottimali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Carta Preparazione
NOTA: Il protocollo si basa sull'utilizzo di una miscela di due distinti mezzi: DMEM / F12 addizionato con modificato supplemento N2 e Neurobasal supplementato con supplemento B27, tipicamente in un rapporto 1: 1.
- Preparare il supplemento N2 modificato mescolando i componenti in una provetta da 15 ml. Non vortice o filtrare questo; mescolare capovolgendo la provetta fino a quando la soluzione è limpida.
- Inizia pipettando 7,2 ml di DMEM / F12, quindi aggiungere 1 ml di 25 mg / ml di insulina (composta in 0,01 M HCl) e mescolare bene invertendo il tubo. Ci vogliono un paio di minuti fino a quando la soluzione è limpida.
- Aggiungere 1 ml di 100 mg / ml apo-transferrina (preparati in acqua), 33 ml di 0,6 mg / ml progesternone (costituiti in etanolo), 100 ml di 160 mg / ml (1 M) putrescina (preparati in acqua ), 10 ml di 3 mM selenito di sodio (preparati in acqua) e 666 ml di 7,5% di siero albumina bovina e mescolare bene il tubo. Aliquota in 2,5 ml e conservare a -20 °C per un massimo di 2 mesi.
- Preparare il supporto.
- Per 250 ml di DMEM / F12 aggiungere 2,5 ml di N2. Mescolare bene ma non scuotere o filtro.
- Per 250 ml di Neurobasal media aggiungi 5 ml di supplemento B27. Mescolare bene ma non scuotere o filtro.
- Mescolare il supporto da operazioni 1.2.1 e 1.2.2 in un rapporto 1: 1. In alcuni casi un 1: 3 mix può essere richiesto (integrato come il 1: 1 mix al punto 1.2.4).
- Per il mix di aggiungere 0,5 ml di L-glutammina (concentrazione finale 0,2 mm) e 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo (concentrazione finale 0,1 mm) e mescolare bene senza agitare. Conservare il supporto a 4 ° C per un massimo di 3 settimane e non esporre alla luce. Questo mix finale si chiama N2B27.
- Preparare la soluzione di gelatina.
- Preparare una soluzione di gelatina 1% in acqua ultrapura e autoclave a 121 ° C, 15 psi, per 15 min. È importante che la bottiglia utilizzata per questo è completamente pulito da detergenti o disinfettanti, quindi si raccomanda una nuova bottiglia èutilizzato per questo ed è sempre risciacquato solo in acqua ultrapura tra usi. Aliquota della soluzione all'1% in 50 ml aliquote e conservare a 4 ° C per mesi.
- Scaldare un'aliquota di 1% di gelatina in un bagno d'acqua a 37 ° fino a scioglimento e aggiungere 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato calda (PBS). Mescolare bene e pipettare sufficiente a coprire il fondo di ogni bene o un piatto. Lasciare la gelatina per rivestire la superficie per almeno 30 min.
2. placcatura celle
NOTA: Questo protocollo vale anche per il mouse ESC coltivato in 10% di siero di leucemia fattore inibitorio (LIF), la sostituzione di siero con LIF o supporti privi di siero con LIF e proteina morfogenetica dell'osso 4 (BMP4) o MEK e GSK3 inibitori (supporti 2i) con o senza LIF. Tuttavia, i tempi e l'efficienza della differenziazione possono variare a seconda del supporto e le cellule (vedi la discussione). Per gli esperimenti riportati qui abbiamo usato la linea 46C del mouse ESC (che ha un reporter EGFP buttato in one degli alleli Sox1 endogeni), coltivati in GMEM con 10% siero e LIF. Per ottenere risultati ottimali, è importante che le cellule sono dissociate e ripiastrate nei media N2B27; semplicemente cambiando di supporti da GMEM / siero / LIF a N2B27 si traduce sempre in efficienza differenziazione ridotto rispetto replating cellule.
- Far crescere le cellule in GMEM con 10% di siero, 1 mM piruvato di sodio, aminoacidi non essenziali 1x, 0,1 M 2-mercaptoetanolo, e LIF 13 100 unità / ml. Per avere una cultura subconfluenti di topo ESC, piatto 1 x 10 6 cellule in un pallone di coltura T25 che avrà 2-3 giorni.
- Osservare le cellule al microscopio in campo chiaro. Quando le cellule sono subconfluenti e pronti per il passaggio, sciacquare due volte in PBS. Aggiungere 1 ml di cellule dissociazione reagenti e ritorno per l'incubatore per 2 - 5 min. Sebbene tripsina e di altri enzimi possono essere utilizzati anche per la dissociazione cellulare, possono avere un impatto negativo sulla adesione cellulare così le densità di placcatura dovranno essere regosted.
- Una volta che le cellule iniziano a sollevare dalla piastra, toccare il vaso loro rimuovere in una sospensione di cellule singole. Raccogliere le cellule in un totale di 10 ml di mezzi di comunicazione e di dissociazione delle cellule del reagente e pipetta in una provetta da centrifuga da 15 ml.
- Spin le cellule a 300 xg per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di N2B27 preriscaldata pipettando su e giù 3 - 5 volte. Quando pipettando sospensione giù, pipetta contro il lato del tubo per evitare la creazione di bolle. Contare le cellule con un contatore di cellule automatico o un emocitometro e registrare la concentrazione.
- Preparare una sospensione cellulare contenente il numero desiderato di cellule per unità di volume da placcare per pozzetto in N2B27 pre-riscaldato. Una densità di 10.500 cellule per cm 2 in un piatto da 6 pozzetti (cioè, 1 x 10 5 cellule per pozzetto di un piatto 6 pozzetti) è ottimale. Vedi Tabella 1 per il numero consigliato di cellule per cm 2 e plating volumi di media per una serie di recipienti di coltura cellulare.
- Aspirare la gelatina dal recipiente di coltura e la piastra della sospensione cellulare in funzione della densità suggerito e volume in Tabella 1. Non agitare le piastre in quanto ciò concentrare le cellule al centro. Collocare le culture in un incubatore umido a 37 ° C, 5% CO 2.
- Modificare i media ogni 1 - 2 giorni, sostituendo tutti i media con N2B27 fresca. Pipetta delicatamente come vampate di calore le cellule potrebbero incidere densità e diminuire l'efficienza differenziazione nei giorni successivi. Dove vitalità iniziale dopo la placcatura è povero, piastra le cellule in un 1: 3 mix dei media N2 e B27-integrati e cambiare questo N2B27 dopo i primi due giorni. Le cellule cominceranno a differenziare e dovrebbero mostrare espressione Sox1 (visibile fluorescenza verde del reporter nella linea cellulare 46C usato qui) entro 4 - 6 giorni.
3. immunofluorescenza
NOTE: Il protocollo può essere applicato a qualsiasi tipo di imbarcazione. Il volume di ogni reagente è descritta per pozzetto di 6 pozzetti e può essere installato su qualsiasi superficie. Replating è sconsigliato a causa della bassa redditività in seguito.
- Rimuovere terreno di differenziamento e fissare le cellule aggiungendo 500 ml di 4% (v / v) paraformaldeide, lasciare per 15 min.
- Lavare e permeabilize le cellule con 2 ml di PBS-T (tampone fosfato salino con 0,5% (v / v) di Tween-20) due volte. Le cellule possono essere mantenute in PBS-T fino a 2 mesi a 4 ° C.
- Sostituire PBS-T con 1 ml di PBS-T con 10% (v / v) di siero (dalla stessa specie come anticorpo secondario). Incubare 1 ora sulla sedia a dondolo piatto a temperatura ambiente per bloccare qualsiasi legame non specifico.
- Dopo 1 ora, lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS-T, e incubare in 500 microlitri IgG topo contro βIII-tubulina (diluito 1: 1000 in PBS-T con siero 10%). Mettere sul rocker piatto, e lasciare O / N a 4 ° C.
- Da questo punto, proteggere sempre il recipientedalla luce. Lavare le cellule due volte con PBS-T, quindi aggiungere 500 ml di fluorescenza marcato anti-topo IgG (diluito a 2 mg / ml in PBS-T con siero 10%). Mettilo sul bilanciere piatto per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule due volte con PBS-T, quindi aggiungere 500 ml di DAPI (diluito a 0,5 mg / ml in PBS-T) e lasciar riposare per 5 minuti.
- Lavare nuovamente le cellule e tenerli in PBS-T. Le cellule sono pronte per essere fotografata e possono essere conservati per un massimo di 2 settimane a 4 ° C. Si noti che il segnale GFP svanisce nel tempo in modo non è opportuno confrontare l'intensità GFP delle cellule fisse e in diretta o di cellule fissate in tempi diversi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In questo esperimento, abbiamo utilizzato la linea cellulare 46C 14, le cellule staminali embrionali di topo con un endogena Sox1-reporter GFP, per monitorare la differenziazione neuronale. Utilizzando questa linea cellulare, espressione di Sox1, un marker per progenitore neuronale, può essere rilevata da fluorescenza verde. Placcatura densità è un fattore critico per raggiungere la differenziazione neuronale. Cellule staminali embrionali di topo sono stati placcati in 6 pozzetti a diverse densità che variano da 10.500 a 88.500 cellule / cm 2. Figura 1A mostra efficienze differenziazione raggiunti da diverse densità di placcatura in un 6-pozzetti. Il giorno 6 di differenziazione, le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% e colorate per il marcatore neuronale βIII-tubulina. Alla densità ottimale (10.500 cellule / cm 2), cellule differenziate progenitori neurali e neuroni. Questo è stato osservato da segnale fluorescente verde da Sox1-GFP giornalista e immunofluorescenza contro il marcatore neuronale, βIII-tubulina. A lower densità di placcatura ha portato alla morte cellulare nei 3 giorni. Tuttavia, placcatura a troppo alta densità (> 36.500 cellule / cm 2) ha generato una riduzione percentuale di cellule verdi e cellule positive βIII-tubulina. Figura 1B mostra un esperimento condotto in una piastra a 96 pozzetti che richiede circa 10 volte superiore alla densità delle cellule raggiungere l'ottimale (155.000 cellule / cm 2) e il troppo confluenti (362.500 cellule / cm 2) livello.
Densità ottimale può essere diverso tra i preparati media, componente media e lotti cellulari, tipi di cellule, o condizioni di coltura precedenti. Si raccomanda di ottimizzare densità di placcatura per ogni esperimento. Tabella 1 fornisce intervalli di densità di placcatura efficaci in varie piattaforme che devono essere incluse nella fase di ottimizzazione. All'interno di questo campo, dovrebbe essere possibile ottenere una densità che dà una buona efficienza differenziazione all'interno 4 - 6 giorni.
Durante la differenziazione ESC gradualmente cambiare la loro morfologia. Figura 2 mostra cellulare e morfologia delle colonie dal giorno 1 al giorno 6 dopo la placcatura in 6 pozzetti a 10.500 cellule / cm 2. Le cellule sono state coltivate in condizioni di differenziazione e fotografato ogni giorno. Non è raro vedere significativo morte cellulare nei primi giorni a causa dell'estrema variazione delle condizioni di cultura. Tuttavia, le cellule rimanenti sono ancora in grado di differenziare. Il giorno 4, le cellule hanno cominciato a diventare progenitori neurali come segnale verde fluorescente da Sox1-GFP giornalista è apparso in primo luogo. Tuttavia, anche il giorno 6, non tutte le cellule sono Sox1-positive. L'esistenza di alcune cellule non-neuronali è previsto, tuttavia, in condizioni adeguate, la maggioranza delle cellule sarà neurale.
Figura 1. L'effetto della densità di placcatura sull'efficienza differenziazione. Due differentidensità di cellule giornalista Sox1-GFP (46C) sono stati placcati e differenziate in base al protocollo per 6 giorni. (A) differenziazione in un 6-pozzetti. (B) La differenziazione in una piastra da 96 pozzetti. Scala bar:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. morfologie cellulare durante il processo di differenziazione. 46C ESC sono stati differenziati a 10.500 cellule per cm 2 in una piastra di coltura 6-bene e fotografato ogni giorno per osservare i cambiamenti della morfologia cellulare. Scala bar:. 300 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Piattaforma | Gamma di densità effettiva (cellule / cm 2) | Gamma del numero di cellule alla piastra | Suggerito volume di supporto iniziale (ml) | Volume di supporto suggerito dopo giorno 1 (ml) |
| 6-pozzetti | 10.500 - 36.500 | 99.750 - 346.750 | 1.000 | 2.000 |
| Piastra da 24 pozzetti | 15.600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1.000 |
| Piastra a 96 pozzetti | 103.500 - 260.000 | 33.120 - 83.200 | 100 | 200 |
Tabella 1. consigliati placcatura densità e volumi dei media per le diverse dimensioni del vaso. La densità di placcatura in questa tabella sono stati determinati utilizzando la linea cellulare 46C. Per ottenere risultati ottimali la densità di placcatura di ogni singola linea può essere aggusted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo di differenziamento neurale monostrato è stato in uso per oltre un decennio 6. Il protocollo è altamente efficiente, composto terreno specifico, e fatto in un sistema monostrato che rende il sistema più applicabile per preclinica (ad esempio, la selezione della droga) utilizza. Tuttavia, vi sono alcuni fattori critici che determinano l'efficienza differenziazione. Questo articolo sottolinea questi fattori e la soluzione per ogni ostacolo.
Densità delle cellule dopo la placcatura in condizione differenziazione è forse il fattore più critico. Placcatura le cellule a troppo alta densità riduce l'efficienza di differenziazione, mentre la placcatura a troppo bassa densità porta alla morte cellulare. Questo fenomeno è probabilmente dovuto al autocrino segnalazione del fattore di crescita. Fgf4 è un fattore di crescita autocrino che attiva la cascata MAPK e guida ESC differenziazione 11. LIF è un'altra citochina prodotta da ESC. Attiva la via STAT3 e promuove l'auto-rinnovamento <sup> 15. Questo protocollo fa uso di N2B27 per rendere le cellule neurali. N2B27 contiene vari fattori che permettono la sopravvivenza ESC e favorisce la crescita delle cellule neurali, e non contiene né LIF o BMP4 che inibiscono differenziamento neurale 6. Alla giusta densità, un equilibrio adeguato di segnalazione Fgf4 e LIF è mantenuto che permette di differenziare ESC. Ad alta densità, eccessiva presenza di LIF autocrine e BMP differenziazione inibizione. Al contrario, le cellule a troppo bassa densità hanno alterato la sopravvivenza in questi mezzi piuttosto minimale. Così, quando compaiono gran numero di cellule senza differenziazione numero di placcatura deve essere ridotto, considerando la necessità di un aumento del numero di cellule placcatura se significativo morte cellulare è osservata.
Oltre al numero di cellule ci sono altri fattori che influenzano indirettamente densità di placcatura. Il primo fattore è la concentrazione cellulare locale, a seconda della tecnica utilizzata per distribuire uniformemente le cellule sulla superficiezona. Abbiamo trovato che vorticoso il pozzo non è ideale, poiché si concentra le cellule al centro del pozzo e rende la densità al centro troppo alto, mentre in corrispondenza della periferia della densità diventa troppo bassa. Si consigliano Altre tecniche di miscelazione, per esempio, mescolando i media con le celle prima di placcatura, o oscillare il lato a lato piatto. Inoltre, quando un vaso è posto in incubatrice, riscaldamento irregolare del mezzo provoca una forza di convezione che attira le cellule al centro del pozzo, con conseguente distribuzione delle cellule in un modello anello concentrico. Si raccomanda un volume inferiore supporti il giorno di placcatura per ridurre questo effetto. Lasciando la piastra esterna incubatrice per 30 minuti per consentire alle cellule attaccano, così come il riscaldamento del mezzo prima della miscelazione possono anche aiutare a raggiungere una densità di placcatura omogenea.
In secondo luogo, il tipo di imbarcazione influisce anche placcatura densità. La figura 1 mostra chiaramente che il numero di cellule / pozzetto non può essere linearmente scaportato alla superficie di diverse navi (in altre parole, lo stesso numero di cellule / superficie non può essere applicata a qualsiasi tipo di imbarcazione). Un piccolo vaso (con rapporto maggiore volume / area) è influenzata più dalla tensione superficiale media che rende una superficie concava di media, il cosiddetto menisco. La tensione superficiale spinge le cellule al bordo del pozzo e diminuisce densità al centro. Inoltre, dato volume di supporto nel piccolo vaso è bassa, supporti riscaldano rapidamente, riducendo la forza di convezione. Pertanto, le celle di una piccola imbarcazione si sposta verso il bordo dall'effetto del menisco, e non si muovono verso il centro da forze di convezione. Così, il più piccolo il vaso, maggiore è la densità di placcatura richiesti per ottenere la densità ottimale al centro.
In terzo luogo, la condizione delle cellule prima placcatura anche influisce indirettamente densità di placcatura ed efficienza differenziazione. Abbiamo trovato una variazione della densità ottimale in alcuni esperimenti. Gli esperimenti contasso di mortalità più elevato del primo giorno necessaria una maggiore densità di differenziazione efficiente. Culture ESC nel siero e LIF sono composti da una popolazione eterogenea di cellule pluripotenti naive, cellule pluripotenti innescate, e anche un piccolo numero di cellule differenziate 16. Le cellule di questo tipo hanno differenti capacità di sopravvivere e differenziarsi in condizioni di differenziazione. Poiché il protocollo impone sul numero, ma non lo stato delle celle, alcuni esperimenti potrebbero iniziare con cellule più differenziate che moriranno sui primi giorni, portando ad una densità inferiore al previsto. Per evitare questa variazione, cultura coerente ESC è necessario per assicurarsi che la proporzione costante tra ciascuno stato viene mantenuto.
A parte la densità, la tempistica è un altro fattore per raggiungere la differenziazione efficiente. In questa pubblicazione, si descrive la generazione di progenitori neurali entro 6 giorni. Tuttavia, il tempo può essere differente a seconda dello stato dil'avvio della cultura ESC. Come descritto in precedenza, le culture ESC sono popolazioni miste in grado di rispondere in modo diverso alla condizione differenziazione. Non solo la sopravvivenza cellulare, ma anche i tempi di differenziazione saranno influenzati dalla composizione coltura. Questo protocollo può essere applicato a più ESC condizioni di coltura per esempio, in mezzi contenenti N2B27 LIF e BMP4 o 2i e LIF. Tuttavia, se vi sono più cellule naive nella cultura, un periodo più lungo potrebbe essere necessaria per la differenziazione efficiente. Questo perché le cellule ingenui avranno bisogno di più tempo per passare ad uno stato innescato e poi differenziarsi per progenitori neurali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A.
