Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

Edmund Ong; Catherine Cahill

doi:10.3791/52824

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Methodenartikel

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

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DOI:

10.3791/52824

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3. Juli 2015

Edmund Ong¹^,² , Catherine Cahill¹^,²^,³

¹Department of Anesthesiology and Perioperative Care, University of California Irvine, ²Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, ³Department of Pharmacology, University of California Irvine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse.

Zusammenfassung

Der intrazelluläre Transport von Rezeptoren ist eine Ansammlung komplexer und hochgradig kontrollierter Prozesse. Der Rezeptortransport moduliert die Signalübertragung und die allgemeine Zellreaktion auf Liganden und wird selbst durch intra- und extrazelluläre Bedingungen, einschließlich ligandeninduzierter Signalwege, beeinflusst. Dieses Protokoll ist für die Verwendung mit monolayer-plattierten kultivierten Zellen optimiert, kann aber auf frei schwebende Gewebescheiben erweitert werden. Es verwendet Immunmarkierung und Kolokalisationsanalyse, um Veränderungen des intrazellulären Rezeptortransports nach chronischen/anhaltenden und akuten Interventionen, einschließlich exogener medikamentöser Behandlung, zu verfolgen. Nach der medikamentösen Behandlung werden die Zellen doppelt immunmarkiert für den Rezeptor und für Marker für die interessierenden intrazellulären Kompartimente. Die sequentielle konfokale Mikroskopie wird dann verwendet, um Zweikanal-Mikroaufnahmen einzelner Zellen zu erfassen, die einer computergestützten Kolokalisationsanalyse unterzogen werden, um quantitative Kolokalisationswerte zu erhalten. Diese Scores werden normalisiert, um das Pooling unabhängiger Replikate vor der statistischen Analyse zu ermöglichen. Es können auch repräsentative Mikroaufnahmen verarbeitet werden, um illustrative Abbildungen zu erstellen. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Technik zur quantitativen Bewertung des induzierten Rezeptortransports.

Einleitung

Rezeptoren, insbesondere G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), werden routine intrazellulär gehandelt, zu und von der Zelloberfläche ^1. Diese aufwändig orchestrierte und streng kontrollierte Prozesse diktieren verfügbar Rezeptor Ergänzungen Zellen und regulieren Rezeptor zeitliche Aktivität, Desensibilisierung und Resensibilisierung ^2-4. Wichtig ist, dass diese Verfahren, die auf zelluläre Umgebungen, einschließlich Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Aktivität oder Inaktivität. Das heißt, die Aktionen der Liganden an Rezeptoren intrazellulären Transport von diesen Rezeptoren verändern, wodurch Zellreaktionsfähigkeit zu verändern. Auf diese Weis....