In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

Zusammenfassung

Hier wurde eine Methode zur Lokalisierung von Bakterien in Paraffin-eingebetteten Geweben mit Hilfe von DIG-markierten 16S rRNA-Ziel-DNA-Sonden beschrieben. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die Rolle von Bakterien bei verschiedenen Krankheiten wie Parodontitis, Krebs und entzündlichen Immunerkrankungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Vorhandensein von Bakterien im Taschenepithel und im darunter liegenden Bindegewebe in Zahnfleischbiopsien von Patienten mit Parodontitis wurde mit verschiedenen Methoden berichtet, einschließlich Elektronenmikroskopie, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz mit bakterienspezifischen Antikörpern und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit einer fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonde. Dennoch sind diese Methoden aufgrund technischer Einschränkungen oder Schwierigkeiten nicht weit verbreitet. Hier wurde eine Methode zur Lokalisierung von Bakterien in paraffineingebettetem Gewebe mit Hilfe von DIG-markierten DNA-Sonden vorgestellt. Die in Paraffin eingebetteten Gewebe sind die häufigste Form von Biopsiegeweben, die von Pathologiebanken erhältlich sind. Bakterien können entweder artspezifisch oder universell nachgewiesen werden. Bakterielle Signale werden entweder als diskrete Formen (Kokken-, Stäbchen-, Fusiform- und Haarform) von Bakterien oder als dispergierte Formen nachgewiesen. Die Technik ermöglicht es, weitere histologische Informationen zu erhalten: Die Epithelien, das Bindegewebe, die entzündlichen Infiltrate und die Blutgefäße werden gut unterschieden. Mit dieser Methode kann die Rolle von Bakterien bei verschiedenen Krankheiten wie Parodontitis, Krebs und entzündlichen Immunerkrankungen untersucht werden.

Einleitung

Bakterien spielen eine Rolle in der Ätiologie der verschiedenen oralen Erkrankungen wie Parodontitis, Pulpitis, Perikoronitis, Cellulitis und Osteomyelitis. Um die Rolle von Bakterien in der Pathogenese der Krankheit zu verstehen und um die Wirkung der Behandlung zu überwachen, ist die Lokalisierung von Bakterien innerhalb des Gewebes wichtig. Die Anwesenheit von Bakterien im Zahnfleischgewebe von Patienten mit Periodontitis wurde mit verschiedenen Methoden dargestellt, mit Elektronenmikroskopie ^1,2, Immunhistochemie und Immunfluoreszenz unter Verwendung von Bakterien-spezifischen Antikörpern ^3-7 und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (....

Protokoll

1. Probe Vorbereitung

1. PCR-Amplifikation der Sonde
   1. Für die P. gingivalis-spezifischen Sonde, verstärken eine 343-bp-DNA-Fragment von P. gingivalis 16S rRNA durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA von P. gingivalis und der folgenden Primer: 5'TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'und 5'-ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' ^10. Zuführen Amplifikationen mit den folgenden Zyklusbedingungen: 35 Zyklen bei 95 ° C für 30 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 1 min 20 sec, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 ° C ^10,11.
   2. Verstärken die eubakteriellen Sonde mit Hilfe eines 70-bp....

Ergebnisse

Figur 1 zeigt Dot-Blotting von DIG-markierten Sonden im Vergleich mit der positiven Kontrollsonde in dem Satz um ihre Empfindlichkeit zu bestimmen. Das 343 bp P. gingivalis -spezifischen Sonde ist 25-mal empfindlicher ist als die 70 bp eubakteriellen Sonde, Fig. 2 zeigt in-situ-Hybridisierung von Patienten mit chronischer Periodontitis zum Nachweis von P. erhalten Gingivagewebe gingivalis und Eubakterien. Die Bakterien Signale, in violett dargestellt,.......

Diskussion

Hier ein Protokoll, um Bakterien in Paraffin eingebetteten Gewebe unter Verwendung eines DIG-markierte DNA-Sonde wurde beschrieben zu lokalisieren. Die Sonde selektiv DNA oder RNA-Moleküle von bakteriellen 16S-rRNA-Gens und des 16S-rRNA-Targeting-Sonden können entweder als artspezifische oder Universal ausgebildet sein. Die spezifische Hybridisierung des P. gingivalis-spezifischen Sonde an P. gingivalis, aber nicht auf andere orale Bakterien wurde bereits gezeigt worden ^10. Im Gegensatz dazu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Essigsäureanhydrid	Sigma	6404
50%ige Dextransulfatlösung	Millipore	S4030
50X Denhardt'	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA-Markierungs- und Detektionskit	Roche	11 093 657 910
Formamid	Sigma	F9037
ImmEdge™ Kugelschreiber	Dako	H-400
Levamisol	Vector	SP-5000
Magnesiumchlorid		Sigma 246964
Maleininsäure	Sigma	M0375
Methylgrün	Sigma	M6776
Paraformaldehyd	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Lachssperma DNA-Lösung	Invitrogen	#15632-011
Natriumchlorid	Sigma	S9625
Natriumcitrat	Duksan	D1420
Natriumdodecylsulfat	Amresco	227
Triethanolamin-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T