Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die es ermöglicht, Zellen durch den Zellzyklus zu verfolgen, ohne dass die Zellen synchronisiert werden müssen. Das Erreichen einer Zellsynchronisation kann für viele Zellsysteme schwierig sein. Die gängige Praxis besteht darin, das Fortschreiten des Zellzyklus in einem bestimmten Stadium zu blockieren und dann die akkumulierten Zellen freizusetzen, wodurch eine Welle von Zellen entsteht, die den Zyklus gemeinsam durchlaufen. Einige Zelltypen empfinden diesen Block jedoch als toxisch, was zu abnormalen Zellzyklen oder sogar zum Massensterben führt. Die Aufnahme von Bromodeoxyuridin (BrdU) kann verwendet werden, um das Zellzyklusstadium einzelner Zellen zu verfolgen. Die Zellen integrieren dieses synthetische Thymidin-Analogon, während sie während der S-Phase neue DNA synthetisieren. Durch die Bereitstellung von BrdU für einen kurzen Zeitraum ist es möglich, einen Pool von Zellen zu markieren, die sich in der S-Phase befanden, während das BrdU vorhanden war. Diese Zellen können dann über den Rest des Zellzyklus bis in die nächste Replikationsrunde verfolgt werden, so dass die Dauer der Zellzyklusphasen bestimmt werden kann, ohne dass ein potenziell toxischer Zellzyklusblock induziert werden muss. Es ist auch möglich, die Expression von internen und externen Proteinen in den nachfolgenden Stadien des Zellzyklus zu bestimmen und zu korrelieren. Diese können verwendet werden, um die Zuordnung des Zellzyklusstadiums weiter zu verfeinern oder Auswirkungen auf andere zelluläre Funktionen wie die Checkpoint-Aktivierung oder den Zelltod zu bewerten.

Introduction

Die Beurteilung der Zellzyklus-Funktionen und Änderungen, die in den Zellen auftreten, während der Zellzyklusprogression ist grundlegend für das Verständnis vieler Aspekte der Biologie, insbesondere der Krebsbiologie. Viele Agenten in Entwicklung für die Behandlung von malignen Erkrankungen haben tief greifende Auswirkungen auf die Zellzyklusprogression oder Zelltod durch Zellzyklus abhängige-Mechanismen. Um Zellzyklus Dynamik oder Zellen in einer bestimmten Phase des Zellzyklus zu untersuchen, ist es üblich, Zellen zu synchronisieren. Synchronisationsverfahren kann jedoch nachteilige Auswirkungen auf die Zellen untersucht, die möglicherweise verwirrende die erhalten....

Protocol

Das hier beschriebene Protokoll verwendet die akute lymphatische Leukämie-Zelllinie NALM6 sondern kann auch auf andere Zelltypen angewendet werden.

1. Lösungen und Reagenzien

1. Komplettes RPMI
   1. Hinzuzufügen 56 ml fötales Kälberserum (FCS) und 5,5 ml von 200 mM L-Glutamin in einer 500 ml Flasche mit RPMI-1640-Medium.
2. BrdU-Stammlösung
   1. Vorbereitung 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS).
3. BrdU komplettem RPMI
   1. In 6,2 ul der BrdU-Stammlösung zu 10 ml vollständigem RPMI.
4. DNase-Lösung
   1. Bereiten Sie 1 mg DNas....

Results

Diese Methode kann verwendet werden, um eine Reihe von Informationen zu erhalten. Einige Anwendungen sind hier aufgeführt.

Ermittlung der Dauer des Zellzyklus

Die Zeit für die Zellen durch den Zellzyklus erforderlich ist, um Durchgangs bestimmen, werden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der BrdU puls geerntet. Die Intervalle zwischen den Bewertungen können auf die jeweiligen Zellen analysiert angepasst werden. Hämatopoetischen Zelllinien wurden stündli.......

Discussion

Die Fähigkeit, den Zellzyklus zu analysieren ist wichtig für das Verständnis der Krebsbiologie und den Wirkmechanismus beider Medikamente und Gene, die die Zellproliferation und das Wachstum beeinflussen. Zwar gibt es eine Vielzahl von Assays, welche angeblich die Zellproliferation zu messen, wird nur die Mehrheit ein Maß, daß die Anzahl Zellen vorhanden angibt. Dazu gehören Tests, die Zellzahl durch direkte Visualisierung und Zählen, Stoffwechselaktivität oder ATP-Konzentration zu messen. Der Hauptvorteil bei vielen di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences	552598	Enthält BrdU-Antikörper, 7-AAD und BD Cytofix/Cytoperm Puffer (bezeichnet als Fixationspuffer)
BD Cytoperm Permeabilisierungspuffer Plus	BD Biosciences	561651	als Permeabilisierungspuffer
BD Perm/Wash Puffer	BD Biosciences	554723	bezeichnet als Waschpuffer
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75  mm FACS Röhrchen	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA Durchflusszytometer	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1.640 ohne L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Fötales Rinderserum	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamin	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-Desoxyuridin	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150  cm2 belüftete Kolben	BD Biosciences	355001
Pipetten 25  ml	Greiner	760180
Aersol Pipetten 200  &Mikro; l	Interpath	24700
Aersol Pipetten 1  ml	Interpath	24800
Zentrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 Inkubator	Binder	C 150
AF488 Anti-Histon H3 Phospho (Ser10) Antikörper	Zellsignalisierung	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Kaninchen mAb	Zellsignalisierung	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3)	Kaninchen-mAb-Zell-Signalgebung	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128