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Silencing

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DOI:

10.3791/52849

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12. August 2015

 ,  , 
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Gen-Silencing durch siRNA stellt eine geeignete experimentelle Strategie dar, um BRCA2-abhängige biologische Funktionen mit unmittelbaren Auswirkungen auf ein besseres Verständnis der Krebsbiologie zu analysieren. Eine Methode zur effizienten Stilllegung von BRCA2 sowie das experimentelle Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Veränderungen der BRCA2-Proteinexpression durch Immunblotting in menschlichen Zelllinien werden vorgestellt.

Zusammenfassung

Inaktivierung des Tumorsuppressor-Proteins BRCA2 und seine Erkennung durch herkömmliche biochemische Analysen stellen eine große technische Herausforderung auf Grund der Größe des menschlichen BRCA2-Protein (etwa 390 kDa). Wir berichten Modifikationen von Standard siRNA-Transfektion und Immunoblotting Protokolle menschlichen BRCA2 endogenen BRCA2-Protein, bzw. in humanen epithelialen Zellinien auszuschalten und zu detektieren. Die wichtigsten Schritte sind, um eine hohe siRNA Transfektionsreagenz Verhältnis und zwei weiteren Runden von siRNA-Transfektion in demselben Experiment. Mit diesen und anderen Modifikationen an dem Standardprotokoll wir mehr als 70% Inaktivierung des menschlichen BRCA2 konsistent zu erreichen, wie durch Immunoblotting mit anti-BRCA2-Antikörpern beurteilt. Zusätzlich Denaturierung der Zelllysate auf 55 ° C anstatt der üblichen 70-100 ° C und anderen technischen Optimierungen des Immunoblotting Verfahren den Nachweis von intakten BRCA2-Protein selbst when sehr geringe Mengen an Ausgangsmaterial zur Verfügung stehen oder wenn BRCA2 Proteinexpressionsniveaus sehr niedrig sind. Effiziente Silencing von BRCA2 in menschlichen Zellen bietet eine wertvolle Strategie zur BRCA2-Funktion in Zellen mit intakten BRCA2, einschließlich Tumorzellen unterbrechen, um neue molekulare Signalwege und zellulären Funktionen, die durch pathogene BRCA2-Mutationen in Tumoren betroffen sein können, zu prüfen. Anpassung dieses Protokoll für die effiziente Schalldämpfung und Analyse von anderen "großen" Proteine ​​wie BRCA2 sollte leicht erreichbar sein.

Einleitung

Der BRCA2 (Brustkrebsanfälligkeit Gen-2) Gen kodiert für ein Protein, das Tumorsuppressor eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch die Regelung der Funktion des Rekombinaseenzym Rad51 1 spielt. BRCA2 ist auch in der Modulation der Transkription und an der Zellzyklussteuerung 2 in Verbindung gebracht. Keimbahnmutationen im BRCA2-Gen induzieren eine autosomal dominant Anfälligkeit für Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und Prostatakrebs bei Männern, als auch Veranlagung zu anderen Krebsarten 3,4. Trotz des erhöhten Risikos bei der Entwicklung von Krebs, BRCA2-Mutationen, die zu unterdrücken oder zu reduzieren BRCA2-Funktion können Krebszellen anfälliger für Chemotherapeutika, die DNA-Schäden verursachen 5-7 rendern. Sporadische Krebserkrankungen weisen eine niedrige Rate von BRCA2-Mutationen (<3%), obwohl reduzierte Mengen an BRCA2-Protein wurden bei einigen Krebsarten festgestellt, was darauf hindeutet, dass die BRCA2-Proteinkann während der Tumorgenese in sporadische Krebserkrankungen durch nicht-Mutationsabhängige Mechanismen 7,8 verloren. Somit ist es wichtig, BRCA2 Funktionen im Zusammenhang mit der Krebsbiologie sowie in anderen biologischen Systemen vollständig verstehen.

Ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Funktionen eines Gens in Säugetierzellen zu identifizieren, ist seine Expression unterdrücken. Als ein Beispiel hat Silencing BRCA2-Expression in einer Vielzahl von normalen Epithelzellen kürzlich zur Identifizierung eines neuartigen Funktion BRCA2 als Regulator der anoikis Beständigkeit ein wichtiger Schritt bei der Erfassung von Krebszell invasive und metastatische Fähigkeit 9 geführt. Gen-Silencing kann durch die Einführung in den Zellen entweder small interfering (si) RNA oder short hairpin (sh) RNA-Moleküle gezielt den spezifischen Gens erreicht werden. Die hohe Wirksamkeit der siRNA und seine Benutzerfreundlichkeit machen es die bevorzugte Werkzeug für Silencing-Experimente bei der Gewinnung neuer Erkenntnisse über kritische biologische Prozesse richtet einnd neue therapeutische Targets zu identifizieren. Jedoch kann effizient Zuschlags der Genexpression nicht für alle Gene leicht erreichbar sein und kann sehr unterschiedlich sein, je nach dem Zelltyp. Weil eine Abnahme der intrazellulären Proteinspiegel der relevanteste Phänotyp untersuchten, ist es wichtig, das Gen-Silencing durch Immunoblotting-Analyse des Genprodukts zu quantifizieren. In dieser Hinsicht stellt der BRCA2-Protein eine weitere Herausforderung: ein großes Protein (etwa 390 kDa), haben technische Schwierigkeiten bei herkömmlichen biochemischen Analyse, einschließlich Immunoblotting existieren.

Wir berichten hier über ein Protokoll für die effiziente Silencing von BRCA2 in humanen epithelialen Zelllinien und für die schnelle und erfolgreiche Detektion von BRCA2-Protein durch Immunoblotting-Analyse Knockdown optimiert.

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Protokoll

1. Bereiten siRNA-Lösungen

  1. Resuspendieren 5 nmol von verschlüsselten (Strg) und 5 nmol BRCA2 siRNA getrockneten Pellets in 100 ul RNase-freies Wasser (final siRNA-Konzentration: 50 um). Dies ist die siRNA Lager und muss bei -20 ° C in 10 & mgr; l Aliquots gelagert werden.
  2. Einen aliquoten von 10 & mgr; l von der siRNA Lager und fügen Sie 40 ul RNase-freies Wasser, das 10 uM siRNA Arbeitslösung zu erhalten. Diese Verdünnung ist bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
    HINWEIS: Die siRNA Arbeitslösung sollte nicht unterzogen Einfrieren / Auftauen mehr als 3 mal.

2. Seeding der Menschen Epithelzelllinien

  1. Entfernen des Wachstumsmediums aus menschlichen epithelialen Zellinien wachsen als Zellmonoschichten in Gewebekulturplatten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Die Zellen in der Platte einmal mit RT PBS (10 ml PBS für eine 100 mm-Platte) zu waschen.
  3. Um die Zellen von der Platte zu trennen,2 ml 0,25% Trypsin / 0,53 mM EDTA-Lösung und Inkubation 3-5 min, je nach Zelltyp.
  4. Vor dem Sammeln der abgelösten Zellen neutralisieren Trypsin durch Zugabe von 2 ml komplettem Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum enthielt.
  5. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube.
  6. Zentrifugieren der Zellen bei 320-330 g für 3 Minuten bei 4ºC in einem Schwingbecher-Rotor.
  7. Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml von Antibiotika-freiem Medium.
  8. Zähle die Zellen unter dem Mikroskop in einer Burker Kammer oder durch Verwendung eines automatischen Zählsystem nach den Anweisungen des Herstellers.
  9. Seed die Zellen in 6-Well-Platten auf etwa 80% konfluent nach 24 Stunden (0,5-1 x10 6 Zellen in 2 ml Medium für jede Vertiefung) sein. Optimale Zellennummer ausgesät werden können, abhängig von den spezifischen Zellen und der Wachstumsrate variieren.
    HINWEIS: Antibiotika im Medium Fügen Sie nicht an dieser Stelle, weil Antibiotika negativ mit der Effizienz der transfe störenction. Es ist sehr wichtig, dass die Zellen bei niedrigen Kulturpassagen (<10), um einen hohen Wirkungsgrad der BRCA2 siRNA-Transfektion zu erzielen.

3. Transfektion von Zellen mit siRNA

  1. Vierundzwanzig Stunden nach der Plattierung der Zellen, fahren Sie mit der ersten Runde der Transfektion.
    1. Verdünnen 6 ul Lipidbasis 10 siRNA spezifischen Transfektionsreagenz in 130 & mgr; l reduziert Serummedium.
    2. Verdünnen 3 ul von 10 uM siRNA (30 pmol) in 130 & mgr; l reduziert Serummedium.
    3. Kombinieren Sie die verdünnten siRNA mit der verdünnten Transfektionsreagenz und Inkubation für 5-10 min bei RT.
    4. Während der Inkubation, entfernen Sie das Medium aus den Zellen und 2 ml frischem Medium bei 37 ° C vorgewärmt (ohne Antibiotika).
    5. Fügen Sie 250 ul der siRNA-Transfektionsreagenz Komplexe zu den Zellen (dieser Betrag ist für einen einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte).
    6. Inkubieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 3776; C mit 5% CO 2.
  2. Nach 24 Stunden, weiter mit der zweiten Runde der Transfektion durch Wiederholung der Schritte 3.1.1-3.1.5 mit folgender Änderung für Schritt 3.1.2: verdünnen 5 ul von 10 uM siRNA (50 pmol) in 130 & mgr; l reduziert Serummedium.
    1. Die Zellen für 1-2 Tage bei 37 ° C vor der Analyse.
      HINWEIS: Zwei Runden Transfektionen und Verwendung eines Hoch siRNA / Transfektionsreagenz Verhältnis in der zweiten Runde sind unerlässlich, um hohe Effizienz der BRCA2-Silencing zu bekommen.

4. Lyse Zellen für Immunoblot-Analyse

  1. Ansetzen Lysepuffer mit PBS (pH 7,4), enthaltend 1% des nicht-ionischen, nicht-denaturierenden Detergens Octylphenoxypolyethoxyethanol, 5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumfluorid, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug / ml Leupeptin, 10 ug / ml Aprotinin. Halten Sie es auf Eis.
  2. Entfernen des Mediums von den Zellen und wAsche sie einmal mit kaltem PBS (2 ml / Vertiefung) in der Platte. Um jede PBS Verschleppung zu vermeiden, vollständig zu entfernen von der Platte.
  3. Zugeben von 200 & mgr; l Lysepuffer zu jedem Well.
    HINWEIS: Die Zellen müssen auch für andere Tests verwendet werden, trypsinize die Zellen wie in Schritt 2.1-2.6 beschrieben und Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Puffer / Medium gemäß der Anwendung eingesetzt werden.
  4. Drehen Sie vorsichtig die Platte gleichmäßig zu verteilen das Lyse-Puffer und Inkubation für 15 min bei 4 ° C auf einem Rotator.
  5. Sammeln des Zelllysats in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mit einem Zellschaber.
  6. Zentrifuge bei 17.900 xg für 25 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstands in ein neues Röhrchen.
  7. Messung der Proteinkonzentration unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Protein-Assay gemß den Herstelleranweisungen.

5. BRCA2 Immunoblotting-Analyse

  1. Bereiten Sie den Laufpuffer durch Verdünnung von 50 ml 20x Tris-Acetat SDS Lauf buffer (50 mM Tricin, 50 mM Tris-Base, 0,1% SDS, pH-Wert 8,24) mit 950 ml destilliertem Wasser.
  2. Vorbereitung der Probe wie folgt: in 15 ug Gesamt-Zelllysat wurden 5 ul 4x Probenpuffer, Lithiumdodecylsulfat bei pH 8,4, 2 ul 10x Probe Reduktionsmittels (0,5 M DTT) und Lyse-Puffer auf ein Endvolumen von 20 ul.
    Hinweis: Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von BRCA2 in normalen Zelllinien auch bei Verwendung einer geringeren Menge an Gesamtproteinen (bis auf 5 ug).
  3. Denaturieren Proben bei 55 ° C für 10 min.
    Hinweis: Es ist wichtig, auf 55 ° C zu verwenden. Seit BRCA2-Protein ist thermo 11 führen höhere Denaturierung Temperaturen in Einklang Verlust der intakten voller Länge (390 kDa) BRCA2-Protein.
  4. Die elektrophoretische Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt.
  5. Laden Sie die Proben und 10 ul mit hohem Molekulargewicht vorgefärbten Proteinstandard auf vorgefertigte Gel (Tris-Acetat 8.3%) und bei 120 V für ab laufenout 2 h 12. Stoppen Sie den Elektrophoreselauf bevor die 55 kDa blaue Markierung lässt die vorgefertigte Gel.
  6. Bereiten Sie den Transferpuffer mit 50 ml 20x Transferpuffer, 100 ml 100% Methanol und 850 ml Wasser.
  7. Aktivieren PVDF-Membran (0,45 um Porengrße) durch Einweichen in 100% Methanol für 5 min mit destilliertem Wasser gespült und in Transferpuffer äquilibriert für mindestens 5 min. Weichen Sie die Schwämme der Transfervorrichtung in Transferpuffer bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  8. Wenn die Elektrophoreselauf vorbei ist, montieren Sie die Sandwich in der Transferstapel in der folgenden Reihenfolge (von unten nach oben): Drei Schwämme in Transferpuffer gesättigt, ein 3MM Grade Blatt Papier in Transferpuffer, Gels, aktiviert PVDF-Membran, einer gesättigten 3MM Grade Blatt Papier in Transferpuffer gesättigt, drei Schwämme in Transferpuffer 13,14 gesättigt. Platzieren des Stapels in die Vorrichtung und das Transferproteine ​​bei 350 mA für 4 Stunden bei 4 ° C oder bei 180 mA über Nacht bei 4 ° C.
    HINWEIS: Being BRCA2 ein sehr großes Protein ist, ist es von entscheidender Bedeutung, um die Übertragungszeit von 1 h bis 4 h erstrecken oder über Nacht (wie durch den Hersteller und die meisten Übertragungsprotokolle vorgeschlagen), um eine vollständige Übertragung der hochmolekularen Proteine ​​zu gewährleisten. Darüber hinaus aufgrund der langen Transferzeit ist es wichtig, die Blotting in einem Kühlraum bei 4 ° C durchzuführen, um eine Überhitzung zu minimieren und zu erleichtern Sandwich-Demontage. Halbtrockentransfersysteme sind nicht gut für die Übertragung von großen Proteinen.
  9. Nach dem Transfer, waschen der Membran mit TBS, blockieren für 1 h bei RT in TBS-Tween 0,25% (TBS-T), das 5% fettfreie Trockenmilch und der Sonde über Nacht bei 4 ° C mit 30 & mgr; l anti-BRCA2 polyklonaler Kaninchen-Antikörper ( 200 ug / ml) in 9 ml TBS-T + 5% fettfreier Trockenmilch verdünnt [1: 300 (v / v) Verdünnung].
  10. Dreimal (jeweils 10 Minuten) mit TBS-T Waschen der Membran dann Inkubieren der Filter für 1 h mit 1 & mgr; l Meerrettichperoxidase-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper in 10 ml TBS-T + 5% fettfreier Trockenmilch. Danach waschen Sie die Membran drei Mal (jeweils 10 Minuten) mit TBS-T.
  11. Führen Immundetektion von ECL zu BRCA2-Proteins aufdecken Verwendung verstärkter Chemilumineszenz (ECL) Western Blotting Nachweisreagenz nach den Anweisungen des Herstellers. Visualisieren immunochemiluminescent Bands auf hochauflösende ECL-Filme.
  12. Zuführen Immunodetektion mit einem Antikörper für ein Housekeeping-Gen, wie β-Tubulin (55 kDa), auf dem gleichen Filter als Ladekontrolle durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörper gegen β-Tubulin einer Verdünnung von 1: 1000 (10 ul von Anti-Tubulin-Antikörper in 10 ml TBS-T + 5% fettfreie Trockenmilch) für 1 h bei RT. Waschen und Inkubieren sekundären Antikörper für BRCA2 (5,10-5,11) beschrieben, mit Ausnahme der Verwendung von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Maus anstelle von Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper.
  13. Erwerben Sie ein digitales Bild der mit immunochemiluminescent Bands beeindruckt Filme und die Bandenintensität von engagierten Bildanalyse-Software zu analysieren (zB., ImageJ).

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Ergebnisse

Bevor mit einer biologischen / biochemischen Test fortfahren, um die Wirkung der BRCA2-Unterdrückung auf Zellfunktionen zu untersuchen, ist der erste Schritt, um die Spezifität des Silencing unter Verwendung eines verschlüsselten siRNA (Non-Targeting-siRNA) Seite an Seite mit BRCA2 siRNA (1A bestätigen ). Es ist wichtig, eine zweite Runde von siRNA-Transfektion mit einem hohen siRNA / Transfektion Verhältnis durchzuführen, um einen hohen Wirkungsgrad der BRCA2-Silencing zu erhalten. In...

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Diskussion

Da Keimbahnmutationen des BRCA2-Gen zu einem erhöhten Risiko für verschiedene Krebsarten, einschließlich der weiblichen und männlichen Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom und 3,4, eine Reihe von Studien durchgeführt, um die biologische Funktion zu verstehen, des BRCA2-Protein. Die meisten dieser Studien sind genetisch-basierte vor allem auf technische Schwierigkeiten bei der Analyse eines Riesenprotein wie BRCA2. Die zum Dämpfen und Analysieren BRCA2-Protein-E...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch FIRB-Merit-Zuschüsse RBNE08YFN3_005 und RBNE08HWLZ_012 und das italienische Ministerium für Wirtschaft und Finanzen an das CNR für das Projekt "FaReBio di Qualità" unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BRCA2 siRNADharmaconL-003462-00SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNADharmacon  D-001810-10-05ON-TARGETplus Non-Targeting
Pool Lipofectamine RNAiMAX Reagenz Life Technologies13778075Transfektionsreagenz
OPTI-MEM I Reduziertes SerummediumLife Technologies31985-070Medium für Transfektionsverfahren
NuPAGE Tris-Acetat 3-8% 1,5 mm Gelvorgefertigt Life TechnologiesEA0378Gel für die Proteinelektrophorese
NuPAGE LDS Puffer für die Probe Life TechnologiesNP0007Reagenz für die Proteinelektrophorese
NuPAGE Probenreduktionsmittel (10x)Life TechnologiesNP0004Reagenz für die Proteinelektrophorese
NuPAGE AntioxidansLife TechnologiesNP0005Reagenz für die Proteinelektrophorese
HiMark Vorgefärbter ProteinstandardLife TechnologiesLC5699Vorgefärbter Marker für Gel Elektrophorese
XCell SureLoc Mini-Zelle  SystemLife TechnologiesEI0002Ausrüstung für die Proteinelektrophorese/-übertragung
NuPAGE Tris-Acetat SDS Running BufferLife TechnologiesLA0041Reagenz für Western Blotting
PVDF-MembranMilliporeIPVH00010Reagenz für Western Blotting
NuPAGE Transfer BufferLife TechnologiesNP0006-1Reagenz für Western Blotting
BRCA2 H-300 polyklonaler Kaninchen-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-83261:300 Verdünnung
Beta-Tubulin monoklonaler AntikörperSigma AldrichT4026-100UL1:1.000 Verdünnung
MagermilchpulverSigma Aldrich70166Reagenz für Western Blotting
Tween-20Sigma AldrichP1379Reagenz für Western Blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemilumineszenz-SubstratPierce Thermo Scientific34080/34096Chemilumineszenz-System
PNT1A-ZellenSIGMA Aldrich (für ECACC)95012614PNT1A menschliches, normales Prostata-Epithel immortalisiert mit SV40-Nthy-Zellen
SIGMA Aldrich (für ECACC)90011609Nthy-ori 3-1 Zelllinie human, Follikel-Epithelzellen der Schilddrüse
Zellproliferation Kit I (MTT)Roche11465007001Kit für Zellproliferations-Assays

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Schlagwörter

BRCA2 SilencingsiRNA TransfektionWestern BlottingProteinnachweisHerstellung von Zelllysatenhochmolekulare ProteineTumorsuppressor AnalyseEffizienz des Gen KnockdownsOptimierung des ImmunoblottingssiRNA Transfektionsverh ltnis

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