Methodenartikel

Gleichzeitig Ex vivo Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von In vivo Elektroretinogramm-System

DOI:

10.3791/52855

⸱

6. Mai 2015

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ex vivo ERG kann verwendet werden, um die elektrische Aktivität von Netzhautzellen direkt von isolierten intakten Netzhäuten von Tieren oder Menschen aufzuzeichnen. Wir zeigen hier, wie gängige in vivo ERG-Systeme für ex vivo ERG-Aufzeichnungen adaptiert werden können, um die elektrische Aktivität von Netzhautzellen zu zerlegen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein In-vivo-Elektroretinogramm (ERG)-Signal setzt sich aus mehreren überlappenden Komponenten zusammen, die von verschiedenen retinalen Zelltypen stammen, sowie aus Rauschen von extra-retinalen Quellen. Ex vivo ERG bietet eine effiziente Methode, um die Funktion von Netzhautzellen direkt aus einer intakten isolierten Netzhaut von Tieren oder Spenderaugen zu präparieren. Darüber hinaus kann ex vivo ERG verwendet werden, um die Wirksamkeit und Sicherheit potenzieller Therapeutika an Netzhautgewebe von Tieren oder Menschen zu testen. Wir zeigen hier, wie kommerziell erhältliche in vivo ERG-Systeme verwendet werden können, um ex vivo ERG-Aufzeichnungen von isolierten Mausnetzhäuten durchzuführen. Wir kombinieren die Lichtstimulations-, Elektronik- und Heizeinheiten eines Standard-In-vivo-Systems mit einem speziell entwickelten Probenhalter, einem schwerkraftgesteuerten Perfusionssystem und einer Abschirmung gegen elektromagnetisches Rauschen, um rauscharme Ex-vivo-ERG-Signale gleichzeitig von zwei Netzhäuten mit der im kommerziellen In-vivo-Markt enthaltenen Erfassungssoftware aufzuzeichnen Systeme. Darüber hinaus zeigen wir, wie diese Methode in Kombination mit pharmakologischen Behandlungen eingesetzt werden kann, bei denen bestimmte ERG-Komponenten entfernt werden, um die Funktion bestimmter retinaler Zelltypen zu entschlüsseln.

Einleitung

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Elektroretinogramm (ERG) ist eine gut etablierte Technik, die verwendet werden können, um die elektrische Aktivität der Netzhaut durch Licht ausgelöst aufzuzeichnen. Die ERG-Signal wird hauptsächlich durch Spannungsänderungen durch radiale Ströme verursacht (entlang der Achse der Photorezeptoren und bipolare Zellen) in der Widerstands Extrazellularraum der Retina fließenden Strom erzeugt wird. Das erste Signal ERG wurde 1865 von Holmgren von der Oberfläche eines Fischauge 1 aufgezeichnet. Einthoven und Jolly 1908 2 unterteilt den ERG Reaktion auf das Auftreten von Licht in drei verschiedenen Wellen, a- genannt, B- und C-Wellen, die jetzt bekannt sind, um im Wesentlichen die Aktivität von Photorezeptoren widerspiegeln, ON bipolaren Zellen und Pigmentepithel Zellen, die jeweils 3-8. ERG aus den Augen der narkotisierten Tieren oder Menschen (in vivo) mit Mikroelektroden aufgezeichnet werden, aus isolierten Augen Vorbereitung 9, in isolierten intakten Netzhaut (ex vivo) 3,10-15 oder über bestimmte Netzhautschichten (lokaleERG) 4,16. Von diesen ist die in vivo ERG derzeit die am häufigsten verwendete Methode, um die Funktion der Retina zu bewerten. Es ist eine nicht-invasive Technik, die für diagnostische Zwecke verwendet werden kann oder um das Fortschreiten von Netzhauterkrankungen bei Tieren oder Patienten zu folgen. , In-vivo-ERG-Aufnahmen erzeugen jedoch eine komplizierte Signal mit mehreren überlappenden Komponenten, die oft von äußeren Augen physiologische Geräusche (zB Atmung und Herztätigkeit) kontaminiert.

Lokale ERG kann verwendet werden, um das Signal über bestimmte Schichten der Netzhaut aufzuzeichnen, aber es ist die invasive und hat die niedrigste Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu den anderen ERG Aufzeichnungskonfigurationen. Lokale ERG ist auch technisch anspruchsvoll und erfordert teure Ausrüstung (zB Mikroskop und Mikromanipulatoren). Transretinal ERG von der intakten, isolierten Netzhaut (ex vivo ERG) bietet einen Kompromiss zwischen in vivo und lokale ERG Methoden, die stabil und high SNR Aufnahmen von intakter Netzhaut von Tieren oder Menschen 17. Vor kurzem wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt, um Stäbchen und Zapfen Photorezeptorfunktion in Säugetieren, Primaten und menschliche Netzhaut 18-20 studieren. Darüber hinaus aufgrund der Abwesenheit von Pigment-Epithel in der ex vivo Retina, die positive C-Wellenkomponente des ERG-Signal entfernt wird und ein bekannter negativer langsamen PIII-Komponente ist in den ex vivo-Aufnahmen zeigte. Die langsame Komponente PIII wurde gezeigt, dass aus den von Müller Gliazellen in der Retina 21-23 stammen. Somit könnte ex vivo ERG Verfahren auch verwendet werden, um Müller-Zellen im intakten Netzhaut zu untersuchen. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass ex vivo ERG-Aufnahmen verwendet werden könnten, um die Konzentration von pharmakologischen Mitteln auf der Netzhaut 24 zu messen und testen Sie die Sicherheit und Wirksamkeit von Arzneimitteln 25-27 werden.

Mehrere Handels in vivo-Systemen zur Verfügung stehen undin vielen Laboratorien, die nicht unbedingt über umfangreiche Elektrophysiologie Hintergrund verwendet. Im Gegensatz dazu wurden ex vivo-Geräte nicht bis vor kurzem 17 und als Folge nur wenige Labors werden derzeit nutzen diese leistungsfähige Technik zur Verfügung. Es wäre von Vorteil, um unser Wissen über Netzhaut Physiologie und Pathologie voranzubringen und neue Therapien für Krankheiten zu entwickeln blend ex vivo ERG-Aufnahmen zur Verfügung, um weitere Labors zu machen. Wir zeigen hier eine einfache und erschwingliche ex vivo ERG Vorrichtung 17 und zeigen, wie sie in Verbindung mit mehreren im Handel erhältlichen in vivo ERG-Systeme verwendet werden, um Stab- und Kegel-vermittelten Signal aufzuzeichnen (a- und b-Wellen) und die Funktion Müller-Zellen (langsam PIII) aus intakten Wildtyp-Maus Netzhaut.

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Protokoll

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Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Studies Committee an der Washington Universität zugelassen.

1. Einrichten der Perfusion und Probenständer

  1. Bereiten Lösung für Netzhautblutung frisch am Tag des Experiments. Verwenden Sie destilliertes und deionisiertes Wasser. Verwenden Sie eine der folgenden drei Lösungen.
    1. Bereiten bicarbonathaltige Ames-Lösung (1 l): 1 Flasche Ames 'Medien und 1,9 g NaHCO 3,
    2. Vorbereitung Locke-Lösung (in mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na-Succinat, 0,5 Na Glutamat, 0,02 EDTA und 10,0 Glucose, 0,1% MEM-Vitamine und Aminosäuren Säuren
    3. Vorbereitung HEPES-gepufferter Ringer-Lösung (in mM): 133,3 NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl 2, 1,0 CaCl 2, 10,0 Glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHeingestellt auf 7,5 ~ 5,8 ml 1 M NaOH, fügen 0,72 g / L Kulturmedium Leibovitz L-15. Verwenden Sie 20 bis 50 & mgr; M DL-AP4 und 50 bis 100 & mgr; M BaCl 2, um den Photorezeptor Antwort mit jeder Perfusion Medien zu isolieren.
  2. Vorbereitung Lösung für Elektroden 28 (in mM): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 3 HEPES, 0,01 EDTA und pH-Wert auf 7,4 bis 7,5 mit NaOH. Elektrodenlösung kann bei Raumtemperatur mehrere Monate gelagert werden.
  3. Bereiten Sie und testen Sie den Probenhalter.
    1. Kleben Sie schwarz / grau Filterpapier auf der Oberseite der Kuppeln der untere Teil des Probenhalters (siehe Abbildung 1A). Verteilt zweikomponentigen 5 min Epoxidkleber vorsichtig um die Kanten der flachen Oberseiten der Dome. Wenn nötig, machen Sie es unter Dissektionsmikroskop.
    2. Warten Sie, bis der Leim ist fast trocken (ca. 4 min) und drücken Sie die Filterpapier auf den Kuppeln unter Verwendung einer Flachs Artikel. Kleber Filterpapier mindestens einen Tag vor dem Experiment. DieFilterpapier kann mehrfach verwendet werden, sollten aber nach einem Monat der Aufnahmen ersetzt. Verwenden Sie 70% Ethanol zum Kuppeln sorgfältig von jedem Kleberrückstand reinigen vor der Installation der Ersatzpapier.
    3. Füllen Sie die Elektrode Kanäle mit Elektrodenlösung versucht, alle Luftblasen zu vermeiden, und schrauben Pelletelektroden mit einem Gewindeadapter in die Elektrodenkanäle eingeschlossen (siehe 1A und B). Verbinden Sie die oberen und unteren Teile des Probenhalters mit vier Schrauben und füllen Sie die Perfusion Linien mit Elektrodenlösung.
    4. Den Widerstand und die Spannung zwischen den Leitungen jedes Elektrodenpaar mit einem Multimeter (1B). Widerstand sollte unter 100 & omega; k und die Spannung unter 10 mV, wenn die Kanäle sind blasenfrei und die Elektroden in einem guten Zustand sind sein.
  4. Gießen Sie 400-700 ml Perfusion Medien in der Glasflasche. Getrennte und weitere 300 ml in der Präparation der Netzhaut und s verwendet werdenriss es in einem Kühlschrank. Stellen Sie den Infusionsschlauch in den Wärmetauscher-Block und setzen Sie den vorgeheizten Block auf der Heizplatte (siehe Abbildung 1D).
  5. Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe, die hat Verbindungen zu 2 / O 2 Gas Co (wenn Ames 'oder Lockes verwendet wird) und für Infusionsschlauch (siehe Abbildung 1D). Heizen Sie die Flasche mit den Medien, um 37 o C und auf der Heizplatte oder auf der Oberseite des Lichtstimulationseinheit in einem Wasserbad auf 37 festgelegt - 39 o C 17.
    1. Prime die Perfusion Linien durch Perfusion mit Medium füllen sie das schwerkraftgetriebenen Strömung zu initiieren.
      1. Im LKC-System, stellen Sie die Flasche auf der Oberseite des Stimulators Einheit 17, um eine signifikante Gravitationsfluss, wird dann durch Durchflussregler, ohne durch die Senkung Ebene der Perfusionslösung in der Flasche während des Experiments beeinflusst angepasst werden.
      2. In Ocuscience System, legen Sie die perfusion Flasche innerhalb des Faradayschen Käfigs, um das Rauschen zu minimieren und legen lange Perfusion Ausgangsleitungen von dem Probenhalter (siehe Schritt 2.8) und unterhalb des Niveaus des Probenhalters (und die Perfusion Flasche) zur Schwer Antrieb der Lösung zu erhöhen. Schirmen diese Ausgangsleitungen und die Abschirmung auf Masse des Verstärkers, um die Kopplung des elektromagnetischen Störungen auf das ERG-Signal zu vermeiden.
  6. Stellen Sie die Durchblutung und zum 3 - 5 ml / min unter Verwendung von Durchflussreglern. Schließen Sie 5% CO 2/95% O 2 Gas aus einem Zylinder mit der richtigen Regler und stellen Sie die Durchflussrate zu stabilen Blasenbildung der Medien in der Flasche durch einen Luftstein zu gewährleisten.

2. Probenvorbereitung

  1. Montieren Sie sauber und scharf Dissektionsinstrumente einschließlich gerader Blattmikroschere, eine oder zwei 45 o Pinzette, Rasierklinge und ein rechteckiges Stück Filterpapier.
  2. Pour etwa 200 ml kaltem Perfusion Lösung in eine große Petrischale, so dass der gesamte untere Teil des Probenhalters (einschließlich der Hauben) können in die Lösung eingetaucht werden. Dieser Schritt wird wichtig, wenn die Montage der Netzhaut auf den Kuppeln (siehe Schritt 2.6). Obwohl einige Lösungen wurden entwickelt, um mit Carbogen (5% CO 2/95% O 2) gesättigt werden, ist dies nicht wesentlich für die Zwecke Dissektion und war nicht in der hier beschriebenen Experimente durchgeführt.
  3. Für ein typisches Experiment, halten Tiere in 12/12 Stunden hell / dunkel-Zyklus und dunkel passen sie für 6-12 Stunden vor den Aufnahmen. Euthanize das Tier durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte unter dim rotes Licht und alles tun, die folgenden Verfahren, in dim rot oder IR-Licht (Verwendung zB Rotfilter vor dem Mikroskoplichtquelle).
    1. Ziehen Sie die Augen, die von mit einer Pinzette und setzen Sie sie in den Medien. Platzieren Sie ein Auge in einer Zeit auf einem kleinen Stück Papier (zB einige regelmäßige Filterpapier) und machen soleuchtet etwa auf dem Niveau der Ora serrata, während das Auge mit einer Pinzette (dies ist außerhalb der Lösung hier getan) hält.
  4. Schneiden Sie entlang der Ora serrata (oder näher am Äquator des Auges) mit Mikroschere und entfernen Sie die Hornhaut und die Linse. Setzen Sie die Augenmuschel in der kalten Medien im großen Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Auge.
  5. Schneiden Sie einen kleinen Schnitt von der Spitze der Augenmuschel zum Sehnerv hin, indem sie die Schere zwischen der Netzhaut und Lederhaut, um die Netzhaut so intakt wie möglich zu halten. Fassen Sie die Lederhaut von beiden Seiten des Einschnitts durch Verwendung von zwei Pinzetten und die Pinzette ziehen voneinander entfernt, um die Netzhaut zu lösen.
    1. Schneiden Sie den Sehnerv und versuchen, die Netzhaut mit einem Minimum an physischen Kontakt mit dem distalen Oberfläche zu isolieren. RPE wird meist automatisch lösen sich von der Netzhaut während der Präparation Prozess. Es ist wichtiger, um mechanische Störungen der Netzhaut, als die Vorform zu vermeidendissection schnell, in der Regel die Netzhaut kann mindestens 30 min in der Lösung inkubiert werden, ohne signifikante Auswirkungen auf die Antworteigenschaften.
  6. Montieren Sie die Netzhaut auf die Kuppeln des Probenhalters (Abbildung 1c). Tauchen Sie den unteren Teil des Probenhalters in der Petrischale mit den Netzhäute präpariert. Gleiten die Retina, Photorezeptorseite (die konvexe Oberfläche des isolierten Netzhaut) nach oben, oberhalb der Kuppel und heben Sie den Probenhalter, so dass der Netzhaut legt auf dem Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Netzhaut.
  7. Trocknen Sie die Halteplatte vorsichtig, um elektrische Übersprechen zwischen der Netzhaut sowie Rausch- und Signal Rangieren zu verhindern. Probenhalter ist mit O-Ringen um den unteren Teil Kuppeln verschüttet wird zwischen der unteren und oberen Teile des Halters zu verhindern als auch die elektrische Isolierung der Photorezeptor und die Ganglienzellseiten der einzelnen Netzhaut zu helfen. Befestigen Sie den oberen Teil der Halterung mit den vier Schrauben (siehe Abbildung 1B) und füllen Sie die Perfusion Kanäle mit Perfusionslösung unter Verwendung einer Spritze und eine Nadel.
  8. Übertragen der Probenhalter neben dem Wärmetauscherblock und Verbinden der Eingangs- und Ausgangs Perfusionsleitungen zur Probenhalterung (Figur 1D). Die Elektroden an der ERG-Verstärker (oberen Elektroden zu verbinden, um den Boden / Minus-Pin in den Verstärker) und befestigen Sie den Stimulator / Steuereinheit auf dem Probenhalter, indem Sie einen Adapter oder schieben Sie das Heizkissen in den Stimulatoreinheit je nachdem, welche in vivo ERG System verwendet wird.

3. Recordings

  1. Konfigurieren Sie die Verstärker und Reiz von Einstellungen mithilfe von Software der in vivo-System. Stellen Sie den Akquisitionsfrequenz auf einen Wert zwischen 1 und 10 kHz und eine Tiefpaßfilterung bis 300 Hz. Verwenden Sie keine Hochpassfilterung. Verwenden Sie 60 Hz (oder 50 Hz in Europa) Notch-Filter, falls erforderlich.
  2. Nehmen Sie Grundlinie ohne Lichtstimulation und Witzh dim Stimulation (z. B. grünes Licht von -35 dB oder 0,3 mCd sm -2), die für eine gute elektrische Verbindung zwischen den Elektroden und der Netzhaut Probe zu testen. Warten Sie 10 bis 20 Minuten vor dem Beginn der Datenerfassung, so dass Netzhauttemperatur und Funktion zu erreichen einen stabilen Zustand.
    1. Wählen Reizparameter nach einem bestimmten Experiment und starten Sie die Datenerfassung. ZB verwenden grünes Licht von -40 bis 0 dB oder 0,1 bis zu 1.000 mCd sm -2 für eine scotopic Reaktion Familie. Verwenden Sie etwa 2 bis 3 log-Einheiten heller Blitze in photopischen Aufzeichnungen, wo Stangen müssen von Hintergrundlicht unterdrückt werden (3-30 Cdm -2) oder eine Sonde Flash (etwa 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, siehe Abbildung 3).
    2. Beachten Sie jedoch, dass die exakte Lichtintensitätswerte könnten etwas abhängig von Ihrem System-Kalibrierung und experimentellen Bedingungen sein. Als Faustregel gilt, Stufenstärken aufgeschlüsselt nach 5-10-fache im Vergleich zu in vivo Aufnahmen bei der Verwendung von grünem Licht 17. Eine schwarze Abdeckung mit Öffnungen oberhalb der Netzhaut (im Gewerbeadaptersystem im Lieferumfang enthalten) kann verwendet werden, um die Lichtstreuung in den Probenhalter zu reduzieren und eine homogene und gleich Stimulation beider Netzhäute von der Ganzfeld Sphäre der kommerziellen in vivo Systeme werden.
      HINWEIS: Bei sich von dunkeladaptierten Retina, die Intensitäten der Testwallungen bei einem typischen Experiment Bleich nur ein vernachlässigbarer Anteil des Pigments verwendet wird, so dass das Fehlen von RPE getriebenen Regeneration kein Thema ist. Darüber hinaus hat es sich bereits gezeigt, dass Konus Pigment Regeneration noch Platz in der isolierten Netzhaut über den Müller Zelle visuellen Zyklus 20 zu nehmen.
  3. Wie Versuche dauern typischerweise 30 min bis zu mehreren Stunden, überwacht die Basisliniendrift, Geräuschpegel und Reaktionsstabilität während des Versuchs als Änderungen könnten diese technischen Probleme anzugeben.
    HINWEIS: Erhöhter Schall oder Abnahmed Antwortamplituden kann darauf hindeuten, Luftblasen in den Perfusion oder Elektrodenkanäle, zu niedrige oder hohe Temperatur, Lösung Leck / Spill oder Verschiebung der Netzhaut.

4. Reinigung

  1. Nehmen Sie den Probenhalter aus den Perfusion Linien, öffnen Sie sie und spülen Sie die Netzhaut von dem Filterpapier. Entfernen Sie die Elektroden und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser (nicht mit Ethanol). Reinigen Sie den Probenhalter (einschließlich der Perfusions-Kanäle) mit Ethanol und / oder destilliertes Wasser. Flush Infusionsschlauch vorsichtig mit> 70% Ethanol.
  2. Spülen Sie die Durchblutung Flasche mit destilliertem Wasser (keine Reinigungsmittel). Ethanol kann auch verwendet werden, um die Flasche zu reinigen.

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Ergebnisse

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Wir nahmen Flash Antworten von dunkeladaptierten Wildtyp (WT) C57BL / 6-Maus Netzhaut, indem Sie die oben beschriebenen und durch die Verwendung verschiedener Standard Perfusionslösungen (Abbildung 2) in Abbildung 1 veranschaulicht experimentelle Protokolle. Die Antwortwellenformen und Kinetik sowie Empfindlichkeit der Stäbchen-Photorezeptoren erschien ähnlich in Ames 'und Lockes Medien (2A und B). Auf der anderen Seite, unter HEPES gepufferte Ringer-Lö...

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Diskussion

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Wir zeigen hier die entscheidenden Schritte zur gleichzeitigen Gewinnung hochwertiger ex vivo ERG Aufnahmen aus zwei isolierten Maus Netzhaut durch die Verwendung in vivo ERG Systemkomponenten zusammen mit einem Ex-vivo-ERG-Adapter. In dieser Studie haben wir die beiden perfundiert Retinae von dem Tier mit der gleichen Lösung (entweder Ames, Locke oder Ringer), aber es ist auch möglich, jeden Netzhaut mit einer anderen Lösung, zB perfundieren, Drogentestzwecke. Die wichtigsten S...

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Offenlegungen

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Washington University in St. Louis hat einen Lizenzvertrag mit Xenotec, Inc. und können eine Lizenzgebühren aus dem Verkauf der ex vivo-Adapter zu erhalten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse EY019312 und EY021126 (VJK), EY002687 an die Augenklinik und Visual Sciences an der Washington University unterstützt und von der Forschung zur Verhütung Blindheit.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
In vivo ERG-SystemOcuScienceHMsERGwww.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG-SystemLKC TechnologiesUTAS-E 3000www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo AdapterOcuScienceEx VIVO ERG adapterwww.ocuscience.us/id107.htmlDissektionsmikroskop
North Central InstrumentsLeica M80Kann jede Marke
IR-EmitterOpto Diode Corp. verwenden.OD-50Lwww.optodiode.com
Prowler NachtsichtgeräteB.E. Meyers Electro OpticsD4300-IProdukt in Militärqualität.
RotfilterRosco LaboratoriesRoscolux #27 Medium RotKann anstelle des IR-Systems verwendet werden
Roter ScheinwerferOcuScienceERGX011www.ocuscience.us/catalog/i29.html
MicroscissorsWPI, Inc.500086www.wpiinc.com/
Dumont Pinzette #5WPI, Inc.14101
RasierklingenElektronenmikroskopieWissenschaften 72000www.emsdiasum.com
ScaleMetler ToledoAB54-S/FACTKann jede Marke verwendenpH-Messgerät
und ElektrodeBeckman CoulterpHI 350Kann jede Marke verwenden
NaClSigma-AldrichS7653<a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Kann jede Marke verwenden
KClSigma-Aldrich60129Kann jede Marke verwenden
MgCl2Sigma-Aldrich630201.0 M Lösung
CaCl2Sigma-Aldrich211141.0 M Lösung
EDTASigma-Aldrich431788Kann jede Marke
verwenden HEPESSigma-AldrichH3375Kann jede Marke
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS6297Kann jede Marke
verwenden Ames MediumSigma-AldrichA1420Kann jede Marke
verwenden BaCl2Sigma-AldrichB0750Kann verwenden jede Marke
DL-AP4Tocris Bioscience101Kann jede Marke
Bernsteinsäure DinatriumsalzSigma-Aldrich224731Kann jede Marke
verwenden L-GlutaminsäureSigma-AldrichG2834Kann jede Marke
verwenden D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG7528Kann jede Marke
verwenden Leibovitz Kulturmedium L-15Sigma-AldrichL4386Kann jede Marke verwenden
MEM-VitamineSigma-AldrichM6895
MEM AminosäurenSigma-AldrichM5550
CarbogenAirgasUN31565% CO2
verwenden verwenden

Referenzen

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