Die Metastasierung von Krebs ist die Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle. Wir bieten eine eingehende Beschreibung der unser Überleben Chirurgie Methodik für die Festlegung eines "Patienten-like" orthotopen syngenen Mausmodellsystem zur Untersuchung der Mechanismen der Metastasierung bei soliden Organtumoren.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein "Patient-Like" Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Mehrzahl der krebsbedingten Todesfälle wird durch die Metastasierung des Krebses und nicht durch den Primärtumor selbst verursacht. Die zugrundeliegenden Mechanismen der Krebsmetastasierung sind jedoch noch unklar. Tiermodelle sind unerlässlich, um die Mechanismen aufzuklären und neue Strategien zur Behandlung von metastasierenden Krebserkrankungen zu evaluieren. In dieser Arbeit wird eine detaillierte Beschreibung eines "patientenähnlichen" orthotopen syngenen Mausmodells zur Erforschung der Mechanismen der Metastasierung von Tumoren solider Organe gegeben. Die überlebenschirurgische Implantation von hepatozellulären Karzinomzellen der BNL 1ME A.7R.1 Maus direkt in die Leber (das Ursprungsorgan) des Inzucht-Wildtyp-immunkompetenten Labormausstamms BALB/c wird beschrieben. Der Erfolg und die Reproduzierbarkeit dieser Methodik empfehlen einen breiten Einsatz bei der Aufklärung der biologischen Mechanismen der Metastasierung von Krebs in soliden Organen.
Einleitung
Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist eine der tödlichsten Krebsarten, mit schlechter Prognose und geringer Lebenserwartung. Fast alle krebsbedingten Todesfälle sind auf die metastasierende Ausbreitung der Krankheit vom Ursprungsorgan auf weitere entfernte Organezurückzuführen 2-6. Die HCC-Progression ist ein komplexer Prozess. Daher kann sich die Möglichkeit, die Tumormikroumgebung, die natürlicherweise in metastasiertem HCC vorkommt, in Tiermodellen zu modellieren, als erfolgreicher und nützlicher Weg erweisen, um relevante Mechanismen beim Menschen aufzudecken. 7Leider sind die Mechanismen der Krebsmetastasierung noch weitgehend unklar. Daher besteht die Notwendigkeit, Tiermodelle zu etablieren, die es uns ermöglichen, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von Metastasen von Krebserkrankungen wie HCC3,5 aufzuklären.
Mausmodellsysteme sind ein sehr nützlicher Ansatz zur Beschreibung von Mechanismen und zur Bewertung neuartiger Strategien zur Behandlung von metastasierten menschlichen Krebserkrankungen5,8. Die verschiedenen Mausmodellsysteme, die es derzeit gibt, sind ein Beweis für die Bemühungen der Forscher, die Komplexität der Krankheit korrekt abzubilden5,8,9.
Ogunwobi und Kollegen haben kürzlich einen überlebenschirurgischen Ansatz verwendet, um die Etablierung eines neuartigen orthotopen syngenen Mausmodells für die Untersuchung der Metastasierung bei HCC3 zu demonstrieren. Ihre Arbeit etablierte ein "patientenähnliches" Mausmodell, das Merkmale von aggressiven und metastasierten HCCs rekapituliert3. Darüber hinaus zeigten sie, dass dieses Mausmodellsystem zur Untersuchung der Biologie zirkulierender Tumorzellen verwendet werden kann und dass dies das Potenzial birgt, neue Einblicke in die Mechanismen der Krebsmetastasierung zu gewinnen3.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Methodik detailliert zu beschreiben, die bei der Etablierung dieses "patientenähnlichen" orthotopen syngenen Mausmodells der HCC-Metastasierung3 verwendet wurde. Es wird die Methodik beschrieben, wie BNL 1ME A.7R.1 Maus-HCC-Zellen direkt in die Leber (das Ursprungsorgan) des Inzucht-Wildtyp-Immun-kompetenten Labormausstamms BALB/c3 mittels Überlebenschirurgie implantiert werden können. Im Gegensatz zu anderen Maus-Xenotransplantat-Tumormodellen, bei denen menschliche Tumorzellen in immundefiziente Mäuse implantiert werden, ist dieses System syngen und eignet sich daher für die Untersuchung der Rolle des Immunsystems bei der Tumormetastasierung3,5,8. Dieser Ansatz wird wahrscheinlich breite Anwendung finden, um die Mechanismen der Metastasierung bei Krebserkrankungen solider Organe zu untersuchen.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Ethics Statement
Alle tierexperimentellen Studien wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) des Hunter College der City University of New York zugelassen.
Anmerkung: acht BALB / c-Mäuse wurden in diesem experimentellen Verfahren verwendet. Fünf BALB / c-Mäuse wurden mit 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus hepatozelluläre Karzinomzellen implantiert werden, um die primären Tumoren zu erzeugen. Drei BALB / c-Mäuse keine Implantationen wurden als Kontrollen verwendet. BNL 1ME A.7R.1 ist eine murine Leberzellkarzinom-Zelllinie, die durch chemische Umwandlung aus dem murinen nicht-tumor Hepatozyten-Zellinie BNL CL.2 abgeleitet wurde. BNL 1ME A.7R.1 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten.
1. Pre-Chirurgie
- Stellen Sie sicher, dass Mäuse, für alle Überlebens Operationen sind gesund. Um sicherzustellen, dass Mäusen gesund sind, inspizieren Anzeichen von Austrocknung durch Ausbeulung der Haut. Verwenden Sie keine Mäuse, die mit jedem Anzeichen von Krankheit oder distress in diesen Experimenten.
- Wiegen Mäusen, um sicherzustellen, sie sind nicht untergewichtig. Sicherzustellen, dass das Gewicht mindestens 16-20 Gramm.
- Vorbereitung 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen für die Implantation per Maus:
- Saugen Sie Medien aus einem 10 ml 60% - 70% konfluente Zellkulturschale BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen. Waschen zweimal mit 5 ml PBS. 2 ml Trypsin, in die Schale und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit Luft und 5% CO 2 für 5 min.
- Anschließend trypsiniert Pipette 10 ul Zellen in einer manuellen Zählkammer zur Zellzählung unter dem Mikroskop bei einer Vergrößerung von 10x. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in den vier großen Eckquadrate gefunden und multiplizieren Sie den Verdünnungsfaktor durch die Gesamtzahl der Zellen. Dann dividieren durch die Anzahl der Quadrate gezählt und mit 10 multiplizieren, 6 für die Zellkonzentration (Zellen pro ml).
- Mit den Programmen, sammeln 5 Millionen Zellen pro Maus in sterile1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Beschriften von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Resuspendieren der 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen in 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Bewahren Sie diese Zellen auf Eis, bis die Implantation in der Chirurgie.
- Führen Sie Aktivitäten für die Vorbereitung von Mäusen für die Operation, wie Narkose und Haarschneide weg vom sterilen Geräten und Materialien, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Induzieren Narkose bei Mäusen durch Inhalation von Isofluran mit einem Isofluran Verdampfer zusammen mit Sauerstoff bei einer konstanten Konzentration Flussrate von 1 l pro min (ca. 2,1%). Anmerkung: Das System ist selbstständig und enthält eine Präzisions-Verdampfer, eine Sauerstoffversorgung und einen Aktivkohlebehälter, die mit einem Atmungskreislauf für Gas / Anästhetikum Abfangen benötigte verknüpft ist.
- Sicherzustellen, dass der Anästhesie geeignet ist, um das Tier unterzogen Schmerzen während der Operation zu verhindern. Führen Zehen Prise und beobachten Tier für nicht-Verantsiveness Anästhesie zu bestätigen.
- Zu dieser Zeit, schalten Sie die Ventilleitung, Siegel an die Box und offen für die Nasenkegel.
- Sobald die Maus betäubt, tragen Sie eine kleine Menge einer Augensalbe auf die Hornhaut als vorbeugende Maßnahme vor dem Austrocknen und Schäden.
- Anschließend bewegen Sie den Tier zum Vorbereitungsbereich, mit dem Nasenkegel ordnungsgemäß aufgestellt und angeschlossen (zur Aufrechterhaltung der Narkose). Bereiten Sie die Website des chirurgischen Einschnitt für die Chirurgie durch Depilation an diesem Vorbereitungsbereich.
- Sicherzustellen, dass der Bereich der Operation ist an einer Stelle frei von anderen Aktivitäten.
- Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsoberfläche stabil und angemessen desinfiziert, unverschmutzten und aufgeräumten vor der Operation ist. Legen Sie eine sterile Stück Leinen oder OP-Tray darüber.
- Stellen Sie sicher, dass das Operationsfeld sind nur verfügbar für Personen, die Durchführung der Operation. Stellen Sie sicher, dass die chirurgische Raum wird gereinigt und mit einem geeigneten Reinigungsmittel gewischt und mit einem geeigneten Desi gesprühtctant.
- Stellen Sie sicher, dass es auch von Türen und Fenstern, wie Luftströmungen positioniert kann Staub, was zu Kontamination der Website zu verbreiten.
- Führen Sie die Überlebenszeit der Operation mit sterilen Instrumenten. Entweder genießen Instrumente in einem Desinfektionsmittel nach Empfehlung oder Autoklav-Herstellers. Verwenden Sie sterile Grundversorgung, die betriebsbereit sind.
- Separate Instrumente nach Funktion, um zu verhindern Verunreinigung der sterilen Bereichen.
- Rasur ungefähr 1 Zoll rund um die Seite des Einschnitts (Mittelschnitt), um die Leber des Tieres gelangen. Entfernen der Haare von dem Tier entfernt von der Stelle der Operation.
- Nach der Rasur, reiben Sie die Fläche mit einem seifigen Desinfektionsmittel (betadine chirurgische Macchia) und waschen Sie die überschüssige Desinfektions weg mit sterilem PBS-Lösung. Führen Sie dies mehrmals, mit dem gesamten Prozess Peeling Dauer ca. 5 min. Entfernen und die verwendeten Handschuhe verworfen.
- Danach, um Schutzkleidung zu ändern, wie Surgical Kleid, Gestrüpp top und Gesichtsmaske. Als nächstes desinfizieren Hände mit der richtigen Peeling-Lösung vor, die sich OP-Handschuhe. Anmerkung: Dies ist ein notwendiger Schritt Abwurf und Verunreinigung der Operationsstelle mit möglichen Verunreinigungen zu verhindern.
2. Chirurgie
- Geben Sie eine externe Wärmequelle für Wärme während der gesamten Dauer der Anästhesie. Das Tier kann eine Unterkühlung zu erleben, weil Anästhesie verursacht Störungen der Thermoregulation; Daher halten die Körpertemperatur.
- Legen Sie die Maus auf dem Rücken in der gesamten Operation.
- Befestigen Sie die Vorderbeine, Hinterbeine und der Schwanz der Maus auf dem OP-Tisch mit Stücken von chirurgische Bänder.
- Stellen Sie eine gerade Linie Einschnitt unmittelbar schlechter als die xyphisternum.
- Verwenden Sie eine sterile selbsthaltender Retraktor, die Leber zu schützen.
- Mit einer Spritze mit einer 20G Nadel langsam und vorsichtig zu injizieren 100 ul PBS, enthaltend 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1Maus HCC-Zellen in den rechten Leberlappen.
- Nach dem Entfernen der Nadel, tragen Sie eine sterile Wattestäbchen für mindestens 1 min, um eine mögliche Blutung zu stoppen wegen der hohen Durchblutung der Leber.
- Schließen Sie das subkutane Gewebe mit einer absorbierbaren Naht, gefolgt von Hautverschluss mit chirurgischen Klammern. Anschließend reinigen Sie die Wunde noch einmal mit Betadin-Peeling. Anmerkung: Dies wird den Verschluß der Operationswunde zu gewährleisten.
- Subkutan geben 100 ul physiologischer Kochsalzlösung.
3. Post-Chirurgie
- Unmittelbar nach der Operation, übertragen Sie die Maus, um einen sauberen Käfig mit einem postoperativen Identifikationskarte, um Hausmeister des Maus-Zustand zu informieren. Geben Sie Nahrung und Wasser. Hinweis: Nach unserer Erfahrung, eine Maus, die gerade durchgemacht hat Chirurgie am besten abschneiden, wenn allein mit nassen Nahrung und Wasser für die erste 24-Stunden-Periode nach der Operation untergebracht.
- Halten Sie das Tier warm mit einer Wärmelampe, die Hitze abstrahlen nicht übertraf 38 ºC. USE-Thermometer, um die Temperatur zu messen, bis die Maus vollständig wiederhergestellt wird.
- Haus das Tier in einem Käfig vorzugsweise mit Papierbettwäsche, um Komfort zu gewährleisten.
- Nach anfänglichen Erholung, überwachen das Tier Anzeichen von Unwohlsein, Blutungen, Schmerzen und Leiden. Geben Buprenorphin (0,05 -0,1 mg / kg), um Schmerzen zu lindern. Die Aktivität, Verhalten und Aussehen, sowie Wasser und der Nahrungsaufnahme für ca. 2 h genau zu überwachen. Wenn ambulante, bewegen Sie das Tier wieder in die Gegend für regelmäßige normale Gehäuse von Mäusen und weiterhin auf 6-12 h Intervalle für 24 Stunden nach der Operation zu überwachen. Führen Sie eine Gewichtskontrolle, falls gewünscht.
- Allerdings, wenn das Tier ist mit Problemen erholt, geeignete unterstützende Behandlung Aktionen. Wenn Mäuse sind nicht in der Lage sich zu erholen, mit Menschlichkeit einschläfern Mäusen über CO 2 Ersticken und Genickbruch. Folgen Sie genehmigten Richtlinien des Instituts für die Euthanasie.
- Nach der Operation, überprüfen Sie für die klinische Beweise für HCC in der Regel observab istle als signifikante Reduktion der Körperkondition. Anmerkung: An diesem Punkt wurde ein Primärtumor wahrscheinlich in der Leber entwickelt und metastatischen Ablagerungen wahrscheinlich in der Lunge entwickelt.
- An dieser Stelle opfern alle Mäuse (Versuchs- und Kontroll) im Experiment durch humane Sterbehilfe beteiligt. Betreff die Mäuse zu Erstickung mit Kohlendioxid: sehr langsam setzen Kohlendioxid in die Kammer über einen Zeitraum von 5 bis 10 min. Dies führt dazu, Atemstillstand.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die Leber von Balb / c-Mäuse wurden mit 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen implantiert. Klinische Beweise für HCC Entwicklung zu beobachten war 63 Tage nach der Operation. Demzufolge wurden die Mäuse auf humane Weise eingeschläfert. Autopsie wurde auf die eingeschläfert Mäusen durchgeführt. Die Lunge und Leber wurden reseziert und eine sorgfältige Brutto Prüfung durchgeführt, um makroskopischen Tumoren zu identifizieren. In einer Maus wurde ein oberflächlicher Tumor auf der Oberfläche der Leber mit irgen...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
In diesem Artikel eine ausführliche Beschreibung des Verfahrens gegeben, dass kürzlich von Ogunwobi und Kollegen der erfolgreichen Etablierung eines orthotopen syngenen Mausmodell der HCC Metastase berichtet (Abbildung 2) 3. Die Entnahmerate von Tumoren, für dieses Verfahren ist im Allgemeinen hoch. Wir haben früher beobachteten eine Tumoraufnahmerate von 100% 3. Allerdings kann die Aufnahmerate variabel, abhängig von der Kompetenz der Prüfer sein. In einer aktuellen Experiment dur...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken Pascal DuBois für das Korrekturlesen des Artikels. Die Autoren möchten sich auch bei den Mitarbeitern der Tierschutzeinrichtung am Hunter College der City University of New York bedanken. Diese Arbeit wurde durch ein NIH RCMI-Stipendium für das Hunter College unterstützt.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mikro-Präparierpinzette | Roboz | (RS-5040) | Spitze 0,20 x 0,12 mm |
| Graefe Mikro-Präparierzange, gezackte, gebogene Spitze | Roboz | (RS-5111) | 1 x 2 Zähne, gebogene Spitze Breite 0,6 mm |
| Mikro-Präparierretraktor-Agricola (3 x 3 Zinken) | Roboz | (RS-6501) | Stumpf 3 x 3 Zinken, Tiefe 4 mm, Spreizung 25 mm |
| Mikro-Präparierzange-Goldstein (3 x 3 Zinken) | Roboz | (RS-6503) | Stumpf, 3 x 3 Zinken, Tiefe 4 mm, Spreizung 19 mm |
| Jameson Messschieber (misst Tumore) | Roboz | (RS-6466) | 80 mm/3 Zoll Skala, verchromt |
| Mikro-Präparierschere, große Ringschere, gerade und scharfe | Roboz | (RS-5852) | 23 mm Klingen, Länge 4 Zoll, flache Schäfte und große |
| Ringe Skalpell mit Klingen, für filigrane Präpariereingriffe | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Skalpellgriff | Roboz | (RS-9884) | Solid |
| Littauer Stitch Sissors | Roboz | (RS-7074) | Länge 4,5 Zoll |
| Brauner Nadelhalter, zum einfachen Fadenbinden | Roboz | (RS-7960) | Konvexer Kiefer, feine Zacken |
| Reflex 7MM Wundclips mit Reflex 7 Clip Applier | Roboz | (RS-9262) | sichere, sichere alternative Methode zum Wundverschluss |
| Instrumententablett und Deckel | Roboz | RT-1350S | |
| Mini-Clipper mit abnehmbarer Klinge | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (der Keim-Terminator) Trockensterilisator | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | Für die schnelle Dekontamination von Mikro-Präparierinstrumenten. Die Instrumente dekontaminieren innerhalb von 15 Sekunden. |
| Mikroinjektionsnadeln | VWR | BD305125 | 25G Nadel |
Referenzen
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765(2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
