Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Zusammenfassung

Es wurde gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen (CTCs) eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung spielen. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Isolierung und Vermehrung von CTCs aus dem Vollblut eines syngenen Maustumormodells der Metastasierung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) beschrieben.

Zusammenfassung

Krebsmetastasen sind die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Neuere Studien haben gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen (CTCs) eine wichtige Rolle bei der Metastasierung von Krebs spielen. Tatsächlich korreliert die Anzahl der CTCs mit der Tumorgröße. In dieser Arbeit wird eine detaillierte Beschreibung einer Methodik zur Isolierung und Vermehrung von CTCs aus einem syngenen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms (HCC) gegeben, die eine nachgelagerte Analyse potenziell wichtiger molekularer Mechanismen der Metastasierung solider Organtumoren ermöglicht. Diese Methode ist effizient und reproduzierbar. Es handelt sich um eine nicht-invasive Technik und hat daher das Potenzial, die invasive Biopsie von Geweben des Menschen zu ersetzen, die mit Komplikationen verbunden sein kann. Daher ermöglicht das hier diskutierte Verfahren die Isolierung und Vermehrung von CTCs aus Vollblutproben, so dass sie untersucht und charakterisiert werden können. Dies hat das Potenzial für zukünftige Adaptionen für klinische Anwendungen wie Diagnose und personalisierte zielgerichtete Therapie.

Einleitung

Die Krebsforschungsgemeinschaft weiß von der Existenz zirkulierender Tumorzellen (CTCs), seit sie erstmals 1869 von Thomas Ashworth beobachtet wurden¹. Seitdem hat sich gezeigt, dass CTCs für die Tumormetastasierung und das Fortschreiten der Erkrankung wichtig sind^2-5. Solide Tumore sind heute weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. CTCs sind seltene Zellen, die aus Primärtumoren stammen und über den Blutkreislauf zu verschiedenen Organen wandern, von denen sich nur ein kleiner Teil schließlich zu Metastasen^2-5 entwickelt. Bemerkenswert ist, dass es eine positive Korrelation zwischen der Tumorgröße und der CTC-Zahl^3,4 gibt.

Ein Verständnis der CTC-Biologie kann zur Suche nach einer zielgerichteten Therapie beitragen. Darüber hinaus können CTCs diagnostische Anwendungen haben. Um diese potenziellen klinischen Anwendungen zu erreichen, müssen einige aktuelle Herausforderungen bei der Untersuchung von CTCs überwunden werden. Eine Herausforderung hängt mit der Tatsache zusammen, dass CTCs als Einzelzellen oder als Cluster vorliegen können und sie möglicherweise sogar in der Lage sind, ihren Phänotyp als Reaktion auf die Mikroumgebung des Blutes zu ändern². Darüber hinaus kann der Nachweis sehr schwierig sein, zum Teil aufgrund der geringen Anzahl von CTCs (einige bis Hunderte pro Milliliter) unter einer Milliarde hämatologischen Zellen pro Milliliter im Blut⁶. Dennoch hat sich in den letzten Jahren die Forschung zu den potenziellen klinischen Anwendungen von CTCs bei soliden Organkrebserkrankungen intensiviert.

Trotz dieser Bemühungen bestehen die Herausforderungen, die Rolle von CTCs zu untersuchen und zu verstehen, aufgrund der Seltenheit von CTCs und der Unzulänglichkeit der derzeit verfügbaren technologischen Werkzeuge. Trotz dieser Herausforderungen ist das enorme Potenzial für klinische Anwendungen nach wie vor ein Ansporn, die Rolle von CTCs bei der Krebsmetastasierung weiter zu erforschen.

Wir waren kürzlich erfolgreich bei der Isolierung und Vermehrung von CTCs in Zellkulturen aus einem orthotopen syngenen Mausmodell der Metastasierung des hepatozellulären Karzinoms (HCC)⁵. Der Zweck der vorliegenden Arbeit ist es, alle Aspekte der erfolgreichen Methodik im Detail zu beschreiben. Die Bedeutung dieser Methodik liegt in der Tatsache, dass dieser Ansatz modifiziert werden kann, um humane CTCs erfolgreich zu isolieren und in Kultur zu vermehren, wodurch die Möglichkeit von in vitro Studien zur CTC-Biologie verbessert wird.

Es gibt mehrere potenzielle klinische Anwendungen für die Verwendung von CTCs. CTCs können für die Prognose, die Überwachung des Ansprechens, das Screening, die dynamische Überwachung von molekularen Tumorveränderungen und die personalisierte Therapie nützlich sein⁴. Daher hat ein besseres Verständnis der Biologie von CTCs ein hohes Potenzial für klinische Auswirkungen.

Protokoll

Ethik Hinweise: Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) des Hunter College der City University of New York zugelassen.

1. Pre-Experiment Procedures

1. Nach der Ankunft in der Tierhaltung, zunächst beherbergen 3 BALB / c Mäusen mit einem Käfig mit einem gefilterten oben und Hackschnitzel Betten. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse freien Zugang zu Nahrung, Purina Nagetierfutter und Wasser. Bettzeug und Lebensmittel sollte zweimal pro Woche gewechselt werden, während Käfige sollten einmal pro Woche gereinigt werden.
2. Induzieren Narkose bei Mäusen unter Verwendung eines Isofluran Verdampfer zusammen mit Sauerstoff mit einer konstanten Strömungsrate von 1 l pro min. Das System ist selbstständig und enthält eine Präzisions Vaporizer.
3. Position Tier in einer Kunststoff-Box, die die Genauigkeit Verdampfer und Gas / Narkosesystem mit ihm verbunden ist. Anfangs des Verdampfers eingestellt auf 2,5 bis Tier bewusstlos ist, an welchem ​​Punkt senken den Verdampfer bis 2.
4. Zu dieser Zeit wechseln dieVentilleitung, Abdichtung an die Box und an den Nasenkegel öffnen.
5. Bewegen Sie das Tier zum Vorbereitungsbereich, mit dem Nasenkegel ordnungsgemäß aufgestellt und angeschlossen (zur Aufrechterhaltung der Narkose).
6. Vorbereitung ⁵ x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen für die Implantation per Maus. BNL 1ME A.7R.1 sollte in Medium wachsen (10% hitzeinaktiviertem FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) Inkubation in einer Zellkulturschale bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit Luft und 5% _{CO 2.}
7. Mit einer Spritze mit einer 20 G Nadel, das Implantat 100 ul PBS, enthaltend 5 ^× 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Mausleberkarzinomzellen in einen Lappen der Leber von Balb / c-Mäusen, die primären Tumoren zu erzeugen. Nach der Implantation, Haus die BALB / c Mäuse in einem Käfig mit den gleichen Haus Anforderungen vor der Implantation.
8. Bei der experimentellen Endpunkt, klinische Hinweise auf Leberzellkarzinom zu beobachten, wie signifikante Reduktion der KörperzustandTor (in der Regel nach 4 Wochen festgestellt). An diesem Punkt gibt es eine Wahrscheinlichkeit, dass die primäre Tumoren in der Leber entwickelt, während Metastasen in der Lunge gebildet haben. Danach beginnt das Verfahren der Isolierung und Vermehrung der zirkulierenden Tumorzellen.

2. Sammeln von Vollblut für die zirkulierenden Tumorzellisolation

HINWEIS: ausreichend bereinigt den OP-Bereich und stellen Sie sicher, es ist übersichtlich gestaltet. Autoklaven alle chirurgischen Instrumenten oder genießen in einem Desinfektionsmittel nach Empfehlung des Herstellers

1. Opfern Mäusen durch humane Sterbehilfe bei experimentellen Endpunkt (klinische Anzeichen einer Tumorentwicklung). Euthanasie von Mäusen sollte beinhalten _CO 2 Ersticken. Beachten Sie die Maus richtig an Anästhesie zu bestätigen korrekt verteilt. Kohlendioxid sollte langsam in die Kammer über einen Zeitraum von 5 veröffentlicht werden - 10 min, was zu Atemstillstand. Folgen Sie durch intra Ausbluten und cervical Dislokation. ⁵
2. Verwenden Sie eine 25 G Nadel in eine 1 ml Spritze für die Sammlung von Vollblut angebracht. Heparanize die Spritze mit 0,01 ml Heparin. Punktion der Haut sofort mit der Nadel schlechter als die xyphisternum bei ca. 45 ° -Winkel. Voran Nadel langsam, um das Herz zu durchstechen, und senken Sie dann den Winkel der Nadel. Stetig halten Sie die Nadel und Spritze in Position, und ziehen Sie 500 ul - 1000 & mgr; l Vollblut aus dem Herzen.
3. Entfernen Sie die Spritze und Nadel und übertragen Sie das Blut in eine pre-markierten 1,5 ml pyrogenfreien Röhre. Zentrifugieren Sie das Vollblut in 1,5 ml pyrogenfreien Röhrchen gesammelt bei 1.167 xg für 5 min.
   HINWEIS: Die Zentrifugation trennt das Vollblut-Probe in drei Schichten: der Boden oder Hämatokrit Schicht aus roten Blutzellen, eine dünne Zwischenschicht aus buffy coat und einen oberen Plasmaschicht.
4. Entfernen Sie die Plasma sorgfältig durch Pipettieren und sammeln sie in einem separaten 1,5 ml pyrogenfreien Röhre für Fürther Experimente wie Nachweis von zellfreien Nukleinsäuren ^7.
5. Für die Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC), zur Erhebung der Buffy-Coat in einen separaten 1,5 ml pyrogenfreien Röhre in Vorbereitung auf roten Blutzellen (RBC) Lyse. Dies ist notwendig, um restliche RBCs in der Buffy-Coat-Schicht zu entfernen.

3. Rezept für Rotes Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer

1. Machen Sie einen 1 l-Lösung von RBC Lysispuffer.
2. Machen Sie ein 500 ml Ammoniumchlorid und 500 ml Tris. Dann mischen, um eine 1 l-Lösung von RBC Lysepuffers mit einer Endkonzentration von 155 mM Ammoniumchlorid und 10 mM Tris erstellen.
3. Puffern der Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 auf. Bewahren Sie die RBC Lysispuffer bei +2 bis +8 ° C, und bringen auf RT unmittelbar vor der Verwendung.

4. RBC Lyse von Buffy Coat

1. 1 ml RBC Lysepuffer dem sterilen pyrogenfreien 1,5 ml Röhrchen mit dem gesammelten Buffy-Coat.
2. Den Inhalt des Rohres durchUmdrehen mehrmals. Die gemischte Inhalt des Röhrchens für 5 min bei RT auf der Bank zu inkubieren. Zentrifugieren der gemischten Inhalt für 5 min bei 1.167 x g.
3. Nach der Zentrifugation wird eine weißliche Pellets erhalten werden. Entsorgen Sie die rötliche Überstand langsam und vorsichtig in 10% Bleichmittel ohne Unterbrechung zu dem Pellet. Wenn das Pellet nicht weißlich, erneut führen Sie die Schritte 3,1-3,5. Erhöhung der Inkubationszeit in RBC Lysepuffer 10-15 min kann ebenfalls hilfreich sein.
4. Entsorgen Sie die biologischen Abfall einmal Dekontamination von biologischen Abfällen in 10% Bleichmittel nach 24 Stunden abgeschlossen ist.

5. Vermehrung in Zellkultur

HINWEIS: Die Tumorzellen werden in der Regel schnell wachsende Zellen weiße Blutkörperchen, die reichlich in der ursprünglichen Mischung von Zellen in die Schale überimpft werden. Nach wiederholter Wechsel des Mediums, und nachfolgende Passagen CTCs, werden alle weißen Blutzellen entfernt und eine relativ reine Population von CTCs bleibt.

1. NachVerwerfen des Überstandes in 10% Bleichmittel, wäscht den weißlich Pellet in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mindestens einmal und Resuspension in komplettem Kulturmedium zur Vermehrung in Zellkultur.
2. Einmal Waschen abgeschlossen ist, wird 1 ml der vollständigen BNL 1ME A.7R.1 Kulturmedium (10% hitzeinaktiviertem FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin), um das Pellet und das Pellet in dem Kulturmedium.
3. Samen der resuspendiert Mischung von Zellen in einer Zellkulturschale. Inkubieren der Zellkulturschale bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit Luft und _5% CO 2.
4. Ändern Sie den Zellkulturmedium alle zwei bis drei Tage. Nach fünf bis sieben Tagen wird CTCs zu der Zellkulturschale eingehalten und gestartet haben wuchernden. Diese Zellen lebensfähig über 25 Passagen und nach mehrmaligem Einfrieren und Auftauen Zyklen ⁵ bleibt.

6. Prüfung von Leberzellkarzinom zirkulierenden Tumorzelllinie

1. Führen apolymerase Kettenreaktion (PCR) basierende Methode, um nur einen bestimmten DNA-Abschnitt des Maus-β-Globin-Gens zu verstärken, um zu bestätigen, dass der Roman gegründet CTC Zelllinien sind Maus-Zellen, wie das Original implantiert BNL 1ME A.7R.1 HCC Linie. Methode wurde ursprünglich beschrieben und Steube et al validiert. ^5,8
2. Zuführen Immunofärbung für den Hepatozyten-spezifischer Marker cAMP responsive element binding protein 3-like 3 (CREB3L3) unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers. Dies wird diesen Roman gegründet CTCs sind in der Tat Hepatozyten wie das Original implantiert BNL 1ME A.7R.1 Zelllinie zu bestätigen. ⁵

Ergebnisse

Die hier beschriebene Methode hat gezeigt, dass CTC isoliert werden kann. Die Mäuse wurden auf humane Weise zu experimentellen Endpunkt euthanasiert. Der Prozess beteiligt Erstickung mit Kohlendioxid, intra-kardialen Ausbluten und Genickbruch. Ein Schema der wesentlichen Schritte des Verfahrens sind in Fig. 2 dargestellt ist Vollblutproben durch intrakardiale Ausbluten gesammelt wurden, unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls verarbeitet. Nach dem, wurde Zentrifugation verwen...

Diskussion

In dieser Studie wurde beschrieben, wie CTCs aus dem Vollblut einer syngenen Maus mit HCC isoliert und vermehrt werden können. Ziel dieser Arbeit ist es, die laufenden Studien zu den Mechanismen der Krebsmetastasierung zu verbessern.

Ein Faktor, der zur schlechten Prognose vieler Krebsarten beiträgt, ist die mangelnde rechtzeitige Erkennung und die daraus resultierende weite Verbreitung der Malignität³. CTCs stammen von primären Krebserkrankungen und breiten sich über den Blutkreis...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Heparin Natriumsalz 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1,5 ml klar NS	VWR	89511-254	1,5 ml  pyrogenfrei eppendorf Tubes
Nadel steril Disp BD 25 G x 1 Zoll	VWR	BD305125	25 g
Nadel Slp Spitze SRNG 1 ml 200 Stück pro Packung	VWR	BD309659	1 ml Spritzenspitze
Spritze 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml Spritze
VWR Pinzette Tissue 6	VWR	82027-446	Pinzette
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Objektträger sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Objektträger
VWR Deckglas #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Deckglas
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP Pen
Wasser RNASe und DNAse frei 2 L	VWR	101454-204	Nuklease Freies Wasser
Puffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chlorid ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammoniumchlorid-Puffer
Falcon Gewebekulturschale 60 x 15 mm Style Polystyrol	VWR	353002	Gewebekulturschale
Clorox Keimtötendes Bleichmittel, regulär	VWR	89501-620	Clorox Bleiche
PBS, 1x (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) ohne Calcium & Magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  mit 4,5 g/L Glukose & L-Glutamin ohne Natriumpyruvat	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x Medium für BNL 1ME A.7R.1 Zellen
Fötales Rinderserum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Lösung, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	Zentrifuge mit 13.000 U/min