Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und Analyse der infiltrierenden Leukozyten von Geweben an der mütterlich-fetalen Grenzfläche (Uterus, Dezidua und Plazenta) von Mäusen beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der meisten Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Durchflusszytometrie-Analysen.
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Methodenartikel
Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Immuntoleranz bei Schwangerschaft erfordert, dass das Immunsystem der Mutter erfährt Scheidungsänderungen, um zu akzeptieren und zu pflegen sich entwickelnden Fötus. Diese Toleranz wird während des Koitus eingeleitet, während der Befruchtung und Implantation gegründet und während der Schwangerschaft beibehalten wird. Aktive zellulären und molekularen Mediatoren von Mutter und Fötus Toleranz werden an der Stelle des Kontaktes zwischen fetalen und mütterlichen Gewebe, wie die Mutter und Fötus-Schnittstelle, die die Plazenta und die Gebärmutter und dezidualen Gewebe enthält bekannt bereichert. Diese Schnittstelle wird von Stromazellen und infiltrieren Leukozyten besteht, und deren Fülle und phänotypischen Eigenschaften im Laufe der Schwangerschaft zu ändern. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle umfassen Neutrophile, Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, die zusammen das lokale Mikroumgebung, die Schwangerschaft aufrecht zu erstellen. Ein Ungleichgewicht zwischen diesen Zellen oder jede inappropriate Veränderung ihrer Phänotypen wird als ein Mechanismus der Erkrankung in der Schwangerschaft. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten, die die Mutter und Fötus Schnittstelle infiltrieren wesentlich, um die Immunmechanismen, die schwangerschaftsbedingten Komplikationen aufzuklären. Hierin ist ein Protokoll, das eine Kombination von leichter mechanischer Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung mit einem proteolytischen und kollagenolytischen Enzymcocktail, um die Infiltration von Leukozyten aus den Mäusegeweben an der mütterlich-fötalen Grenzfläche zu isolieren, verwendet. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung der hohen Zahl von lebensfähigen Leukozyten (> 70%) mit einer ausreichend konservierten antigenen und funktionellen Eigenschaften. Isolierten Leukozyten können dann durch verschiedene Techniken, einschließlich Immunphänotypisierung Zellsortierung, Imaging, Immunoblotting-mRNA-Expression, Zellkultur und in vitro funktionelle Assays wie gemischte Leukozytenreaktionen, Proliferation oder Zytotoxizität Assays analysiert werden.
Einleitung
Immuntoleranz bei Schwangerschaft ist eine Periode, in Scheidungs Veränderungen im Immunsystem der Mutter erfolgen. Diese Änderungen ermöglichen die Mutter auf den Fötus, eine semi-allogenen Transplantats 1 zu tolerieren. Der Fötus drückt väterlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) -Antigene 2 und fötalen Zellen im mütterlichen Kreislauf 3 gefunden worden ist; jedoch ist der Fötus nicht abgelehnt 4,5. Dieses Rätsel ist nicht vollständig geklärt.
Die jüngste Hypothese besagt, dass Mutter und Fötus Toleranz während des Koitus erstellt und Befruchtung und 6,7 gehalten, um eine v....
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Protokoll
Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen Tier ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und der Institutional Review Boards gegeben. Bei der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder gefährliche Mittel, wie in diesem Protokoll erwähnt, müssen die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden.
1. Maus Handhabung und Gewebeentnahme
- Bereiten Sie eine sterile Arbeitsstation und erhalten sterile Werkzeuge für Gewebesammlung. Diese Werkzeuge sind große und kleine chirurgische Scheren, Pinzetten, und Feinspitze Pinzette. Umfassen kleine Petrischalen mit dem ent....
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Ergebnisse
Die Präparation von Maus-Geweben von der mütterlich-fötalen Grenzfläche ist in Abbildung 1 gezeigt ist; Dieses Verfahren umfasst das Öffnen der Bauchhöhle (1A, B), Gebärmutterhörner (1C), die die Implantationsstellen (1D) und die Sammlung der Uterusgeweben (1E), Plazenta (1F) und Dezidua-Gewebe (1G) bei 16,5 dpc. 2 zeigt die Morphologie von isolierten Makrophagen (F4 / 80 +) aus Dezidua.......
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Diskussion
Die einheitliche Datenerhebung, die die Fülle und phänotypischen Eigenschaften der infiltrierenden Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zeichnet ist wesentlich für das Verständnis der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen. Verschiedene Techniken wurden beschrieben, dass die Isolierung der infiltrierenden Leukozyten aus den Mäusegeweben am mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 31,38,39,43-46 erleichtern. Aber jede Technik unterschiedlich ist, verwendet verschi.......
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Offenlegungen
Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
NGL wurde von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal and Child Health. Wir danken Maureen McGerty und Amy E. Furcron (Wayne State University) für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
Zusätzliche Instrumente
td colspan="4"> Wasserbad-Präzisions-51221035-Zellzähler
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Säulen | Militenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Zellseparator | Militenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 30 μ m Vorabscheidefilter | Militenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Multistand | Militenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml konische Röhrchen | Thermo Fisher | 339650 | |
| MACS Puffer | Militenyi Biotec | Laborpräparat | (0,5 % Rinderserumalbumin, 2 mM EDTA und 1x PBS, pH 7,2) |
| Reagenzien | |||
| Accutase enzymatische Lösung | Life Technologies | A11105-01 | |
| Anti-Maus CD16/CD32 | BD Biosciences | 533142 | |
| Anti-Maus extrazelluläre Antikörper | BD Bioscences/eBiosciences | Tabelle 1 | |
| Natriumazid | Fisher | S227-500 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Lebend/Tot-Viabilitätsfarbstoff | Life Technologies | L23105 | |
| Fixierungspufferlösung | BD Biosciences | 558049 | |
| FACS Puffer | BD Biosciences | Laborpräparat | 0,1 % BSA, 0,05 % Natriumazid, 1x PBS, pH 7,4 |
| Trypanblau-Lösung 0,4 % | BIO-RAD | 145-0013 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Life Technologies | 16000-044< | |
| Inkubator mit Schüttler | Thermo Scientific | MaxQ 4450 | |
| Durchflusszytometer | BD LSRFortessa | ||
| Zentrifuge | Thermo Scientific | Legend LXTR | |
| Vakuumsystem | Labor gebaut | ||
| Inkubator | Thermo Scientific | Inkubator 3307 | |
| BIO-RAD | TC20 Automatisierter Zellzähler | ||
| Optische Mikroskope und Fluoreszenzmikroskope | Zeiss und Olympus | Zeiss LSM780 und Olympus CKX41 |
Referenzen
- Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
- King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast.<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
