Spot the Correct Tissue Every Time in Multi-Gewebe-Blöcke

Zusammenfassung

Der Zweck der Probenausrichtung Tag (vor Ort) soll als Orientierungshilfe, um in einzelnen Gewebeidentifikation in multi-Gewebe Paraffinblöcke unterstützen funktionieren. Diese Protokolle zeigen, wie sie ist leicht von gemeinsamen, kostengünstigen Histologie Materialien gebaut und dient als zuverlässige visuelle Marker in Paraffinblöcke und Abschnitte.

Zusammenfassung

Multi-Gewebe Paraffinblöcke bieten eine hohe Durchsatzanalyse mit erhöhter Effizienz, experimentelle Einheitlichkeit und reduziertem Zeit- und Kostenaufwand. Tissue Microarrays bilden die Mehrheit der Multi-Gewebe Paraffinblöcke, sondern zunehmend die Forscher mit nicht-angeordneten Blöcken mit größeren Gewebe von mehreren Personen, die ohne erhebliche Investitionen in die Planung und Ausstattung bieten viele der Vorteile von Tissue Microarrays können. Eine kritische Komponente jeder Mehrgewebeanalyse ist benutzt, um jedes Gewebe zu identifizieren Orientierungsverfahren. Obwohl Verfahren existieren, um die richtige Orientierung und Identifizierung von Gewebe in mehreren Gewebeblöcken zu erhalten, die meisten sind nicht gut geeignet, um nicht in einem Array besteht, kann wertvollen Raum innerhalb einer Anordnung zu verbrauchen und / oder nur schwer in der Standard histologisches Labor herzustellen. Die Probe Orientierung Tag (vor Ort) ist eine einfache, kostengünstige Orientierungshilfe, die eindeutig in die Paraffinblocks und alle Gewebeschnitte fo sichtbar istr zuverlässige Probenidentifikation in angeordnet und nicht in einem Array-Layouts. Der Fleck liefert Vorteile gegenüber bestehenden Orientierungsverfahren für Nicht-Array-Blöcke, wie es keinen direkten Modifikation des Gewebes erfordern und sorgt für Flexibilität bei der Anordnung der Gewebestücke.

Einleitung

Die Fähigkeit, Gewebeproben von mehreren Personen in einem einzigen Paraffinblock einzubetten ermöglicht eine einfache Side-by-Side-Vergleich zwischen den Behandlungen und Einzelpersonen, eliminiert die Variabilität zwischen den Folien, und verringert die Kosten und Arbeitsbelastung der Schneiden und Färben von Proben. Diese Mehrgewebeblöcke werden typischerweise entweder als Gewebe-Mikroarrays (TMA) oder Paraffinblöcken, die Gewebe aus mehreren Individuen in einem nicht-Array-Layout erzeugt wird. Aufrechterhaltung der Probenidentität ist entscheidend für den Erfolg eines jeden Multigewebeanalyse. Forscher verwendet haben TMAs seit ihrer Entwicklung, um die Effizienz der Analyse zu verbessern, Variation zwischen den Folien zu reduzieren, sparen wertvolle Gewebe Ressourcen und die Zeit und die Kosten für die Experimente ¹ zu reduzieren. Korrekte Orientierung TMA kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden, einschließlich Leerzeichen, Zeilen oder Spalten zwischen Gewebekerne ^2-4, asymmetrische Anordnung der Kerngruppen ^{3, 5} (zB control vs. Behandlung), "Leuchtturm" Kerne ⁶ und bezeichnet Orientierung Kerne außerhalb des TMA Matrix ³ entfernt. Obwohl diese Verfahren eignen sich gut für TMAs meisten verbrauchen wertvolle TMA Kernraum und TMAs mit Lücken und Räume als Bezeichner kann verwirrend werden als Gewebekerne werden im Laufe der Zeit erschöpft. Darüber hinaus sind diese Verfahren nicht für die Verwendung in Mehrgewebeblöcke falls ohne ein Array-Format, da sie von Anomalien in der dicht geordneten Muster einheitlicher Mikroarraykerne als Bezeichner verlassen. Die meisten nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke müssen ungleichmäßige Gewebe aufnehmen und per Definition nicht die strukturierte Anordnung Raster, das diese Aberrationen stehen als Wahrzeichen macht anzuzeigen.

Obgleich es viele Vorteile bei der Verwendung eines TMA, einer der größten Nachteile ist die geringe Größe der Kerne, die nicht immer repräsentativ weitgehend heterogenes Gewebe ^1. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke bieten viele ter profitiert von einem TMA, aber größere Gewebeproben oder ganze Organe aus Tierversuchen enthalten. Tissue Microarrays unter Verwendung von Einzeladern haben unterschiedliche Konkordanz mit ganzen Gewebeschnitte auf der Basis des Proteins von Interesse und viele erfordern mehrere Kerne für erhöhte Konkordanz ^7-11. Aufgrund der Komplexität und heterogene Natur einiger Biomarker Phänotypen TMAs Verwendung auch eine große Anzahl von Kernen (> 10) kann immer noch unzureichend sein, und sie können andere als Mikroarrays für die Analyse ⁸ Methoden erfordern. Zusätzlich ist TMA Bau zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und erfordert die Anfangskosten und Investitionen in oder Zugang zu einem Gewebe Arrayer. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke können in jeder Grundlabor mit deutlich weniger Zeit und Mühe gemacht werden und ist eine gute Alternative für die Studien, die mehr erfordern als Gewebe-Arrays ermöglichen oder als Mittel zur Kostensenkung und Analyse zu vereinfachen.

Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke ähnlich erfordern eine zuverlässige oderientation Marker Probenidentifikation zu verfolgen, aber die Entwicklung dieser Marker wurde begrenzt. Ein Großteil der Literatur beschreibt Gewebe Ausrichtung konzentriert sich auf die korrekte physiologische Orientierung für einzelne Gewebestücke wie Tätowieren des Gewebes mit Tinte ¹² Einbetten, pre-Einbettung Gewebe in Agar-Gelatine vor der Verarbeitung ¹³ und Kennzeichnung bestimmter Gewebe mit Kerben ¹⁴ oder Nähte ¹⁵ . Obwohl funktionsfähig, sind diese Verfahren nicht ideal als Marker in mehreren Gewebeblöcken aufgrund ihrer Beschränkungen. Eine Naht wird durch schnell geschnitten werden und können nicht in jedem Abschnitt sichtbar sein. Pre-Einbettungstechniken Verwendung von Agar-Gelatine kann das Gewebe in der richtigen Ausrichtung während der Verarbeitung und Einbettung zu halten, aber nicht einen visuellen Hinweis, zwischen mehreren Proben in dem Paraffinblock und Folien zu unterscheiden. Kerben oder Farbstoff auf dem Gewebe Analyse erschweren oder zu verschließen wichtigen morphologischen Details. Alternativ Gewebe Identitätin einem nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblock kann durch die Einbettung von Gewebestücke in einer asymmetrischen Anordnung gehalten werden, aber das 3 oder mehr Gewebestücke benötigt und möglicherweise nicht für eine optimale Anordnung der Gewebe für die Analyse zu ermöglichen.

Die Probe Orientierung Tag (vor Ort) wurde als ein einfaches und kostengünstiges Verfahren, um Gewebe in mehreren Gewebeblöcke eindeutig identifizieren entwickelt und bietet viele Vorteile gegenüber bestehenden Methoden Orientierung. Der Spot ist eine kleine, bunt, Kern Hydroxyethyl Agarose-Gel-Verarbeitung und Gewebemarkierungsfarbstoff, komponiert und mit Paraffin (2C) infiltriert. Der Spot Kern auf Ende eingebettet neben einem einzigen Gewebe in einem Multi-Gewebe Paraffinblock und erscheint als bunten Punkt im Block und in jedem Abschnitt (1A - D), unter Angabe des korrekten Ausrichtung des Blocks und Sektionen für die einfache Gewebeidentifikation.

Protokoll

1. Konstruktion des Spots

1. Zugeben von 50 mg Rinderserumalbumin (BSA) auf 1 ml Gewebemarkierungsfarbstoff in einem 15 ml konischen Röhrchen oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex für 1 min oder bis vollständig gelöst.
   Hinweis: Bei diesem Protokoll verwenden biochemischen Grade BSA. Während andere Qualitäten und Reinheiten nicht getestet wurden, ist zu erwarten, dass Grad und Reinheit nicht einen erheblichen Einfluss auf den Erfolg der Stelle haben.
2. Wärme 9 ml Hydroxyethyl Agarose-Gel Verarbeitung in einem 15 ml konischen Röhrchen in der Mikrowelle bei 30% Leistung für 10 Sekunden-Schritten, bis das Gel vollständig geschmolzen ist.
3. Kombinieren Sie die geschmolzen Verarbeitung Gel und Farbstoff-BSA-Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen und mischen mit einer Pipette. Vortex die Lösung.
4. Legen Sie die konische Röhrchen in einem Kühlschrank für ein paar Stunden oder bis solide.
5. Verwenden Sie einen langen, dünnen, Metallspachtel oder Sonde vorsichtig lassen Sie die farbigen Gels Stecker aus der konischen Rohr.
6. Verwenden Sie ein Skalpell oder einer Rasierklinge zu Cut das Gel stecken quer in 5 mm dicke Schnitte. Entfernen Sie die abgerundeten Enden und als Abfall zu entsorgen (Abbildung 2A).
7. Legen Sie die Gel-Steckteile flach in der Histologie Kassetten und halten in 70% Ethanol für 1 Stunde. Ändern Sie die 70% Ethanol-Lösung alle 2-4 h für mindestens 3 Veränderungen über einen Zeitraum von 24 Std.
8. Manuell bearbeiten die Gel Schnitte durch eine Ethanolreihe (1 Std jeden: 70% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol (3x Änderungen), so klar in Clearing-Lösung 3x 1 Stunde jeweils (beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe ( Xylole Ersatz)) wurden in diesem Protokoll verwendet werden, sind auch akzeptabel Xylole) und Infiltrat mit geschmolzenem Paraffin (3x für jeweils 1 Stunde), entweder manuell oder in einem Gewebe processer.
   Hinweis: Vor dem vollständigen Dehydratisierung in 100% Ethanol, kann der Farbstoff aus dem Gel Stopfen, andere Gewebe und die flüssigen Reagenzien, die in einem automatischen Gewebeprozessor beeinflussen könnten lecken. Als solche manuelle Rehydrierung wird dringend empfohlen, ist aber die automatisierte Verarbeitung equVerbündeter wirksam.
9. Betten Sie mehrere bearbeitete Gel Abschnitte mit Standard-Paraffineinbettung Methodik (2B). Lassen Sie Blöcke zu kühlen und zu härten und dann auf Raumtemperatur kommen.
10. Verwenden Sie eine dermale punch Nadel der gewünschten Größe zu erkennen Kerne von den Embedded-Gel-Abschnitte zu entfernen, bis der Block erschöpft ist (2C). Ein einzelner Block können vorsehen, bis zu 20 x 2 mm ² Adern. Bewahren Sie die Kerne in einem kühlen Ort. Verwenden dermale Punsch in diesem Protokoll finden Sie Zahlen, ein 1,5 mm (1D und 2D) oder eine 2 mm (1B, 1C und 2C).

2. Mit Plätze Orient Non-Array-Blöcke

1. Erstellen Sie eine Gewebeorientierungsdiagramm, um die gewünschten Positionen und Identitäten aller der einzelnen Gewebestücke zusammen eingebettet werden, und die Position des Spots zeigen.
   HINWEIS: Das Gewebe ist eine Orientierungsdiagramm veranschaulicht, die die Karte enthält physical Orte aller Gewebestücke mit Kennungen und der Lage der Stelle markiert. Es kann elektronisch erstellt werden oder können von Hand gezeichnet sein. Das Diagramm sollte mit welche Methode am besten für die Techniker und Forscher mit dem Endprodukt geschaffen werden. Diese Karte wird als Leitfaden für den Forscher dienen so Proben können leicht während mikroskopische Analyse identifiziert werden. Der in diesem Protokoll verwendete Karte wurde von Hand gezeichnet. Es zeigt einen Gewebeblock und Objektträger aus Glas mit jedem Gewebestück und der Stelle gezogen und in der gleichen Position wie die tatsächliche Gewebeblock und Objektträger markiert.
2. Die Gewebestücke zu verarbeiten in der Regel, um sicherzustellen, dass sie bleiben, richtig in den Hochrechnungs und Verarbeitungsschritte identifiziert. Für dieses Protokoll zu verarbeiten, das Gewebe 1 h lang jeweils in 70% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol, 100% igem Ethanol (x3 Änderungen), aliphatische Kohlenwasserstoffe (Xylole Ersatz) (x3 Änderungen), und geschmolzenes Paraffin bei Gewebeinfiltration 60 ° C (x3 Änderungen).
   HINWEIS: Einll Gewebe sollten folgende Standard-Histologie Laborverfahren verarbeitet werden. Dies kann aufgrund der individuellen variablen Laborverfahren, Gewebe Größe und Art, aber dies hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit, den Platz als Orientierungshilfe verwenden.
3. Vereinbaren Gewebestücke auf der Einbettung Station in den richtigen Stellen zugeordnet entsprechend der Gewebeorientierungsdiagramm. Verwenden Sie die Gewebeorientierungsdiagramm als Referenz, um den Techniker auf, wie man vor Ort und Gewebestücke in jedem Block arrangieren zu führen.
   HINWEIS: In diesem Protokoll die Einbettung Techniker setzen die handgezeichneten Orientierungskarte neben der Einbettung Station und angeordnet, die Gewebestücke auf der Einbettung Station in genau der gleichen Anordnung wie im Diagramm gezeichnet. Dies stellt sicher, dass alle Gewebestücke in dem Endprodukt vollständig identifizierbar bleiben. Das ist absolut entscheidend für den erfolgreichen Einsatz von Multi-Gewebeblöcke.
4. Stellen Sie sicher, der Stelle Kern ist größer als alle Gewebestücke in den Block eingebettet werden.
5. Betten Sie die Gewebestücke und dann die Stelle auf Ende (quer) an der richtigen Stelle nach dem Gewebeorientierungsdiagramm mit Standard-Einbettung Methodik. Bei Bedarf halten der Stelle (n) mit einer Pinzette aufrecht, bis das Paraffin hat genug, dass der Stelle (n) wird nicht umfallen (1-2 min) verfestigt.
6. Section und schmutzParaffinSchnitten mit vor Ort mittels Standardverfahren.
   1. Ermöglichen, dass die Abschnitte auf dem Wasserbad bei 40 ° C schweben und auf eine positiv geladene Glasobjektträger geklebt (ungeladenen Folien wurden nicht getestet). Trocknet die Folien in einem Trockenofen bei 60 ° C für mindestens 20 min.
   2. Objektträger in einem Färbeautomaten und verarbeitet werden durch die folgenden Reagenzien: Xylole (Xylole 1-5 min, Xylole 2 und 3-2 min, jeweils), 100% iges Ethanol (2 min), 95% Ethanol (1 min), 80 % Ethanol (30 sec), 70% Ethanol (30 sec), unter laufendem Leitungswasser (2 min), Hämatoxylin (1,5 min), fließendem Wasser (3 min), Säure-Alkohol (1 min), unter laufendem Leitungswasser (2 min ), bluing Reagenz (1 min), Fließwasser (2 min), 80% Ethanol (30 sec), Eosin (1 min), fließendes Wasser (10 sec), 80% Ethanol (1 min), 100% Ethanol (3 ändert, 2 min jeweils), Xylole (3 Änderungen, die jeweils 30 sec).
   3. Decken Sie die Objektträger mit Deckgläser, mit Montagemedium montiert.
      HINWEIS: In diesem Protokoll die geschnittene histotechnician das Paraffinblöcken auf einem Mikrotom in 5 um Abschnitte. Aus diesem Protokoll verwendeten wir einen Färbeautomaten jedoch kann gleich Ergebnisse über manuelle Färbung erhalten werden.

3. Platz in TMAs (Manual TMA Kit)

1. Erstellen Sie eine Gewebeorientierungsdiagramm, wie in 2.1 beschrieben, und den gewünschten Standort (e) des Spot zuweisen.
2. Füllen Sie den TMA Form mit geschmolzenem Paraffin bei einer Einbettung Station. Wenn die Form Abkühlen einbetten der Stelle (n) am Ende in den Rändern des TMA Form bei den von der Gewebeorientierungsdiagramm angezeigt gewünschten Stellen. Bei Bedarf halten der Stelle (n) mit einer Pinzette aufrecht, bis die Paraffin has erstarrt genug, dass der Stelle (n) wird nicht umfallen (1-2 min).
3. Montieren Sie die TMA-Kerne nach den Anweisungen des Herstellers und im Hinblick auf die Lage von der Stelle (n) in den Array-Margen (2D), und folgen Sie Standard Schnitte und Färbeprotokollen.
   HINWEIS: Bitte beachten Sie Schritt 2.6, um die Schnitte und Färbemethoden in diesem Protokoll verwendet sehen.

Ergebnisse

Der Spot wird als rund, hell farbigen Punkt in der Paraffinblock (1A und 2D), in allen Paraffinschnitten und bleibt auf dem Objektträger durch die H & E oder IHC Färbeverfahren (1B - 1D und 2D). Dieser offensichtliche visuelle Hinweis unterstützt sowohl die histotechnician und Forscher in Identifizierung jeder einzelnen Gewebestück und vereinfacht die Kommunikation als histotechnician kann der visuelle Hinweis verwenden, um die Anor...

Diskussion

Erfolgreiche Vorbereitung und Nutzung der Spots erfordert eine sorgfältige Einhaltung der wenigen technischen Schritte. Schmelzen des Hydroxyethyl Agarose sollte langsam und bei schwacher Hitze durchgeführt werden. Schnell Schmelzen bei hoher Hitze kann in gewissen Zusammenbruch der Agarose weniger als optimalen Ergebnissen führen. Beim Schneiden der farbstoffbeladenen Stecker in Stücke für die Verarbeitung, dass die Dicke jedes Teils größer ist als 4,5 mm und nicht mehr als 7 mm betragen. Die abgerundeten Enden als Abf...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Histogel Gel für die Probenverarbeitung	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Farbstoff für die Gewebemarkierung	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Jeder Gewebemarkierungsfarbstoff wäre höchstwahrscheinlich ausreichend.
Arraymold Kit A 2 mm (60 Kern)	Arraymold	20015A	Jeder manuelle Tissue-Arrayer würde ähnlich funktionieren.