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Methodenartikel

Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation

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DOI:

10.3791/52877

⸱

14. August 2015

 ,  , 
1The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Schwingungen sind grundlegende Netzeigenschaften und sind von Krankheiten und Arzneimittel moduliert. Studieren Gehirn-slice Schwingungen ermöglicht Charakterisierung der isolierten Netze unter kontrollierten Bedingungen. Protokolle sind für die Herstellung von akuten Gehirnscheiben zum Hervorrufen CA1 γ Schwingungen vorgesehen.

Zusammenfassung

Neuronale Netzwerk-Oszillationen sind wichtige Merkmale der Hirnaktivität in Gesundheit und Krankheit und kann durch eine Reihe von klinisch verwendeten Medikamente moduliert werden. Ein Protokoll ist vorgesehen, um ein Modell zur Untersuchung von CA1 γ Schwingungserzeugung (20 - 80 Hz). Diese γ Schwingungen sind stabil für mindestens 30 min und hängen von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Aktivität zusätzlich zur Aktivierung des Schrittmacherströme. Tetanically stimuliert Oszillationen haben eine Anzahl von reproduzierbaren und leicht quantifizierbar Eigenschaften einschließlich Spikezahl, Schwingungsdauer, Latenz und Frequenz, die von der Netzwerkstatus zu melden. Die Vorteile der elektrisch stimuliert Schwingungen zählen Stabilität, Reproduzierbarkeit und episodischen Akquisition ermöglicht robuste Charakterisierung der Netzwerkfunktion. Dieses Modell der CA1 γ Schwingungen verwendet werden, um zelluläre Mechanismen zu studieren und systematisch zu untersuchen, wie die neuronale Netzwerkaktivität in Krankheit und durch Medikamente verändert werden.Krankheitszustand Pharmakologie kann leicht durch den Einsatz von Gehirnschnitten, die aus genetisch veränderten oder interventionelle Tiermodellen eingebaut werden, um die Auswahl von Wirkstoffen, die spezifisch auf Krankheitsmechanismen zu aktivieren.

Einleitung

Gehirn-Netzwerk-Oszillationen treten in unterschiedlichen Frequenzbändern, die zu Verhaltenszustände zu korrelieren. Bei Nagetieren Hippocampus θ Schwingungen - werden (5 10 Hz) während der Sondierungs Verhaltensweisen 1,2 beobachtet, während γ Schwingungen (20 - 80 Hz) assoziieren mit verschiedenen kognitiven Prozesse, einschließlich der Wahrnehmung und Aufmerksamkeit 3,4. Synchron γ Netzwerkaktivität wird auch in der Pathologie von Erkrankungen wie Epilepsie und Schizophrenie 5,6 gebracht. Beispielsweise sind γ Schwingungen gedacht, um Bereiche der kortikalen Epilepsieherden 5,7,8 entsprechen und könnte als Marker der pharmacosensitivity oder Widerstands zwei wichtige Untersuchungsbereiche in Epilepsieforschung 9 verwendet werden.

Der Hippocampus Hirnschnitt ist ein Modell, das in großem Umfang verwendet wurde, um die Netzwerkaktivität 10-12 zu untersuchen. Verschiedene Protokolle wurden entwickelt, um γ Schwingungen in Hirnschnitten, die typischerweise erzeugen involve pharmakologischen Modulation, wie niedrige Mg 2+, 4-Aminopyridin (4AP) Bicucullin und Kainsäure 12-17. Mängel der pharmakologisch ausgelöst Schwingungen sind, dass sie nach dem Zufallsprinzip nach der Arzneimittelanwendung auftreten und werden nicht zuverlässig erzeugt oder über die Zeit stabil. Elektrisch ausgelöst γ Schwingungen zu überwinden viele dieser Probleme und haben auch den Vorteil, zeitlich auf die anregende Veranstaltung so dass für episodische Aufzeichnung und Analyse gesperrt. Hier ein Protokoll zur Erzeugung von CA1 γ Schwingungen durch die Bereitstellung einer tetanischen Stimulation, um das Stratum oriens im Hippocampus Scheibe beschrieben.

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Protokoll

Alle Experimente an Mäusen wurden durch die Florey Institute Tierethikkommission genehmigt.

1. Einrichtung zum Schneiden Hirnschnitten

  1. Vorbereitung einer von (mM) 125 Cholin-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 umfasst Schneidmittel, 20 D-Glucose mit Carbogen Gas (95% O 2 -5 gesättigten % CO 2) und ein künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) Aufnahmelösung (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 enthielt, 10 D-Glucose, mit gesättigter Carbogen. Legen Sie die Schnittlösung auf Eis, um sie kalt zu halten.
  2. Frieren Sie ca. 400 ml des Schneid Lösung und Mischung zusammen mit 100 ml nicht gefrorenen Schneidelösung, um ein Eisbrei erstellen. Blase mit Carbogen (95% O 2 -5% CO 2) bei einem Fluss von etwa 0,5 L / min durch kleine cAliber Schlauch oder Sinterglas, um einen stetigen, aber sanfte Strömung von Luftblasen zu produzieren.
  3. Bereiten ein 250 ml Becherglas mit einem erhöhten Nylongewebeeinlage, auf der die Gehirnscheiben platziert wird. Füllen Sie mit aCSF, um das Netz um etwa 2 cm und Blase mit Carbogen abdecken, um sicherzustellen, dass die Blasen nicht unmittelbar die Scheibe Haltebereich stören. Es ist auch wichtig, dass sich keine Luftblasen in der Nylon-Mesh, also, wenn irgendeine vorhanden entfernen. Dies wird die Haltekammer und bei RT gehalten (20 - 25 ° C).
  4. Layout Das Sezieren Instrumente, darunter eine große Schere, eine kleine Schere, kleine und große Mikro Spatel, und große und kleine Paare von Zangen und entspannen sie auf Eis. Legen Sie die Vibratom Gewebeschneiden Block auf Eis auf einem quadratischen Aluminiumfolie. Erhalten 2 Stück 6 cm Filterpapier, eine einzige Rasierklinge und einem 25-ml-Becher mit dem Schneid Lösungsaufschlämmung gefüllt als auch.
  5. Füllen Sie einen zweiten Behälter mit Eis, und legen ein Stück Gewebe paper auf dem Eis und legen Sie eine 12 cm Kulturschale an der Spitze. Füllen Sie die Kulturschale mit Schnittlösung Eisbrei und Blase mit Carbogen. Dies ist der Container, in dem das Gehirn Dissektion durchgeführt werden.
  6. Bereiten Sie die Vibratom. Entfernen Sie einen neuen zweischneidiges Rasierklinge (verwenden Sie eine frische Klinge jedes Mal) aus der Verpackung und Spray mit 80% Ethanol dann deionisiertes Wasser. Schneiden Sie ein 3-ml-Plastiktransferpipette an dem Punkt, wo es beginnt zu verjüngen. Dies wird verwendet, um Gehirnscheiben zu übertragen. Biege einen 27 G-Nadel an der Basis etwa 45 ° und heften sich an einer 1 ml-Spritze. Dies wird verwendet, um Scheiben beim Schneiden zu manipulieren.

2. Schneiden Hirnschnitten

  1. Betäuben eine Maus (P16 - P18) mit 2% Isofluran oder einer lokal zugelassenen Methode. Nach der Induktion, enthaupten, das Tier mit einem großen Schere und Tropfen den Kopf in den 12 cm Kulturschale, die mit Bläschen Schneid Lösungsaufschlämmung enthält. Der Schlamm muss völlig den Kopf eintauchen fürschnelle Abkühlung.
  2. Halten Sie die Vorderseite des Kopfes mit einer Hand Peeling die Haut und Bindegewebe nach vorn in Richtung der Nase. Mit den kleinen Schere das Bindegewebe die zugrunde liegende Schädel zu offenbaren. Dann entfernen Sie die Muskeln überlagert dorsalen Aspekt der Schädel und Hals.
  3. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel durch erste Sicherung der Vorderseite des Schädel mit den großen Zange und dann zwei seitliche Schnitte durch den Knochen auf beiden Seiten des Foramen magnum mit den kleinen Schere (Abbildung 1, Schnitte mit A1 und A2).
    1. Eine weitere Schnitt zwischen den Augen (nur Front des Bregma) (Abbildung 1, geschnitten mit B) vorsichtig entlang der Pfeilnaht geschnitten vorne und beziehen sich auf die Schnittschädelabschnitte, um das Gehirn (Abbildung 1, schneiden markierten C) zu offenbaren.
    2. Verwenden Sie den kleinen Spatel, um auf einer Kulturschale schaufelt aus dem Gehirn und den Ort. Seien Sie sich der cranial Nerven auf dem Unterrand des Gehirns die müssen getrennt werden, kann dies unter Verwendung der kleineren Mikro Spachtel erfolgen. Mit den größeren Spachtel übertragen das Gehirn, um die 25-ml-Becher mit dem Schneid Lösungsaufschlämmung gefüllt.
  4. Vorbereiten des Gehirnhälfte zum Schneiden.
    1. Legen Sie ein Stück der 6 cm Filterpapier in den Boden einer frischen Kulturschale dann mit frischen Schnitt Lösungsaufschlämmung und Blase zu füllen. Verwenden Sie den größeren Spachtel, um das Gehirn, Bauchseite nach unten zu positionieren, auf das Filterpapier. Nehmen Sie eine neue und gereinigt einzigen Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn, um das Kleinhirn zu entfernen, dann ein Schnitt entlang der Mittellinie, um das Gehirn in zwei Hemisphären zu trennen.
  5. Vorbereiten des Vibratom Gewebeblock.
    1. Nehmen Sie die gekühlte Vibratom Gewebeblock, trocknen Sie die Oberfläche, und einen Tropfen Sekundenkleber in der Mitte und gleichmäßig verteilt auf die ungefähre Größe des Gehirns. Verwenden Sie den kleinen Spatel zu einem der ManipulationGehirnhälften auf die große Mikro Spatel so dass die mediale Seite des Gehirns ab.
    2. Berührt die Kante der Spatel an der Grenzfläche des Gehirns auf dem zweiten Stück Filterpapier, um so viel von der Lösung, wie möglich zu entfernen. Schieben des Gehirns abseits grosser Spatel unter Verwendung der kleineren Spatel, um es auf den Leim zu führen.
    3. Sichern Sie den Schneideblock in die Vibratom Kammer und füllen Sie die Kammer mit Schneid Lösungsaufschlämmung und Blase, wodurch das Gehirn vollständig eingetaucht ist. Drehen Sie den Schneideblock, so dass die Bauchseite des Gehirns wird die Klinge gegenüber.
  6. Schneiden des Gehirns.
    Hinweis: Jeder Vibratom ist einzigartig, so folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    1. Stellen Sie die Scheibendicke zu 450 & mgr; m, und sicherzustellen, dass die Klinge schwingt, wie es durch das Gehirn bewegt sich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,3 mm / s. Vollständig durch das Gehirn von der Bauchseite zu der kortikalen Oberfläche schneiden, wird diese ganze Gehirn sagittal, die B produzierene für elektrophysiologischen Ableitungen verwendet. Slices werden seitlich an medial produziert werden und in der Regel 3-4 Scheiben können aus jeder Hemisphäre abgeschnitten werden.
    2. Wenn die Basis der Scheibe Aufzüge benutzen Sie den gebogenen 27 G Nadel sanft drücken Sie die Scheibe wieder nach unten. Da jede Scheibe geschnitten wird, verwenden Sie die Transferpipette, um es auf die Plattform in der Haltekammer, wo sie lebensfähig für bis zu 8 Stunden sind zu bewegen.

3. Extrazelluläre Elektrophysiologie Recordings

  1. Montage der Scheibe in der Aufnahme Kammer.
    1. Unter Verwendung der Transferpipette, legen Sie einen Hirnschnitt in einem untergetauchten Aufnahme Kammer mit aCSF in 1 fließt perfundiert - 2 ml / min und 32 ° C erhitzt. Das für Aufzeichnungen verwendet aCSF unterscheidet sich von der in der Haltekammer wie der Mg 2+ -Konzentration von 2 bis 4 mm vergrößert.
    2. Befestigen Sie die Scheibe mit einem "Harfe" (halbkreisförmige Edelstahl mit Nylon-Stränge an erstreckte sich über 2 - 3 mm Abstand). Platzdie Harfe so dass die Stränge parallel laufen zu CA1. Erhöhen die Geschwindigkeit der Perfusion zum 8 - 10 ml / min bei 32 ° C.
  2. Unter einem Präpariermikroskop Ort eine Stimulationselektrode und eine Aufzeichnungselektrode (Glaselektrode mit der Aufzeichnungslösung gefüllte aCSF) auf der Oberfläche des Stratum radiatum von CA1 (2A). Setzen Sie den ersten Stimulationselektrode dann die Aufzeichnungselektrode.
  3. Stimulieren die Schaffer-Kollateralen mit 120-150 & mgr; A Amplitude und 0,1 ms Dauer Testimpuls und beobachten Sie die resultierende Feld exzitatorischen postsynaptischen Potentials (fEPSP) Wellenform zu bestimmen, slice Gesundheit (2B). Die anregenden und Aufzeichnungselektroden müssen möglicherweise in die Scheibe bewegt werden etwa 50 bis 100 & mgr; m von der Scheibenoberfläche ein fEPSP Aufnahme mit einer kleinen Faser volley und großer Amplitude zu erhalten. Der Schaffer Sicherheiten evozierte fEPSPs sind stereotype und ein guter Indikator für die Gesundheit Scheibe. HEalthy Scheiben zeigen typischerweise einen Faser volley zum Amplitudenverhältnis von weniger als 0,3 fEPSP.
  4. Neupositionierung der Elektroden.
    1. Verwendung eines Seziermikroskops Bewegen der Stimulationselektrode zu der Mitte der Schicht oriens und bewegen die Aufzeichnungselektrode auf den pyramidalen Zellschicht so nahe an die Aufzeichnungselektrode wie möglich, wie in 3A gezeigt. Die anregenden und Aufzeichnungselektroden müssen möglicherweise in die Scheibe gedrückt werden etwa 50 bis 100 & mgr; m, so dass die fEPSP Antwortamplitude in die 120-150 uA Testimpuls ist ungefähr 1 mV.
  5. Erzeugen γ Schwingungen.
    1. So generieren γ Schwingungen stimulieren das Gewebe mit einem Zug von 20 x 0,1 bei 200 Hz geliefert msec Pulse. Diese tetanischen Stimulus können reproduzierbare Reaktionen ergeben bei Auslieferung alle 5 min.
  6. Verwenden Sie die folgenden Aufnahmeparameter.
    1. Skalieren Sie die Verstärkung des Ausgangssignals, um den Eingangsspannungsbereich entsprechenDer Analog-Digital-Wandler. Sicherzustellen, dass die maximale erwartete Signal Exkursion wird ein Minimum von 30% der Eingangsspannungsbereich. Seien Sie vorsichtig bei der Einstellung Gewinne zu hoch wie Signale könnten Clip. Die typische Bandbreite für Feldaufnahmen gebraucht wird, ist 500 Hz bei AC-Kopplung bei 0,1 Hz, um Basisliniendrift zu entfernen.
    2. Digitalisieren mindestens 4-5 mal schneller als die Eckfrequenz des Tiefpassfilters, um Signal Aliasing zu vermeiden.
  7. Datenanalyse.
    1. Hochpassfilter Daten bei 5 Hz, alle Grundlinie verschiebt sich zu entfernen. Identifizieren Spikes mit einem Derivat Schwelle mit einer Mindest Ereignis Trennung von 10 ms, ein typisches Ereigniszeit zu Spitze und Regressions Intervall von 7 ms ein Schwellenwert von ~ 100 mV / msec und einer Trenn Tal von 100%. Berechnen Latenz die Zeit für den ersten identifizierten Spike ergriffen werden, um nach dem Ende des Stimulationsartefakt auf. Diese Analyse ermöglicht die Charakterisierung der Anzahl von Spikes, Latenz, inter-Ereignisintervall und die Dauer berechnet alsfolgt:
    2. Berechnung der Anzahl der Spitzen als die Gesamtzahl der Spitzen pro Schwingung für jeden Durchlauf bestimmt.
    3. Berechnen Sie die Schwingungs Latenz. Für jede Schwingung, subtrahieren die Zeit des ersten identifizierten Spitze vom Ende des Stimulationsartefakt.
    4. Berechnen Sie die durchschnittliche inter-Ereignis-Intervall (ISI). Bestimmen Sie die Zeitdauer zwischen mehreren erfassten Spitzen und Durchschnitt.
    5. Berechnen Sie die Schwingungsdauer. Messen Sie die Zeit zwischen dem ersten und letzten erkannten Spitze innerhalb jeder Schwingung.

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Ergebnisse

Tetanische Stimulation der Stratum oriens erzeugt robuste und reproduzierbare γ Schwingungen (35,4 ± 2,2 Hz), siehe Abbildung 3B. Um zu demonstrieren, dass die Schwingungen wurden innerhalb des lokalen Netzwerks CA1 die Eingänge von CA3 wurden, indem die Scheibe in der CA2 Region mit einem gebogenen 32 G Nadel getrennt erzeugt. Die Schwingungseigenschaften in den geschnittenen Scheiben nicht von den unbeschnittenen Scheiben unterscheiden (p = 0,85; geschnittenen Scheiben 6,16 ± 1,1 Spitzen, n = 6; uncut...

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Diskussion

Eine robuste Methode, um CA1 γ Schwingungen in akuten Hirnschnitten zu erzeugen, beschrieben. Die erzeugten Schwingungen ergeben sich aus einer lokalen Schaltung ermöglicht eine bessere Gelegenheit für die Steuerung und das Verständnis der neurophysiologischen Grundlagen der Netzwerkschwingungen 12. AMPA-Rezeptoren, GABA A -Rezeptoren, I h und T-Typ Ca2 + -Kanäle sind alle für γ Schwingungen in diesem Modell erforderlich. Während die lokalen hier beschriebenen CA1 Schwingungen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Unterstützt von APA an RJH, NHMRC-Programmzuschuss 400121 an SP und NMHRC-Stipendium 1005050 an SP. CAR bedankt sich für die Unterstützung des ARC (FT0990628) und des DOWD-Stipendienprogramms. Das Florey Institute of Neuroscience and Mental Health wird von Infrastrukturfonds der Regierung des Bundesstaates Victoria unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2-dimethyl-6-(methylamino)pyrimidiniumchlorid (ZD7288)Sigma-AldrichZ3777
BiucullinSigma-Aldrich14340
6-Cyano-7-nitrochinoxa-line-2,3-dion (CNQX)Sigma-AldrichC127
NickelSigma-Aldrich266965
CarbamazepinSigma-AldrichC4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-at (APV)Tocris Bioscience0105
RetigabinChemPacific150812-12-7
Cholin-ClSigma-AldrichC1879-5KG
KClSigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-250G
NaHCO3Sigma-AldrichS6297-250G
NaClSigma-AldrichS7653-5KG
GlukoseSigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 & Bull; 2H2OSigma-Aldrich223506-500G
MgCl2 & Stier; 6H2OSigma-AldrichM2670-500G
ElektrodenglasHarvard Gerät GC150F-10
Konzentrische bipolare stimulierende MetallelektrodeFHCCBBPF75
Digitaler IsolatorGetting InstrumentsModell BJN8-9V1 
Verstärker Modell 1800A-M-SystemeVerstärker Modell 1800 Digitizer
Nationale InstrumenteNI USB-6211
VibrotomeLeicaVT1200s

Referenzen

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