Methodenartikel

Implementierung von In-vitro- Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

DOI:

10.3791/52879

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9. Dezember 2015

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1H3 Biomedicine, 2Massachusetts General Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Drug Resistenz gegen gezielte Therapeutika ist weit verbreitet und die Notwendigkeit, die Mechanismen der Resistenz zu identifizieren - vor oder nach dem klinischen Einsetzen - ist entscheidend für die Führung alternative klinische Management-Strategien. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu koppeln, Ableitung von Medikamenten-resistenten Linien in vitro mit Sequenzierung zur Entdeckung dieser Mechanismen zu beschleunigen.

Zusammenfassung

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Obwohl zielgerichtete Therapien zunächst wirksam sind, entstehen unweigerlich Resistenzen. Verschiedene Methoden, wie z. B. die genetische Analyse resistenter klinischer Proben, wurden angewendet, um diese Resistenzmechanismen aufzudecken und die Nachsorge zu erleichtern. Obwohl diese Ansätze zu klinisch relevanten Entdeckungen geführt haben, haben Schwierigkeiten bei der Beschaffung des relevanten Patientenmaterials oder bei der Entfaltung der aus diesen Proben gesammelten genomischen Daten den Weg zu einer Heilung stark behindert. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier ein Instrument für eine schnelle Entdeckung, das zur Verbesserung von Erstlinientherapien und alternativen klinischen Managementstrategien führen kann. Durch die Kopplung der präklinischen in vitro oder in vivo Wirkstoffauswahl mit der Next-Generation-Sequenzierung ist es möglich, genomische strukturelle Variationen und/oder Veränderungen der Genexpression zu identifizieren, die als funktionelle Treiber der Resistenz dienen können. Dieser Ansatz erleichtert das spontane Auftreten von Veränderungen und erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass diese Mechanismen bei den Patienten beobachtet werden können. In diesem Protokoll stellen wir Richtlinien zur Verfügung, um das Potenzial für die Aufdeckung von Einzelnukleotidvarianten zu maximieren, die die Resistenz durch adhärente Linien fördern.

Einleitung

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Detaillierte molekulare Charakterisierung von Tumor Genome durch robuste Sequenzierungstechnologien und verbesserte Datenanalysewerkzeuge hat zur Entdeckung der wichtigsten genetischen Veränderungen in bestimmten Krebsarten 1,2 geführt. Entwicklung von gezielten Therapien bei diesen genetischen Läsionen, wie HER2, BCR-ABL, EGFR und ALK abzielen, haben sich deutlich verbessert die Lebensqualität für die Patienten 1,2. Doch trotz der Spezifität dieses Ansatzes, das klinische Ansprechen auf die meisten Einzeltherapien hat suboptimal war als Widerstand letztendlich entsteht. Vor kurzem hat bedeutende Fortschritte im Verständnis der molekularen Grundlagen der Resistenz gegen gezielte Therapeutika erzielt. Interessanterweise ist es immer klar, dass ein prominenter Mechanismus der Resistenz beinhaltet anhaltende Ziel / Signalweg-Aktivität. Als ein Beispiel dafür, Androgen-Rezeptor (AR) -dirigierten Enzalutamid Behandlung von Prostatakrebs führt zu Anreicherung von aktivierenden Mutationen im AR selbst, die Aufrechterhaltung AR-Signalisierung output in Gegenwart des Inhibitors 3-5. Diese Erkenntnis hat zu einer aggressiven Kampagne, um 1 LED) zu entwickeln Antagonisten der dritten Generation, die auch weiterhin sowohl WT und Mutanten-AR-Funktion in drücken kann Enzalutamid feste PCa 3 und 2) identifizieren potenzielle nachgeschaltete Knoten des AR-Signalisierung, die für eine therapeutische Intervention ausgerichtet werden kann . In ähnlicher Weise eine Resistenz gegen andere Klassen von Inhibitoren, wie jene für EGFR, BRAF und ABL häufig Mutationen, die die ursprüngliche süchtig-Kinase-Weg 1 Reaktivierung führen.

Mit dem Wissen, dass der Widerstand zwangsläufig bei den meisten Patienten tritt, die Entwicklung von Konzepten, um zügig zu bringen, diese Mechanismen, um Licht Entwicklung wirksamer Follow-up-Therapien ermöglichen. Ein Ansatz, der vielfältig eingesetzt wird ist es, die Genomik von klinischen refraktären Tumoren in Bezug auf nicht vorbehandelten oder sensitiven Tumoren, um Anreicherungen / Abreicherungen in genetische Läsionen, die zugänglich d sein könnten analysierenTeppich Entdeckung. Trotz der Versprechen, gibt es zwei große Schulden dieser Vorgehensweise, die eine schnelle Entdeckung behindern. Erstens gewinnt rechtzeitigen Zugang zu Tumormaterial für genomische Verhör kann als eine wesentliche Hürde bei der Bewegung von der Therapie zur Heilung dienen. Zum anderen können die Entfaltung der Vielzahl von genetischen Läsionen in der beständigen Einstellung schwierig sein, da Tumoren signifikant intratumorale Heterogenität 6,7 präsentieren.

Angesichts dieser Herausforderungen hat es auf präklinische Entdeckung von Resistenzmechanismen wurden verstärkt herangezogen. Dieser Ansatz kann Identifizierung von prominenten Resistenzmechanismen vor den klinischen Studien 1, die alternative klinische Managementstrategien bei Patienten, die diese Mechanismen entweder vor der Therapie oder nach dem Einsetzen des Widerstands tragen führen können zulassen.

Eine solche präklinischen Discovery-Tool, das in großem Umfang verwendet wird, ist es, unvoreingenommene funktionelle RNAi-Screens gelten. Für Prüfungsweise Whittaker und Kollegen angewandt eine genomweite RNAi-Bildschirm zu erkennen, dass NF1 Verlust vermittelt Resistenz gegen RAF und MEK-Inhibitoren durch nachhaltige MAPK Signalweg-Aktivierung 8. Diese Ergebnisse wurden gefunden, um klinisch relevant wie loss-of-function Mutationen im NF1 wurden in BRAF -Mutante Tumorzellen, die intrinsisch resistent gegen RAF-Hemmung und in Melanomtumoren beständig Aktivierung 8 Vemurafenib sind beobachtet. Trotz des Erfolgs dieser Ansatz vielen klinisch relevanten Ziele werden häufig nicht identifiziert, vermutlich aufgrund der Loss-of-function-Vorspannung dieses Ansatzes.

Im Gegensatz dazu ist eine weniger voreingenommen Werkzeug für präklinische Entdeckung von Resistenzmechanismen beinhaltet die Erzeugung von resistenten Zelllinien bei längerer Exposition gegenüber Verbindung von Interesse verbunden mit NGS-basierte genomische oder Transkriptom-Profiling. Dieser Ansatz wurde von mehreren Gruppen durchgeführt, um zu ermitteln spontanewiederkehrende Einzel-Nukleotid-Varianten oder Ausdruck Veränderungen, die Widerstands 5,9,10 zu ermöglichen. Zum Beispiel wurde ein wiederkehrendes F876L Mutation AR kürzlich resistente Klone in vitro 3-5 und in Xenotransplantat-Tumoren in vivo 5 vor der Identifizierung der Mutation in der Klinik 4 entdeckt. Erst kürzlich Bhang und Kollegen (2015) 11 in zwei klinisch relevanten Modellen verwendet ClonTracer, dass Mehrheit der resistente Klone, die während der verlängerten Arzneimittelexposition entstehen, waren Teil einer bereits bestehenden Subpopulation darauf hindeutet, dass die meisten funktionell relevante Mutationen zeigen, sind wahrscheinlich bereits vorbestehenden dass geworden für die bei der Auswahl 11 ausgewählt.

Im Gegensatz zu der genomischen Profilierungs von Tumoren früher diskutiert, dieser Ansatz wird zudem weniger Heterogenität als "homogene" resistente Klone werden zur Analyse verwendet Erleichterung genauer Genetik der potentielle Fahrer. FurthermErz, aufregend, zusätzlich zu dem Potential für die Aufdeckung Resistenzmechanismen, kann dieses Verfahren auch angewendet werden, um die zellulären Mechanismen der Wirkung und Targets von bioaktiven kleinen Molekülen für die diese Information nicht bekannt ist 10 identifizieren. Angesichts der klaren Vorteile und die Mehrfachnutzung von diesem Ansatz, hier präsentieren wir ein Protokoll Detaillierung erfolgreiche Umsetzung eines solchen präklinischen Bildschirm, um das Potential für klinisch bedeutsame Entdeckungen zu maximieren.

Protokoll

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1. Bewertung der GI 50 für die Verbindung (en) in der Nähe

  1. Erzeugen Wachstumskurve (n) für die Zelllinien von Interesse, den entsprechende Aussaatdichte zu bewerten. Zeichnen Sie die Zellzahl zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Aussaat (Tage 2, 4, 6 und 8) in Bezug auf Tag 0. Dadurch wird eine relative Wachstumsrate der Zelllinie von Interesse bereitzustellen und sollte verwendet werden, um die anfängliche Aussaatdichte, so dass beurteilt werden Konfluenz in Platten mit 96 Vertiefungen innerhalb von 7 Tagen erreicht.
  2. Einmal Wachstumskurven bestimmt worden sind, Saatgut geeignete Anzahl von Zellen in nicht-transparente, klare Bodenplatten mit 96 Vertiefungen in 100 & mgr; l Zellmedium, um GI 50 beurteilen. Seed die Anzahl der Zellen auf der Grundlage der verwendeten Zelllinie und in 1,1 bestimmt. Typischerweise seed 3x10 3 Zellen für schnell wachsende Zelllinien mit einer Verdoppelung Zeit von ~ 24 Stunden, z. B. HCT116.
    1. Bereiten Sie eine Assayplatte (Tag-1). Für die Assay-Platte, Samenzellen im gewünschten Dichte in 100 ul Kulturmedium in Vertiefungen in blau schattiert (Abbildung 1). Wells markiert in weiß enthalten nur Medien.
    2. Bereiten Sie eine Steuerplatte (Tag-1). Für die Steuerplatte, Samen der gleichen Zelldichte wie in Schritt 1.2.1 in 100 ul Kulturmedium in einem separaten 96-Well-Platte. Dieser "Tag 0" Messwert wird bei der Auslegung der zytostatischen / zytotoxischen Art der Verbindungen zu helfen, die analysiert wird (Abbildung 2).
  3. Am nächsten Tag (Tag 0), lesen Sie die Steuerplatte. Äquilibrieren Leucht Zellviabilität Reagenz (CellTiter-Glo Substrat mit Puffer nach den Anweisungen des Herstellers gemischt), um RT und vorsichtig invertiert Inhalte, um eine homogene Lösung zu erhalten. Werden 80 ul Reagenz zu den 100 ul Zell / Media-Mix und schütteln Inhalt 30 min auf Zelllyse induzieren.
    1. Nehmen Lumineszenz mit einem Luminometer, um einer Belichtung von 0,1 bis 1,0 sec und Detektionswellenlänge von 560 nm eingestellt.
  4. In Testverbindungen (Verbindungenvon Interesse), um Platten (Tag 0) testen. Machen Sie eine 1: 4 serielle Verdünnung von Verbindungen in DMSO bei 200-facher Endkonzentration für insgesamt 10 Konzentrationen (9 Verdünnungen haltigen Verbindung und einem DMSO nur, Verbindung Platte). Als Anfangsausgangspunkt, Ziel für eine 200x niedrigsten Dosis von 0,03 um und einem oberen Dosis von 2000 & mgr; M (Endvolumen 200 ul).
  5. In seriell verdünnt Verbindungen bis mittel, um eine Verbindung-Medium-Mix auf 10x Endkonzentration (Endvolumen 100 ul, Zwischenplatte) zu machen. Bewahren Sie die Verbindung Platte bei -20 ° C für den Einsatz am 3. Tag des Assays. Zugabe von 10 & mgr; l der Verbindung Mittelmischung, um Zellen in dreifacher Ausführung, so dass die höchste Dosis von 10 uM (z. B. die Reihen B, C und D, Tag 0) (Abbildung 1). Inkubieren Testplatten für 3 Tage bei 37 ° C. Entsorgen Zwischenplatte (n) nach dem Gebrauch.
  6. Am Tag 3, bereiten Sie einen 400 ul 1x Verbindung-Medium-Mix unter Verwendung der Verbindung in Platten 1.4 vorbereitet. Kehren Assayplatten Medien entfernen und trocken tupfen auf Autoclaved Papierhandtücher 2-3x Restmedien entfernen. In Verbindung / Medien (100 ul / Vertiefung) in die Vertiefungen in blau schattiert und fügen Sie 100 ul von Medien, um Umfang Brunnen, um Verdunstung (Abbildung 1) zu verhindern. Wieder inkubieren Testplatten bei 37 ° C für weitere 3 Tage.
  7. Am Tag 6 beurteilen relative Anzahl an lebensfähigen Zellen durch Ausführen eines Lese Lumineszenz, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
  8. Verwenden Sie den Tag 0 Lesen, um die statische / toxische Natur der Verbindungen zu bewerten. Giftstoffe Apoptose der Erwägung, dass Zytostatika induziert Zellzyklusarrest. Wenn Verbindung toxisch ist (Tag 6 Messwert unter Tag 0 Lesung), prüfen, die Wahl GI 50 und GI 50 x 5-Konzentrationen für die Resistenz-Tests. Allerdings, wenn die Verbindung induziert Stasis (gleich oder höher ist als d0 Lesung), sollten GI 100 und GI 100 x5 für Widerstands Assays (Abbildung 2).

2. Einrichten Drug Resistance Assays

  1. Wenn Arbeits witha Zytostatikum, Samenzellen bei einer Konfluenz von 30-40% in 150 mm 2 Gewebekulturschalen (Volumen = 30 ml) für das Resistenzassay. Wenn die Arbeit mit einem toxischen Mittel, Saatgut zu einem 70-80% Zusammenfluss.
  2. Für Zelllinien, die ein intaktes Mismatch-Reparatur (MMR) -Mechanismus beherbergen, Inkubation Zellen aus Schritt 2.1 O / N bei 37 ° C mit dem Karzinogen N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU). Behandlung von Zellen mit 30 ul einer Stammlösung von 50 mg / ml ENU (Endkonzentration 50 ug / ml), um genomische Instabilität verstärken. Für Zelllinien, die eine defekte MMR (Tabellen 2 und 3), kann die Behandlung mit ENU oder andere Karzinogene nicht notwendig sein müssen.
    1. Für andere Zelllinien zu bestimmen MMR-Defizienz durch NCI Kriterien mittels Mikrosatelliteninstabilität 12 oder auf der veröffentlichten Charakterisierung mit Mikrosatelliten-Instabilität Assays oder genomische / epigenomischen Profilierung MMR-Genen 13-15 basieren.
  3. Genuss-Zellen mit der Testverbindung (en)Interesse an der Konzentration in Schritt 1.8 festgelegt. Für hochtoxische Verbindungen, die den Zelltod in einer typischen Drei-Tage-Lebensfähigkeitstest 10 führen, mit einer niedrigen Dosis-Behandlung (dh GI 50) beginnen und schrittweise zu erhöhen die Konzentration (ein Vielfaches von GI 50) der Verbindung alle 2-3 Wochen, bis robust Festigkeit zu beobachten ist. Aufzufüllen Medien und Verbindung alle 3 d.
  4. Sobald die Auswahl erfolgt ist, dann Wechselmedien / Verbindung mischen alle 3-4 Tage, bis resistente Klone entstehen. Resistance per Definition ergibt sich, wenn behandelten Zellen zeigen mehr Wachstum / Lebensfähigkeit während der Medikamentenbehandlung in Bezug auf akute Behandlung von DMSO-behandelten Kontrollzellen.

3. Isolieren von Einzelzellklone

  1. Untersuchen Kulturschale unter Verwendung von Phasenkontrast-Mikroskopie (Vergrßerung 40x) lebensfähige Zellhaufen.
  2. Filter zufriedenstellend Klone am Boden der Schale mit einem Markierungsstift. Pick-Klone, die von mittlerer Größe sind (größeren Kolonien kannstammen aus mehreren Zellen) und gut von anderen Kolonien isoliert. Pick-Klonen unter Verwendung eines der beiden Ansätze in Schritt 3.3 dargestellt.
  3. Ansatz 1: Mit einer Pipette (Abbildung 3)
    1. Entfernen Wachstumsmedien und spülen Sie mit 1x PBS, alle schwimmenden Zellen zu entfernen.
    2. Verwenden Sie schwarze Flecken als Führer zu "pflücken" Klonen mit Pipettenspitze (zur Pipette angebracht, p200 bevorzugt).
    3. Transfer-Klone in 48-Well-Platten mit 200 ul frisches Medium (mit Halbverbindungskonzentration, um eine optimale Wiederherstellung von Zellen zu ermöglichen).
    4. Lassen Sie Zellen für 2-3 Tage vor der Zugabe von 200 & mgr; l frisches Medium / ideale Verbindungskonzentration zu erholen.
    5. Weiter zum Medium / Verbindung wechseln alle 3-4 Tage und weiter, um Klone zu erweitern.
  4. Ansatz 2: Verwenden Cloning Discs (Abbildung 3)
    1. Markieren Sie Klonen, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
    2. Platzieren 3 mm Klonieren Scheiben in einer 10 cm-Gewebekulturschale mit 5 ml 0,25% trypsin-EDTA für 2 min.
    3. Absaugen Medien aus Schale mit resistenten Klone und Overlay-Klone mit Trypsin getränkt Klonen Discs mit sterilen Einweg Pinzette.
    4. Lassen Sie für 1-2 Minuten, je nachdem wie leicht Klone heben von den Platten, in einem 37 ° C Inkubator.
    5. Pick up Klonen Discs mit einer sterilen Pinzette und Transfer in 48-Well-Platten mit 200 ul frisches Medium und die Hälfte Konzentration der Verbindung.
    6. Pipette nach oben und unten vorsichtig, um die Zellen von Klonen Scheiben lösen und inkubieren O / N bei 37 ° C (lassen Sie das Klonen Scheiben in Brunnen).
    7. Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Klonen-Discs von 48-Well-Platten und füllt Vertiefungen mit 200 ul frisches Medium / Verbindung (Halb ideale Verbindungskonzentration).
    8. Drei Tage später wieder aufzufüllen Medien mit der idealen Konzentration der Verbindung.
    9. Weiter verändern Medien / Verbindung alle 3-4 Tage und weiter, um Klone zu erweitern.

4. Bewertung Grad Reständigkeit der isolierten Klone

  1. Einmal 10-20 Kolonien werden expandiert, erzeugen GI 50 Kurven, wie in Schritt 1 beschrieben, um den Grad der Resistenz zu beurteilen.
  2. Immer auch Kontrollpopulationen mit DMSO während des Auswahlprozesses behandelt. Es ist sehr wahrscheinlich, dass das Spektrum des Widerstandes geht, groß zu sein (etwas, das teilweise, während andere, die vollständige Resistenz). Sammeln einige Klone aus jeder dieser Klassen, da der Mechanismus der Resistenz kann zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich sein.

5. Next-Generation-Sequencing-

  1. Spin down 2 Millionen Zellen (Kontrolle und resistente Klone) (500 xg für 5 min) in 15 ml konischen Röhrchen sowohl gDNA und RNA-Sammlung (also 2 x 2 Mio.).
  2. Zweimal waschen mit 1x PBS und frieren Pellets in -80 ° C bis bereit für die Isolierung.
  3. Verwenden Sie eine kommerzielle Extraktions-Kits zur RNA oder gDNA nach Herstellerprotokoll isolieren.
  4. Proben für die Next-Generation-Sequenzierung abschickenVerwendung Anbieters Protokoll 10.

6. Bioinformatik Analyse der Proben (Ganz Exom-Sequenzierung)

  1. Vorverarbeitung Sequenzdaten nach Best-Practice-DNA-seq-Pipeline 16.
    1. Karte Alles liest menschlichen Genoms GRCh37 mit BWA 17 verweisen. Konvertieren Sie unkomprimierte SAM formatiert Ausrichtungen komprimiert BAM-Format mit samtools 18. Ausrichtungen Sortierung koordinieren mit samtools. In Lesegruppen mit Picard. (Für spezifische BWA, samtools und Picard befiehlt, siehe Zusatztext 1, Zeilen 1-4)
    2. Markieren Sie alle Duplikate liest mit dem Befehl MarkDuplicates von der Picard-Werkzeugsatz 19. Index Diese Datei mit samtools. (Ergänzungstext 1, Zeilen 5-6)
    3. Um übereinstimmende Basen Minimierung über alle liest, neu auszurichten lokal liest in Regionen beherbergen kleine Insertionen oder Deletionen unter Verwendung eines indel realigner 20. (Ergänzungstext 1, Zeilen 7-8)
    4. Um die Accurac weiter zu verbesserny der Variante Berufung, empirisch Recalibrate Basisqualität Partituren mit einer Base Qualitätsfaktor Neukalibrierwerkzeug. Die Basisqualität Kalibrierwerkzeug sollte nicht nur korrekte Anfangsqualitätsfaktor, sondern auch berücksichtigen Kovariation von mehreren Funktionen, einschließlich lesen Gruppe, Maschinenzyklus, Grundstellung und Dinucleotid-Kontext (Vor- + Strom Basen) zu nehmen. Generieren Sie neu kalibriert BAM mit Picard PrintReads. (Für spezifische Befehle für diesen Schritt, siehe Zusatztext 1, Zeilen 9-10)
    5. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.1 bis 6.1.4 (Ergänzender Text 1, Zeilen 1-10) für jede Probe sequenziert.
  2. Identifizieren Sie Einzel-Nukleotid-Variation (SNV) in jedem Klon mit einem gekoppelten Variante ruft tool19, 21-23. Für jeden Klon sequenziert, ruft laufen gepaart Variante mit der elterlichen Klon als die ausgeglichene "normal". (Ergänzende Text 1, Zeile 11)
  3. Filtern sie wiederkehrende, qualitativ hochwertige Varianten und die Vorbereitungen für Annotation mit einer Variante Anmerkungswerkzeug 24. Deprioritize vaführungen nicht für alle resistenten Klone. (Siehe R-Skript im Ergänzungstext 2)
  4. Anmerken Varianten mit einem Anmerkungswerkzeug 25, 26. Viele Variante Anmerkungswerkzeuge eine begleitende Web-App so dass Daten hochgeladen und von einem Remote-Server verarbeitet werden müssen.
  5. Verwenden Sie einen funktionellen Auswirkungen Vorhersagewerkzeug 27-29, jene Varianten mit hohen funktionellen Auswirkungen vorhergesagt zu priorisieren. Wie Variante Annotation gibt verschiedene Tools für die funktionelle Auswirkungen Vorhersage über eine Web-Schnittstelle zur Verfügung.

Ergebnisse

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Um das Potenzial für die Entdeckung der wichtigsten Funktionstreiber des Widerstands zu maximieren, wählen Sie Einzelzellklone für die Expansion, phänotypische Tests und Sequenzierung. Wie in 4A dargestellt ist, HCT116-Zellen über einen längeren Zeitraum mit einer zytotoxischen Verbindung # 1 führte zur spontanen Entstehung resistenter Klone, die bei der Behandlung (gestrichelte schwarze Kreise) wachsen weiter behandelt. Diese Klone wurden mit Ansatz # 1 die in Abbildung 3 und anschließend für phänotypische Analysen expandiert gerichtet. Wie in 4B gezeigt ist, resistente Klone 1-3 zeigten alle signifikanten Widerstand in die Verbindung # 1 und die enge analoge Verbindung # 2 (größere Lebensfähigkeit / Wachstum), alle Klone zeigten eine Empfindlichkeit gegenüber einem nicht verwandten zytotoxische Verbindung VELCADE. Nach der Bestätigung der phänotypischen Resistenz, gDNA wurde isoliert und für die Ganz Exom-Sequenzierung Analyse unterzogen. Bioinformatik-Tools wurden angewandt, um auf diesen Strukturvarianten einzugrenzen, dasssind 1) wiederkehrende und 2) haben das Potenzial für funktionelle Auswirkungen (5A). Strukturvarianten, die diese beiden Kriterien erfüllt wurden von einem unabhängigen Sequenzierungswerkzeug bestätigt. Wie in 5B, einem heterozygoten Missense-Mutation, die mit Ganz Exoms Sequenzierung wurde mit der Sanger-Sequenzierverfahren bestätigt identifiziert wurde, dargestellt (obere Tafel, WT Sequenz; untere Platte, mutierten Sequenz). Nach Sequenzbestätigung, die elterliche Zelllinie, die ursprünglich für den Widerstand Test verwendet wurde gentechnisch verändert, um das mutierte cDNA exprimieren funktionell bestätigen die Rolle der Mutation. Wie in Figur 6 dargestellt, während die Überexpression des WT cDNA konnte Resistenz, erzwungene Expression der mutierten cDNA deutlich tragenen phänotypischen Resistenz zu Verbindung # 1, bestätigt die funktionelle Rolle dieses Strukturvariation als Fahrer des Widerstands. Alle Reagenzien für dieses Experiment sind in der Tabelle 1 umrissen trong>.

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Abbildung 1. Aufbau des Assays und Steuerplatten. Blauton, Verbindung Behandlung Brunnen. Weiß Schatten, nur Medium. Verbindungen werden seriell verdünnt 1: 4 und in Triplikaten (BD oder EG) verabreicht. 2 Verbindungen pro Platte aufgebracht werden.

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Abbildung 2. Repräsentative Lebensfähigkeit Kurven. Rot gepunktete Linie stellt den Tag 0 Lesen. X-Achse zeigt die steigende Dosen der Verbindung nach rechts und y-Achse relativ zur Lebensfähigkeit DMSO Kontrollvertiefungen darstellt. GI 100 = Dosis verwendet werden, um 100% Wachstumshemmung zu erreichen; GI 50 = Dosis verwendet werden, um die Lebensfähigkeit von 50% des DMSO-Kontrolle zu reduzieren.

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Abbildung 3. Zwei Ansätze für die Kommissionierung resistente Klone für Expansion. Anfahrt 1- Verwendung Pipette abholen und Transfer gut definierten Klone auf 48-Well-Platten. Ansatz 2- Verwendung Trypsin getränkten Klonierung Scheiben, um Klone zu heben und zu übertragen, um Platten mit 48 Vertiefungen.

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Figur 4. Bestätigung der für HCT116-Klonen erreicht werden, um Verbindung # 1 in vitro-Resistenz. (A) Verbindung # 1 beständigen HCT116 Klone entstanden folgende kontinuierliche dreiwöchigen Selektion. (B) Die Lebensfähigkeit der Kontrolle und resistente Klone wurden nach 72 h Behandlung mit verschiedenen Verbindungen getestet. Verbindung # 2 ist ein enger Analogon von Verbindung # 1. Bortezomib wurde als Kontrolle zytotoxische Mittel verwendet. Die Daten sind als mittlere + Standardabweichung von drei biologischen Wiederholungen gezeigt.


Abbildung 5. Identifizierung eines einzigartigen, wiederkehrende Mutation (Einzel-Nukleotid-Varianten, SNVs) im Gen A in Verbindung # 1 feste HCT116 Klone. (A) Arbeitsablauf in allen resistenten Klonen vorhanden SNVs identifizieren und vorhergesagt, dass eine hohe funktionelle Auswirkungen haben von MutationAssessor. (B) Bestätigung der Mutation im Gen für eine durch die Sanger-Sequenzierung.

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Abbildung 6. Re-Expression des mutierten Gens A tragenen Widerstand zu Verbindung # 1 in vitro. Die Lebensfähigkeit der engineered HCT116-Zelllinien wurde nach 72 h Behandlung mit der Verbindung # 1 getestet. HCT116-WT oder mutierten Zellinien werden stabil exprimierende WT oder mutierten cDNAs von Gen A verbunden. Die Daten sind als mittlere + Standardabweichung o gezeigtf drei biologischen Replikaten.

Sample Name Aminosäure Primärgewebe Zygosität
C-33-A p.E768fs * 44 Gebärmutterhals Heterozygot
C-33-A p.S860 * Gebärmutterhals Heterozygot
CML-T1 p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot
CP66-MEL p.C822F Haut Heterozygot
CTV-1 P.0? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot
EFO-27 p.Q130fs * 2 Eierstock Heterozygot
EFO-27 p.? Eierstock Heterozygot
HCC2218 p.E467K Brust Heterozygot
J-RT3-T3-5 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot
LNCaP p.? Prostata Homozygot
LoVo p.? Dickdarm Homozygot
MOLT-13 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot
NALM-6 p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot
NCI-H630 p.R680 * Dickdarm Heterozygot
Skut-1 p.L787fs * 11 Endometrium Homozygot
Skut-1B pL787fs * 11 Endometrium Homozygot
SUP-T1 p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot

Tabelle 1 MSH2 -mutated Zelllinien. Zelllinie (Probenname), Aminosäuresubstitution, die Linie der Herkunft und die Zygotie angegeben.

Sample Name Aminosäure Primärgewebe Zygosität
CCRF-CEM p.R100 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue Heterozygot
CCRF-CEM p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Heterozygot
CW-2 p.Y130fs * 6 Dickdarm Homozygot
DU-145 p.? Homozygot
GR-ST p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot
HCT-116- p.S252 * Dickdarm Homozygot
IGROV-1 p.S505fs * 3 Eierstock Homozygot
MN-60 p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot
NCI-SNU-1 p.R226 * Bauch Homozygot
P30-OHK p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot
PR-Mel p.? Haut Homozygot
REH p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue
SK-OV-3 P.0? Eierstock Homozygot
SNU-1544 p.S2L Dickdarm Heterozygot
SNU-1746 p.E523K Dickdarm Homozygot
SNU-324 p.C233R Pankreas Heterozygot
SNU-324 p.V384D Pankreas Heterozygot
SNU-478 p.V384D Pankreas Heterozygot
Prostata Homozygot

Tabelle 2. MLH1 -mutated Zelllinien. Zelllinie (Probenname), Aminosäuresubstitution, die Linie der Herkunft und die Zygotie angegeben.

Diskussion

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Auswahl der Zelllinie (n): Charakterisierung des genetischen Zustand und genomische Instabilität

Zweifellos ist die absolut wichtigste Faktor bei der erfolgreichen Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen der ursprüngliche Zelllinie Auswahl. Zwei Faktoren berücksichtigt werden sollten. Zunächst wollen Zelllinie (n) des gleichen Linie / Subtyp beherbergen die definierenden genetischen Merkmalen der Krankheit zu wählen (z. B. BRAF V600E in Melanom). Abfrage der öffentlich verfügbaren transkriptomischen und Mutationsdaten für beide Zellinien 30-32 und primär / Metastasierung von Tumoren für eine Vielzahl von Indikationen 33,34 wird die Auswahl zu erleichtern. Obwohl Identifizierung von Zelllinien mit klinisch relevanten genetischen Veränderungen eignet, in einigen Fällen kann dies nicht möglich sein, aufgrund des Fehlens von verfügbaren Zellinien oder durchführbar aufgrund von Faktoren, wie die Schwierigkeit und die Länge des Screening-Prozesses.

Im Hinblick auf die zuvor genannten Punkt einen zweiten Faktor, der dann während der Zelllinienauswahl prüfen, ist die Leichtigkeit oder Durchführbarkeit Widerstand Screening mit der gewünschten Linie. So kann beispielsweise Faktoren wie Proliferation und intrinsische Mutationsraten einen enormen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Entdeckung. Zu diesem Zweck können Zelllinien mit einem schnelleren Wachstum Kinetik und mangelhaft in DNA MMR Mechanismen in der Hoffnung verwendet, dass Entstehung spontaner Widerstand beschleunigt 35 werden. Basierend auf der kosmischen Datenbank gibt es mehrere Kandidaten-Zellinien mit einem Mangel in einer der zwei häufigsten mutierte MMR-Gene, MSH2 und MLH1 (Tabellen 2 und 3). Alternativ, wenn Zelllinien von Interesse nicht Lagerdefekte bestehen in MMR, akute Behandlung mit physikalischen oder chemischen Mutagenen DNA reaktive wie Alkylierungsmittel N-Ethyl-N -nitrosourea (ENU) verwendet, um genomische Instabilität verstärken. Obwohl beide Ansätze erheblich sHORTEN die Zeit, um resistente Klone erreichen und Nachbereitung Sequenzierung Stringente funktionellen Tests auf Kandidatengenen als eine größere Anzahl von nicht-funktionellen durchgeführt werden, sind Passagier Mutationen wahrscheinlich austreten. SNVs können Rangordnung, um die Chancen für die Identifizierung funktionell relevante Mutationen zu maximieren. Erstens, die Wahl diese Mutationen, die in unabhängigen Klonen wiederkehrende werden die Wahrscheinlichkeit, diese Mutationen sind Fahrer von Widerstand zu erhöhen. Im Falle wiederholten Mutationen nicht identifiziert werden, die sich auf SNVs dass der Mechanismus der Wirkung des Arzneimittels zu passen (beispielsweise das Target oder eine bekannte nachgeschalteten Effektor des Target) kann sinnvoll sein. Letztlich ist der Goldstandard immer experimentelle Evaluierung der verleih Aktivität der Kandidaten SNVs von Eileiter cDNA-Expression in Drogenempfindlichen Elternzellen.

DNA vs RNA-Sequenzierung

Sobald resistenten Klonen erzeugt wurden, DNA und / oder RNAkönnen je nach Bedarf sequenziert werden. DNA-Sequenzierung, entweder Exoms oder Vollgenomsequenzierung, wird Identifizierung der Keimbahn und somatischen Varianten, wie SNPs, indels ermöglichen und Nummer des Exemplars Varianten. Während die kostenfreundlich Exoms Sequenzierung konzentriert sich auf die Erzeugungs liest aus bekannten kodierenden Regionen, werden Gesamtgenom-Sequenzierung Daten für das gesamte Genom, die die Identifizierung von Mutationen in nicht-codierenden Elemente, wie Enhancer oder miRNAs 36 zu erleichtern, kann zu erzeugen. Da Genexpressionsdaten nicht während der DNA-Sequenzierung gemessen, ist es jedoch schwierig, die Mutation (en) wahrscheinlich eine funktionelle Fahrer vorherzusagen. In dieser Hinsicht ist die Sequenzierung von RNA, obwohl teurer, bietet diesen Vorteil. Die Tatsache, dass eine Mutation aufruf nur auf exprimierten RNA-Spezies durchgeführt erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutation von Interesse kann ein Funktionstreiber. Darüber hinaus ermöglicht eine gezieltere Befragung von Mutationen für Follow-up-Funktionstests, RNA-Sequenzierung auchbietet den zusätzlichen Vorteil, dass die Genexpression Veränderungen, alternative Spleißen und neuen chimären RNA-Spezies, einschließlich von Genfusionen, die auch als potente Fahrer Widerstand dienen kann, zu identifizieren.

Bioinformatik Pipeline

Beispiel Befehle werden zu Illustrationszwecken zur Verfügung gestellt, aber ausführlichere Dokumentation und Tutorials sind vom Broad Institute zur Verfügung 16 und sollte gründlich vor Beginn NGS Analyse gelesen werden. Die folgenden Befehle werden für eine UNIX-Shell-Umgebung auf einem System, auf dem alle Tools und Referenzdaten haben vorinstalliert konzipiert. Diese Befehle auch davon ausgehen, fastq Dateien mit Paired-End-Sequenz liest von zwei Proben mit dem Namen "Eltern" und "resistent", haben Sie vom Anbieter eingegangen ist und sich im Verzeichnis "data" gesetzt. In den meisten Fällen sollten diese Befehle angepasst oder für eine bestimmte Anwendung, wobei Sie zusätzliche Befehlszeilen arg optimiert werdenkumente (zB das Hinzufügen "-t 8" auf den Befehl BWA ermöglicht Multithread-Betrieb über 8 CPU-Kerne). Lesegruppen (die Ausrichtungen, um biologische Proben zuzuordnen), müssen oft mit BAM-Dateien hinzugefügt werden, selbst wenn es nur eine Probe pro bam-Datei, um mit der Dateiformatanforderungen für bestimmte Werkzeuge entsprechen. Lesen Sie Gruppenparameter RGID, RGSM, RGPL, RGPU und RGLB können beliebige Zeichenfolgen den Beispielnamen beschreiben, Sequenzierung Plattform und Bibliothek-Strategie sein.

In-vitro-vs in vivo-Assays

Obwohl mehrere Resistenzmechanismen durch in vitro Selektion identifiziert wurden überprüft, um klinisch relevant, gibt es eine Möglichkeit, dass die Mechanismen können nicht als relevant oder überwiegende Mechanismen der klinischen Beständigkeit dienen. Ein Grund dafür kann eine wesentliche Rolle für die Mikroumgebung in Fahrwiderstand auf die Therapie, eine Komponente, die frei in dem Versuchsprotokoll / setup d umfassenbisher iscussed. Tatsächlich haben verschiedene Studien gezeigt, dass die Antikrebsmittel, die in der Lage sind, Tumorzellen zu töten unwirksam werden, wenn die Tumorzellen in Anwesenheit von Stromazellen impliziert angeborenen Resistenzmechanismen von Stroma 37,38 tragenen kultiviert werden. Um solche Stroma induzierte erworbenen Resistenzmechanismen zu identifizieren, kann man erwägen die Durchführung in vitro Co-Kultur oder in vivo Tumorresistenz Assays. Da erstere Assay ist ziemlich komplex, haben viele der Erzeugung von arzneimittelresistenten Tumor-Xenotransplantaten auf die potentielle Rolle des Stromas in Fahrwiderstand ansprechen gegriffen. Solche Studien beide identisch 5 und einzigartige 39 Resistenzmechanismen relativ zur in vitro-Selektion freigelegt, was bedeutet, dass das Stroma kann tatsächlich eine Rolle bei der letzteren spielen. Allerdings ist ein eingedenk der Länge der Zeit kann es zu ergreifen, um solche resistenten Tumoren zu erzeugen, und der Komplexität des Follow-up der Genomanalyse-complexitie sein müssens durch die intratumorale molekularen und zellulären Heterogenität.

Zielidentifizierung

Neben der Aufdeckung von Drogenresistenzmechanismen, kann dies NGS-basierte Genomprofilansatz auch angewendet werden, um zelluläre Ziele chemischer Sonden zu identifizieren. Historisch gesehen, mehrere unvoreingenommene Verfahren verwendet worden, um die zellulären Wirkmechanismen und Ziele der niedermolekularen Chemie mit biologischen Aktivitäten, einschließlich Affinitätsreinigung in Verbindung mit der quantitativen Proteomik, Hefe genomische Methoden, RNAi-Screening und Rechen Inferenz Ansätze 40 zu identifizieren. Als Erweiterung zum Aufklärung der Medikamentenresistenz-Mechanismen mit NGS-basierte genomische oder transkriptomischen Profilierung phänotypisch resistenten Zellpopulationen, die Identifizierung von einzigartigen wiederkehrenden Einzel-Nukleotid-Variationen (SNVs) oder Expression Veränderungen, die Widerstands aktivieren können Einblicke in die Funktions zellulären Ziele von Verbindungen bieten. Tsein basiert auf der Idee, dass ein Teil der beobachteten Widerstandsmechanismen rezidivierenden Mutationen in Genen, die die direkte Proteinziele des kleinen Moleküls kodieren behaftet sind. Vor kurzem validiert mehrere Berichte die Nützlichkeit des Ansatzes, vor allem durch die Kombination mit anderen Ansätzen, einschließlich Großkrebszelllinie Empfindlichkeit Profiling, um enthüllt die zellulären Ziele niedermolekularer Sonden 9,10.

Offenlegungen

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Publikationskosten für diesen Artikel werden von H3 Biomedizin gezahlt.

Danksagungen

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Die Autoren möchten sich bei unseren Kollegen von H3 Biomedicine für ihr Feedback während der Erstellung des Manuskripts bedanken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
48-Well-PlattenFisher Scientific07-200-86 Erweitern von Klonen
96-Well-PlattenFisher Scientific07-200-588Erzeugung von GI50-Kurven
CellTiter-GloPromegaG7572Viabilitätstests
Klonierungsscheiben (3 mm)SigmaZ374431Entnahme von Klonen
Sterile PinzetteUnomedicalDF8088SEntnahme von Klonen
RNeasy Plus RNA-ExtraktionskitQiagen74134Isolierung von RNA
Blut und Gewebe DNeasy ExtraktionskitQiagen69581Isolierung von gDNA
GATKThe Broad InstituteIndel Realigner
MuTectThe Broad InstituteAufrufwerkzeug für gepaarte Varianten
OncotatorDas Broad InstituteAnnotationstool für Varianten
MutationAccessorThe Broad InstitutTool zur Vorhersage funktionaler Auswirkungen

Referenzen

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In vitro SelektionGanzexom SequenzierungEntstehen spontaner MutationenBestimmung der GI50klonale IsolationBehandlung mit zytotoxischen VerbindungenAnalyse struktureller VariantenValidierung durch Sanger SequenzierungBest tigung der ph notypischen Resistenz

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