Direkter Maus Trauma / Brennen Modell heterotoper Ossifikationen

Zusammenfassung

Ein Achilles-Tenotomie- und Verbrennungsverletzungsmodell der heterotopen Ossifikation ermöglicht die zuverlässige Untersuchung der traumainduzierten ektopischen Knochenbildung ohne die Anwendung exogener Faktoren.

Zusammenfassung

Heterotope Ossifikation (HO) ist die Bildung von Knochen außerhalb des Skeletts, die sich nach schweren Traumata, Brandverletzungen und orthopädischen chirurgischen Eingriffen bildet. Die Mehrzahl der Tiermodelle, die zur Untersuchung von HO verwendet werden, beruhen auf der Anwendung exogener Substanzen, wie z. B. knochenmorphogenetisches Protein (BMP), exogene Zellkonstrukte oder genetische Mutationen in der BMP-Signalgebung. Diese Modelle sind zwar nützlich, reproduzieren aber nicht genau die Entzündungszustände, die die Mehrzahl der Fälle von HO verursachen. Hier beschreiben wir ein Burn/Tenotomie-Modell in Mäusen, das zuverlässig fokussierte HO produziert. Dieses Protokoll beinhaltet die Erzeugung einer Kontaktverbrennung von 30 % der gesamten Körperoberfläche mit einer partiellen Dicke auf der Rückenhaut sowie eine Durchtrennung der Achillessehne in ihrem Mittelpunkt. Sich ausschließlich auf traumatische Verletzungen zu verlassen, um HO an einem vorhersagbaren Ort zu induzieren, ermöglicht eine zeitliche Untersuchung der endochondralen heterotopen Knochenbildung nur aus intrinsischen physiologischen Prozessen und der Umgebung. Diese Methode könnte sich als hilfreich für das Verständnis der entzündlichen und osteogenen Signalwege erweisen, die an traumainduzierter HO beteiligt sind. Da sich HO in diesem Modell an einem vorhersehbaren Ort und Zeitverlauf entwickelt, ermöglicht es außerdem die Forschung, frühe Bildgebungsstrategien und Behandlungsmodalitäten zu verbessern, um die Bildung von HO zu verhindern.

Einleitung

Heterotope Ossifikation (HO) ist die Bildung von ektopischem Knochen, bei dem osteopotente Zellen aberranterweise dazu gebracht werden, endochondraler Knochen außerhalb des Skeletts zu bilden. Während die Details des HO-Bildungswegs noch weitgehend unbekannt sind, umfasst ein akzeptiertes Paradigma drei Schlüsselfaktoren: ein entzündungsauslösendes Ereignis, eine permissive Nische und mesenchymale Stammzellen, die in der Lage sind, Knochen zu bilden. ^1-3 HO ist eine häufige Komorbidität, die über 60 % der schweren Brandverletzungen, 65 % der kampfbedingten Verletzungen und 10 % der invasiven orthopädischen Eingriffe erschwert. ^4,5 Es ist jedoch oft schwierig vorherzusagen, wo sich HO bilden wird, da es an lokalen Verletzungsstellen oder an entfernten Orten auftreten kann, die ansonsten unverletzt bleiben könnten. Diese Variabilität in der Lokalisation erschwert es, prophylaktisch einzugreifen, um eine reaktive Knochenbildung gezielt zu verhindern. Es gibt auch angeborene Formen der HO wie Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP), bei denen die Patienten anfällig für die Entwicklung einer robusten HO als Reaktion auf ein leichtes Trauma oder einen entzündlichen Insult sind. Leistungsfähige Tiermodelle mit transgenen Mäusen haben diesen Phänotyp reproduziert und Einblicke in die molekularen Signalwege gegeben, die auch bei traumainduziertem HO wichtig sein ^können.6-9 Die translationale Forschung zur Pathogenese von nicht-angeborener HO hat eine Vielzahl von Konstrukten verwendet, die von reinen Verletzungen bis hin zur Implantation von exogenen osteoinduktiven Materialien und/oder Zellen reichen. ^10-13

Uhr

In unserer früheren Arbeit haben wir ein einfaches und zuverlässiges Modell der HO-Bildung in Mäusen validiert, das keine Verabreichung von exogenem Material erfordert. ^14-17 Dieses Modell schuf zwei Schlüsselbedingungen für die Initiierung von HO: lokales Trauma und globale Entzündung. Dies wurde durch den Einsatz einer Achillessehnen-Tenotomie (lokales Trauma) in Kombination mit einer Fernbrandverletzung (globale Entzündung) erreicht. Mäuse erhielten beide Behandlungen gleichzeitig und es wurde festgestellt, dass sie eine robuste Menge an HO entwickelten, die mit histologischen, radiologischen und molekularen Mitteln analysiert werden konnte. Interessanterweise erhöhte die gleichzeitige Brandverletzung die Menge an HO, die sich bildete, signifikant und beschleunigte den Entwicklungsverlauf. ^14-16 HO entwickelte sich an vorhersehbaren Stellen um den Fersenbein, das Sprunggelenk und die Tibia/Fibula der Extremität, die die Tenotomie erhielt. Die Zuverlässigkeit der HO-Entwicklung an einem bekannten Ort ermöglichte eine gezielte Untersuchung molekularer und histologischer Merkmale in den frühen Stadien der ektopischen Ossifikation. ^14,17 Bis heute haben 100% der Mäuse (über 50 Tiere) mit einer Tenotomie und gleichzeitiger Brandverletzung eine HO entwickelt. Zusätzlich wurden longitudinale 2D- und 3D-Bildgebung und spektroskopische Analysen durchgeführt, um das Wachstumsmuster und die biochemische Zusammensetzung von ^HO.15,16 zu untersuchen

Protokoll

Ethics Statement: Eighth Edition aus dem Institut für Labortierforschung (ILAR, 2011) und waren: Alle tierischen Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis in den Leitlinien im Leitfaden für die Benutzung und Pflege von Labortieren vorgesehen definiert durchgeführt von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Michigan (PRO0001553) zugelassen.

1. Maus Chirurgische Verfahren

HINWEIS: Verwenden Sie 8-10 Wochen alte C57BL / 6 Mäusen. Andere Altersgruppen, Hintergründe und Stämme von Mäusen können auch verwendet werden, um verschiedene Bedingungen oder Erbgut zu testen. Für die Tenotomie Teil des Verfahrens zu erhalten sterilen Bedingungen unter Verwendung von Gesichtsmaske, Haarhaube und sterile Kittel, Handschuhe und Instrumente. Operationsstellen sollten steril mit PVP-Jod und sterilen Abdeckung hergestellt werden. Hypothermie zu vermeiden, indem ein veterinär Heizkissen und Aufwärmen Reanimation Lösungen bis 37 ° C vor dem Verwaltungstion.

1. Betäuben die Maus mit 2,5% inhalativen Isofluran. Verwenden Sie einen Nasenkegel, um den Rücken und hinteren Extremitäten leicht zugänglich zu verlassen. Passen Sie die Geschwindigkeit von Isofluran Verwaltung, geeignete Atemfrequenz und Färbung der Schleimhaut zu erhalten und Anästhesie, indem Muskeltonus, toe Prise, und Kornealreflex gewährleisten. Bewerben fad Augensalbe die Augen der Maus die zu trockene Augenverletzung während des Verfahrens zu verhindern. Es ist für ausreichende Körpertemperatur mit Hilfe eines Veterinär Heizkissen oder warmem Wasser Zirkulator unter dem OP-Feld.
2. Verabreichen Buprenorphin, 0,1 mg / kg, subkutan unmittelbar vor der Operation zur Analgesie.
3. Eng rasieren die Operationsstelle auf der linken Hinterpfote mit Schermaschinen von der Ferse bis zum Knie.
4. Eng rasieren den Rücken der Maus, beginnend über die Wirbelsäule und die Verlängerung der rasierten Bereich auf der linken Seite der Rückenmittellinie, Clearing über eine Fläche von mindestens 2 cm x 3 cm, um die Brandverletzung unterzubringen.
5. Bereiten Sie die Operationsstelle, einschließlich der Hinterpfote bis zum Knie mit 3 Wechsel Povidonjod Peelings.
6. Führen einen Längsschnitt entlang der medialen Seite des linken Achillessehne. Verlängern Sie den Schnitt, so dass die Achillessehne leicht sichtbar gemacht werden; ca. 0,5 cm.
7. Führen Sie eine Achilles-Tenotomie mit scharfen Dissektion der Sehne in der Mitte mit scharfen Gewebe Schere. Einfügen einer Klinge der Schere Gewebe in der Gewebeebene unterhalb der Sehne und sezieren entlang der Ebene, bis das Blatt an der Sehnenmittelpunkts. Schließen Sie die Scherenblätter um die Sehne scharf zu trennen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, Einbeziehung aller hinteren Sehnen einschließlich Gastrocnemius, Soleus und Plantaris Sehnen.
8. Blutstillung zu erreichen, indem Druck mit steriler Gaze (es sollte minimal Blutungen) und schließen Sie die Hautschnitt mit einem 5-0 Vicryl Stich.
9. Führen Sie die Rückenteildicke brennen mit einem Aluminiumblock mit einem Gewicht von 35 g mit ungefähren Messung!ts 2 cm x 2 cm x 3 cm bis 60 ° C erhitzt in einem Wasserbad auf den rasierten Rücken der Maus für 17 sec aufgebracht.
   HINWEIS: Erreichen Sie die entsprechende Brenntiefe um den Block ruht auf der Oberseite des narkotisierten Maus, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche des Blocks in Kontakt mit der Maus, aber vermeiden, dass keine zusätzlichen Druck auf den Block, das heißt, die Schwerkraft zu sein die einzige Kraft, die den Block an Ort und Stelle. Eine dünne Kunststoffgriff zu einer Seite des Blocks angebracht ist für Manipulation, Stabilisierung und Wiedergewinnung aus dem heißen Wasserbad. Diese schaffen eine etwa 30% Körperoberfläche zu verbrennen in einer 8-10 Wochen alte C57BL / 6-Maus. Dieser Kontakt burn wurde gegenüber anderen Methoden (Flamme oder verbrühen burn) aufgrund der Gleichmäßigkeit der Verbrennung Tiefe über die Wunde und die Reproduzierbarkeit zwischen Tieren ausgewählt.
10. Trocknen Sie die Verbrennungsstelle mit Gaze und tragen Sie eine Tegaderm Verband.
11. Verwalten erwärmt Reanimation Flüssigkeiten: Ringer-Lactat-Lösung 1 mlintraperitoneale Injektion und 0,5 ml subkutane Injektion. Diese einmalige Verabreichung von Lungen-Wiederbelebung ist ausreichend für die Wiederherstellung von der Brandverletzung und Tenotomie.
    HINWEIS: narkotisierten Mäusen mit anderen Mäusen einzeln in saubere Käfige zurück Sie nicht, Gehäuse Käfigen, Haus unter Kontrolle, bis die Mäuse vollständig erholt. Typische Erholung tritt innerhalb von 1-6 Std. Burn-Sites in der Regel innerhalb von 2-4 Wochen heilen und werden nur selten von Wundinfektion kompliziert, wenn in sauberen Umgebungen Gehäuse gehalten.
12. Verwalten Buprenorphin 0,1 mg / kg subkutan alle 12 Stunden für 3 Tage nach dem Eingriff. Überwachen HO Wachstum mit Serien μCT-Scans in angemessenen Zeitabständen. Ektope Knochenwachstum ist zunächst klar, rund 3 Wochen postoperativ durch μCT.
    HINWEIS: Die Mehrheit der HO Entwicklung komplett von 9 Wochen nach der Operation ist. Wir haben beobachtet, einen Unterschied in der Lautstärke oder HO gelegene wiederholt μCT scannt zweimal wöchentlich für 15 Wochen im Vergleich zu einer einzelnen Endpunkt μCT bei 15 Schwangerschaftswochen.Am Ende der Versuche, einschläfern Alle Mäuse mit CO ₂ Inhalation gemäß gültiger Richtlinien und überprüfen Sie den Tod mit Genickbruch nach 10 min.

2. μCT-Akquisition und Analyse

1. Sichern Sie den narkotisierten Maus auf das Scanner-Bett in der Bauchlage. Kleben Sie die Hinterbeine sicher an dem Bett Atembewegungsartefakte zu vermeiden. Fügen Sie die Luft, das Wasser und Hydroxylapatit enthält Phantom unter der Maus für die Bildkalibrierung.
2. Öffnen Sie die Knochenanalyse-Software und eine Region of Interest (ROI), die beide Hinterbeine aus dem Hüftgelenk proximal zu der Spitze der Hinterpfote distal umfasst definieren. Erhalten Sie Bild mit den folgenden Parametern:. 80 kV, 500 & mgr; A und 1,300 msec Exposition, 48 & mgr; m Voxelgröße ^14,15
3. Kalibrierung des Bildes auf Hounsfield-Einheiten (HU), die durch Ziehen eines ROI in jeder der drei Kammern Phantom und Eingeben der mittleren Dichte in die entsprechenden Felder indie Software.
4. Mit dem "Grabber" Werkzeug in der Software, neu orientieren das Bild so das Schienbein des linken Hinterbein parallel entlang der Z-Achse, um das klarste Ansicht anatomische für die Abgrenzung der orthotopen kortikalen Knochen Strukturen und HO ermöglichen.
5. Beginnend am Knie, distal blättern Sie durch die Bildschnitte bis HO angetroffen wird. Verwendung des manuellen Spline-Werkzeug, machen Sie eine ROI um die ektopische Knochen auf jedem ^5. Scheibe distal weiter durch die Pfote oder bis HO wurde übertroffen. Verwenden Sie das extrapolieren-Tool zu erweitern und zu nähen die ROIs zusammen in einem ROI, die den ganzen HO enthält.
6. Einen 3D-ROI und wählen Sie das Analyse-Menü. Berechnen Sie die Knochenvolumen, indem Sie die untere und obere Grenzwerte, die das Knochenfenster am besten zeigen. Verwenden Sie die gleichen festen Schwellenwerten für alle Scans.

Ergebnisse

In der vorliegenden Studie wird das Protokoll für die zuvor veröffentlichten Maus-Modell der Trauma beschrieben / brennen induzierte HO. ^14-17 Dieses beinhaltet die Schaffung von gleichzeitigen lokalisierten Muskel-Skelett-Verletzungen mit einer Achilles-Tenotomie und globale entzündliche Beleidigung mit einer Teildicke Verletzungen verbrennen. Dies führt bei der zuverlässigen Bildung reaktiver Knochen an der Stelle, die mit tenotomy seriellen Bildgebung verfolgt werden kann. Bisher wurden alle Mäuse (mehr al...

Diskussion

Die heterotope Ossifikation stellt eine wesentliche funktionelle Beeinträchtigung dar, mit der Patienten konfrontiert sind, die Traumata, Verbrennungen und invasive Eingriffe des Bewegungsapparates erleiden. Die am stärksten gefährdete Bevölkerung sind Soldaten in modernen Konflikten, die durch Mechanismen wie improvisierte Sprengsätze (IED) schwer verletzt werden. ¹⁸ Verbesserte Schutzwesten und nach vorne positionierte medizinische Einheiten ermöglichen ein verbessertes Überleben bei schweren Verletzungen ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57BL/6 Mäuse	Jackson Laboratory	664	8-10 Wochen alt
Isofluran – Fluriso	VET one, Boise, ID	V1 501017
Buprenorphin – Buprenex	Reckitt Benckiser Healthcare	NDC 12496-0757-1	0,3 mg/ml Lösung
Betadine	Owens and Minor, Mechanicsville, VA	2047PVP202
5-0 Vicryl-Nähte	Ethicon, Summerville, NJ	J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	In zwei Hälften schneiden, um die Verbrennungsstelle richtig abzudecken
Mikro; CT - GE eXplore Locus SP	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Kanada
Microview 2.2 Anwendung für die erweiterte Knochenanalyse	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Kanada

&