Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Summary

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Abstract

Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt es, zu analysieren, zu dem Schritt für ein Zielprotein, oder alternativ ein kleines Molekül, interagiert mit den Komponenten eines Signalwegs. Das Verfahren basiert auf der einen Seite, auf der die induzierbare Expression eines spezifischen Proteins mit einem Signalisierungsereignis zu einem definierten und vorgegebenen Schritt in der gewählten Signalkaskade initiieren. Gleichzeitige Überexpression, andererseits aus dem Gen von Interesse ermöglicht dann der Prüfer zu beurteilen, ob die Aktivität des exprimierten Zielprotein stromaufwärts oder stromabwärts von dem eingeleiteten Signalereignisses, abhängig von der Ablesung der Signalweg, der gewonnen wird. Hier wurde die Apoptosekaskade als definierte Signalweg zum Protokollfunktionalität zu demonstrieren ausgewählt. Pathogene Bakterien, wie Coxiella burnetii, translozieren Effektorproteinen, die mit dem Host-Zelltod-Induktion in der Wirtszelle eingreifen, um Überleben der Bakterien in der Zelle zu gewährleisten und zur Förderung ihrerVerbreitung im Organismus. C. burnetii Effektorprotein CAEB wirksam inhibiert Wirtszelle Tod nach Induktion der Apoptose mit UV-Licht oder mit Staurosporin. Zu verengen, bei der Schritt CAEB stört die Ausbreitung des apoptotischen Signals wurden ausgewählte Proteine ​​mit gut charakterisierte pro-apoptotische Aktivität vorübergehend in einer Doxycyclin-induzierbaren Weise exprimiert. Wenn CAEB wirkt stromauf dieser Proteine ​​wird Apoptose ungehindert ablaufen. Wenn CAEB wirkt stromabwärts wird Zelltod gehemmt werden. Die Testproteine ​​wurden ausgewählt Bax, die auf der Ebene der Mitochondrien und Caspase 3, die die Hauptscharf Protease wirkt. CAEB stört Zelltod durch Bax-Expression induziert, aber nicht von Caspase-3-Expression. CAEB somit in Wechselwirkung mit der apoptotischen Kaskade zwischen diesen beiden Proteinen.

Introduction

Die Virulenz von vielen Gram-negative bakterielle Erreger hängt von spezialisierten Sekretionssysteme zu eukaryotischen Wirtszellen zu entführen. Bakterien nutzen diese Sekretionssysteme bakterieller Virulenzproteine ​​(Effektoren) in die Wirtszelle injiziert werden, um eine Vielzahl von zellulären und biochemischen Aktivitäten modulieren. Das Studium der Effektorproteine ​​nicht nur bemerkenswerten Einblick versehen, in grundlegende Aspekte der Wirt / Pathogen-Interaktionen als auch in die grundlegende Biologie von eukaryotischen Zellen ^1. Modulation der Wirtszelle Apoptose wurde gezeigt, dass ein wichtiger Mechanismus für die Virulenz viele intrazellulär....

Protocol

1. Erzeugung von stabilen Zelllinien, die das Protein von Interesse

1. Vorzubereiten Medien durch Zugabe hitzeinaktiviertem FCS und 1% Penicillin / Streptomycin, handelsübliche Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit GlutaMAX-I, Pyruvat und 4,5 g / l D-Glucose.
2. Kulti HEK293 Zellen in Medien bei 37 ° C in 5% CO _2. Sub-Zellen zu kultivieren alle drei Tage. Entfernen Sie die Medien und Resuspendieren der Zellen in 15 ml frisches Medium. Pipette 1 ml in eine neue 75 cm ² Zellkulturflasche und fügen Sie 14 ml Medien.
3. Analysieren Sie die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer.
4. Seed HEK293-Zellen in einer 6-Well-Pla....

Results

Zunächst wurden HEK293-Zelllinien, stabil das Protein von Interesse (CAEB) Exprimieren als GFP-Fusionsprotein hergestellt. Als Kontrolle wurden HEK293-Zelllinien, die stabil GFP generiert. Expression von GFP und GFP-CAEB wurde durch Immunoblot-Analyse verifiziert. Der Vertreter Immunoblot (4A) zeigt stabile und klar nachweisbare Expression von GFP und GFP-CAEB. Jedoch kann dieser Assay nicht bestimmen, ob alle Zellen exprimieren GFP oder GFP-CAEB. Daher wurden die stabil transfizierten HEK293-Zelllinien.......

Discussion

Viele pathogene Bakterien beherbergen Sekretionssysteme zur Sekretion oder translozieren bakteriellen Effektorproteine ​​in die Wirtszelle. Diese Effektor-Proteine ​​haben die Fähigkeit, Prozesse und Pfade in der Wirtszelle zu modulieren, so dass die Bakterien zu überleben und zu replizieren, innerhalb ihrer jeweiligen intrazelluläre Nische. Das Verständnis der biochemischen Aktivitäten und die molekularen Mechanismen der Effektor-Proteine ​​werden zu einem besseren Verständnis der Pathogenität zu helfen und kann dazu b.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	life technologies	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
/Strep	life technologies	15140-122
OptiMEM	life technologies	51985
X-tremeGENE 9		Roche 6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polyethylenimin	Polysciene	23966
Doxycyclin	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter	Thermo Scientific	26616
PVDF-Membran	Millipore	IPVH00010
Anti-GFP	life technologies	A6455
anti-gespaltenes PARP	BD Bioscience	611038
Anti-Aktin	Sigma Aldrich	A2066
Maus IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
Kaninchen IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Western Blotting Substrat	Thermo Scientific	32106
Restore Plus Western Blot Stripping Puffer	Thermo Scientific	46428