Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Interferenz von bakteriellen Virulenzfaktoren mit der intrazellulären Signalübertragung zu untersuchen. Dies wird durch die Etablierung stabiler Zelllinien erreicht, die das Protein von Interesse exprimieren. Um seine Aktivität auf der Ebene der Massenzellen zu untersuchen, wird in einem zweiten Schritt ein induzierbares Expressionsvektorsystem erstellt, das es ermöglicht, eine Signalkaskade der Wirtszelle in einem definierten Schritt zu aktivieren. Als nächstes wird analysiert, ob das Protein von Interesse die Aktivierung der Signalkaskade der Wirtszelle stören kann, um den Aktivitätspunkt des interessierenden Proteins einzugrenzen. Die Ergebnisse zeigen, dass der gemütliche gelbe Burnett-Virulenzfaktor KA B die apoptotische Kaskade stromabwärts des Rückens und stromaufwärts der Kaskaden-3-Aktivierung stört, basierend auf der Western-Blotting-Analyse.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Infektionsbiologie zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung des Schlüsselschritts in einer Signaltransduktionskaskade, an dem ein bestimmtes bakterielles Effektorprotein interferiert. Dies wird uns nicht nur helfen, besser zu verstehen, wie pathogene Mikroorganismen ihre Wirte manipulieren, sondern auch, wie diese grundlegenden zellulären Prozesse funktionieren. Obwohl diese Methode Einblicke in bakterielle Strategien zur Verhinderung des apoptotischen Zelltods geben kann, kann sie auch auf andere Signaltransduktionssysteme im Zelltodfeld angewendet werden, wie z. B. ONS oder Pyro-Ptosis, oder auch auf Signalnetzwerke, die an der Zellproliferation, der Genregulation oder Reaktionen des Immunsystems beteiligt sind.

Dieses Verfahren wird von Stephanie Besler, einer Doktorandin aus dem Labor von Mann, demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Aussaat von HEK 2 93-Zellen, die GFP oder GFP stabil exprimieren, z. B. B in einer 12. Well-Platte mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Well.

Als nächstes werden DNA und Polyethylen-Mitteltransfektionsreagenz getrennt in 75 Mikrolitern opt-Medium hergestellt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um eine komplexe Bildung zu ermöglichen. Inkubieren Sie beide Mischungen zusammen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Danach geben Sie die Polyethylen-DNA-Lösung tropfenweise in die Zellen und inkubieren bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.

Fünf Stunden nach der Transfektion wird die Expression der pro-apoptotischen Proteine induziert, indem dem Kulturmedium ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin zugesetzt wird. Dann inkubieren Sie die Zellen 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid unter dem Lichtmikroskop. Untersuchen Sie die Zellen vor der Ernte auf Induktion des Zelltods.

Untersuchen Sie die induzierten apoptotischen Zellen, die durch das Vorhandensein von apoptotischen Körpern nachweisbar sind. Entfernen Sie anschließend den Überstand und waschen Sie die anhaftenden Zellen. Einmal mit warmem PBS resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern von zwei x lamby Probenpuffer.

Dann fünf Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzen und für den späteren Gebrauch anschließend bei minus 20 Grad Celsius lagern. Laden Sie danach sechs Mikroliter einer handelsüblichen Proteinleiter als Molekulargewichtsmarker. Laden Sie dann ca. 40.000 Zellen pro Probe auf ein 12%iges SDS-Seitengel.

Die Gele werden in einem Gelelektrophoresesystem unter einer konstanten Spannung von 180 Volt für 45 bis 60 Minuten mit einem x laly laufenden Puffer laufen lassen. Anschließend werden die Proteine 60 Minuten lang bei einer konstanten Spannung von 16 Volt auf PVDF-Membranen aufgebracht. Blockieren Sie dann mit einer halbtrockenen Trans-Blot-SD-Transferzelle die Membranen in 10 Millilitern MPT für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Verdünnen Sie sieben Mikroliter antigespaltenen PARP-Antikörper in sieben Millilitern MPT. Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit der Antikörperlösung über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Antikörperlösung und führen Sie drei 10-minütige Waschgänge mit PBS 0,05 % Tween 20 durch, inkubieren Sie die Membranen mit 1,4 Mikrolitern Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern, verdünnt in sieben Millilitern MPT, verdünnt in sieben Millilitern MPT für eine Stunde bei Raumtemperatur nach der Inkubation.

Waschen Sie die Membranen dreimal mit PBS 0,05 % Tween 20, weisen Sie die Meerrettichperoxidase-Aktivität mit einem handelsüblichen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers nach. Und verwenden Sie Standardgeräte für die Filmentwicklung, um die Proteinbanden zu visualisieren. Entfernen Sie dann gebundene Antikörper, indem Sie die Membranen nach drei Wäschen mit PBS 0,05 % Tween 20 Minuten lang 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, und sondieren Sie die Membranen mit vier Mikrolitern Anti-Aktin-Antikörper in vier Millilitern MPT über Nacht bei vier Grad Celsius.

Führen Sie am nächsten Tag drei 10-minütige Waschschritte auf den Membranen mit etwa 10 Millilitern PBS 0,05 % Tween 20 durch und inkubieren Sie dann die Membranen mit 1,4 Mikrolitern Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern, verdünnt in sieben Millilitern MPT Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membranen dreimal mit PBS 0,05 % Tween 20, weisen Sie die Meerrettichperoxidase-Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach und wenden Sie Standardgeräte für die Filmentwicklung an, um Proteinbans zu visualisieren. In diesem Experiment wurden Ganzzelllysate von HEK 2 93 GFP und HEK 2 93 GFP Sabe Zellen für GFP immunblutig gemacht, um eine stabile Expression zu zeigen.

Die repräsentative durchflusszytometrische Analyse von HEK 2 93 GFP und HEK 2 93 GFP Sabe Zellen zeigt die Intensität der GFP-Expression. HEK 2 93 GFP- und HEK 2 93 GFP-Sabezellen wurden sechs Stunden lang mit vier mikromolaren Sporin behandelt, um eine intrinsische Apoptose zu induzieren. Die Apoptose wurde durch gespaltene PARP-Immunoblot-Analyse analysiert, bei der festgestellt wurde, dass die PARP-Spaltung in HK 2 9 3 GFP SA B-Zellen im Vergleich zu HK 2 93 GFP-Zellen abnimmt.

CB schützt vor Bax-induzierter Apoptose, aber nicht vor Caspase-3-induzierter Apoptose. Bei der Implementierung dieses Verfahrens ist es wichtig, so viele Komponenten des Signalwegs wie möglich zu untersuchen, um den Interaktionsschritt zu identifizieren. Es ist auch gut, Proteine zu testen, die sowohl im gemahlenen als auch im aktivierten Zustand aktiviert sind, um festzustellen, ob das ausgewählte Effektorprotein den Signalweg selbst oder eher den Aktivierungsschritt nach diesem Verfahren stört.

Andere Methoden wie Knockdown, Knockout-Hefe-Zwei-Hybrid-Pull-Down-Posttranslationalmodifikation oder proteolytische Stabilitätsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. was sind die genauen molekularen Mechanismen, die diese mikrobiellen Effektoren verwenden, um die normale Physiologie der Wirtszelle zu manipulieren? Und wie wirkt sich dies auf das Überleben und die Verbreitung von Krankheitserregern aus?