Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Interferenz bakterieller Virulenzfaktoren mit der intrazellulären Signalübertragung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem stabile Zelllinien etabliert werden, die das Protein von Interesse exprimieren, um dessen Aktivität auf der Ebene der Gesamtzellpopulation zu untersuchen. Als zweiter Schritt wird ein induzierbares Expressionsvektorsystem erstellt, das es ermöglicht, eine Signaltransduktionskaskade in der Wirtszelle zu einem definierten Zeitpunkt zu aktivieren. Anschließend wird analysiert, ob das Protein von Interesse die Aktivierung der Signaltransduktionskaskade in der Wirtszelle beeinflussen kann, um den Wirkungspunkt des Proteins von Interesse einzugrenzen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Coxiella-burnetii-Virulenzfaktor KAB in die apoptotische Kaskade stromabwärts von Bax und stromaufwärts der Caspase-3-Aktivierung eingreift, basierend auf der Western-Blot-Analyse.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Infektionsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung des entscheidenden Schritts in einer Signaltransduktionskaskade, an dem ein gegebenes bakterielles Effektorprotein eingreift. Dies wird nicht nur zum besseren Verständnis beitragen, wie pathogene Mikroorganismen ihre Wirtszellen manipulieren, sondern auch Aufschluss geben über die Funktionsweise dieser grundlegenden zellulären Prozesse. Obwohl diese Methode Einblicke in bakterielle Strategien zur Verhinderung des apoptotischen Zelltods ermöglicht, kann sie ebenso auf andere Signaltransduktionssysteme im Bereich des Zelltods angewandt werden, wie beispielsweise onkos oder Pyroptose, oder auch auf Signalnetzwerke, die an der Zellproliferation, Genregulation oder Immunreaktionen beteiligt sind.

Demonstriert wird dieses Verfahren von Stephanie Besler, einer Doktorandin aus dem Labor von Mann. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie HEK 293-Zellen, die stabil GFP oder GFP, sagen wir B, exprimieren, in einer 12-Loch-Platte mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Loch ansäen.

Bereiten Sie anschließend DNA und Polyethylen als Transreagenz getrennt in jeweils 75 µL Opti-Medium vor und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur zur Komplexbildung. Inkubieren Sie beide Mischungen gemeinsam 15 Minuten bei Raumtemperatur. Danach geben Sie die Polyethylen-DNA-Lösung tropfenweise zu den Zellen und inkubieren bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid.

Fünf Stunden nach der Transfektion die Expression der pro-apoptotischen Proteine induzieren, indem ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin dem Kulturmedium zugesetzt wird. Anschließend die Zellen 18 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid unter dem Lichtmikroskop inkubieren. Vor der Gewinnung die Zellen auf Induktion des Zelltods untersuchen.

Untersuchen Sie die induzierten apoptotischen Zellen, die anhand von apoptotischen Körpern nachweisbar sind. Entfernen Sie anschließend den Überstand und waschen Sie die anhaftenden Zellen. Suspendieren Sie die Zellen danach einmal mit warmer PBS in 100 Mikrolitern 2x Lamby-Puffer.

Anschließend fünf Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzen und für die spätere Verwendung danach bei minus 20 Grad Celsius lagern. Danach sechs Mikroliter einer kommerziellen Protein-Standardlösung als Marker für die Molekularmasse auftragen. Anschließend etwa 40.000 Zellen pro Probe auf ein 12 % SDS-PAGE-Gel auftragen.

Führen Sie die Gele in einem Gelelektrophorese-System unter konstanter Spannung von 180 Volt für 45 bis 60 Minuten mit einem x Läufpuffer lauf. Danach übertragen Sie die Proteine auf PVDF-Membranen bei konstanter Spannung von 16 Volt für 60 Minuten. Verwenden Sie eine Trans-Blot-SD-Semi-Dry-Transferzelle, anschließend blockieren Sie die Membranen in 10 Milliliter MPT für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Verdünnen Sie sieben Mikroliter Anti-cleaved-PARP-Antikörper in sieben Milliliter MPT. Inkubieren Sie die PVDF-Membran über Nacht bei vier Grad Celsius mit der Antikörperlösung. Entfernen Sie die Antikörperlösung und führen Sie drei 10-minütige Waschschritte mit PBS 0,05 % Tween 20 durch. Danach inkubieren Sie die Membranen eine Stunde bei Raumtemperatur mit 1,4 Mikrolitern mit Horse-Radish-Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern, die in sieben Milliliter MPT verdünnt wurden.

Waschen Sie die Membranen dreimal mit PBS 0,05 % Tween 20 und detektieren Sie die Aktivität der Meerrettichperoxidase mit einem kommerziellen Kit gemäß der Herstelleranleitung. Verwenden Sie anschließend Standardgeräte zur Filmentwicklung, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Entfernen Sie dann gebundene Antikörper, indem Sie die Membranen nach dreimaligem Waschen mit PBS 0,05 % Tween 20 mit sieben Millilitern Western-Blot-Abstreifpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, und inkubieren Sie die Membranen über Nacht bei vier Grad Celsius mit vier Mikrolitern Anti-Aktin-Antikörper in vier Millilitern MPT.

Am nächsten Tag drei Waschschritte à 10 Minuten auf den Membranen mit jeweils etwa 10 Milliliter PBS mit 0,05 % Tween 20 durchführen, anschließend die Membranen mit 1,4 µL sekundären, mit Horse-Radish-Peroxidase konjugierten Antikörpern inkubieren, die in sieben Milliliter MPT verdünnt wurden, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Membranen dreimal mit PBS mit 0,05 % Tween 20 waschen, die Horse-Radish-Peroxidase-Aktivität mit einem kommerziellen Kit nachweisen und Standardgeräte zur Filmentwicklung verwenden, um Proteinbänder sichtbar zu machen. In diesem Experiment wurden Gesamtzelllysate von HEK 293 GFP- und HEK 293 GFP-sabe-Zellen mittels Immunoblotting auf GFP untersucht, um die stabile Expression nachzuweisen.

Die repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse von HEK 293 GFP- und HEK 293 GFP sabe-Zellen zeigt die Intensität der GFP-Expression. HEK 293 GFP- und HEK 293 GFP sabe-Zellen wurden sechs Stunden lang mit vier Mikromolar Sporin behandelt, um die intrinsische Apoptose auszulösen. Die Apoptose wurde mittels Immunoblot-Analyse der gespaltenen PARP-Proteine analysiert, wobei eine verminderte Spaltung von PARP in HK 293 GFP SA B-Zellen im Vergleich zu HK 293 GFP-Zellen festgestellt wurde.

CB schützt vor der durch Bax induzierten Apoptose, nicht jedoch vor der durch Caspase-3 induzierten Apoptose. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, so viele Bestandteile des Signalwegs wie möglich zu untersuchen, um den Interaktionsschritt zu identifizieren. Es ist außerdem sinnvoll, Proteine zu testen, die sowohl in ihrem inaktiven als auch in ihrem aktivierten Zustand vorliegen, um festzustellen, ob das gewählte Effektorprotein den Signalweg selbst beeinträchtigt oder vielmehr den Aktivierungsschritt nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie Knockdown, Knockout, Hefe-Zwei-Hybrid-Pull-down, Untersuchungen der posttranslationalen Modifikation oder der proteolytischen Stabilität können durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise: Welche genauen molekularen Mechanismen setzen diese mikrobiellen Effektoren ein, um die normale Physiologie der Wirtszelle zu manipulieren? Und wie trägt dies zum Überleben und zur Ausbreitung des Pathogens bei?