Name: Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Erfahren Sie, wie induzierbare Expressionssysteme bakterielle Virulenzfaktoren bei der Störung intrazellulärer Signalwege untersuchen. Diese Methode nutzt Western Blot zur Analyse apoptotischer Kaskaden in stabilen Zelllinien.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Sonderforschungsinitiative 796 (SFB796) an A.L. und C.B. sowie durch den ERA-NET PathoGenoMics 3. Aufruf an A.L. unterstützt.

1. Erzeugung von stabilen Zelllinien, die das Protein von Interesse <ol><li> Vorzubereiten Medien durch Zugabe hitzeinaktiviertem FCS und 1% Penicillin / Streptomycin, handelsübliche Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit GlutaMAX-I, Pyruvat und 4,5 g / l D-Glucose. </li><li> Kulti HEK293 Zellen in Medien bei 37 ° C in 5% CO 2. Sub-Zellen zu kultivieren alle drei Tage. Entfernen Sie die Medien und Resuspendieren der Zellen in 15 ml frisches Medium. Pipette 1 ml in eine neue 75 cm 2 Zellkulturflasche und fügen Sie 14 ml Medien. </li><li> Analysieren Sie die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer. </li><li> Seed HEK293-Zellen in einer 6-Well-Platte in einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung und Inkubation für 24 Stunden. </li><li> Für die Transfektion verwendet das Protokoll vom Hersteller des Transfektionsreagenz zur Verfügung gestellt. Transfektion von Zellen mit pEGFP-C2 oder pEGFP-C2-CAEB Verwendung des Transfektionsreagenz. Vor der Verwendung erwärmen die Transfektion REAGent und die auf RT erforderlichen Medien. Verwenden Sie einen 3: 1-Verhältnis von Transfektionsreagenz an DNA. <ol><li> Im einzelnen Pipette 1,5 ul Transfektionsreagenz direkt in 50 ul serumfreiem DMEM Medium. Für die Komplexbildung, Pipette 0,5 ug DNA mit Codierung für GFP oder GFP-CAEB zum Transfektionsreagenz enthaltende Mischung und Inkubation für 15 min bei RT. </li><li> Transfektion von Zellen, die durch Zugabe der Reaktionsmischung in einem tropfenweisen Weise und bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 Std. </li></ol></li><li> 1 mg / ml für die Selektion von GFP-positive Klone bei 37 ° C in 5% CO 2 Geneticin. </li><li> Nach 6 Tagen isolieren Einzelzellen durch Durchflusszytometrie Sortierung in einer 96-Well-Platte beherbergen Mediums und HEK293 Stand in einem 1: 1-Verhältnis. Erzeugen HEK293 Überstand aus konfluenten kultivierten HEK293 Zellen, die für 15 min bei 4.966 x g zentrifugiert. </li><li> Am folgenden Tag, ersetzen Kulturmedium mit Medium, das 1,50; mg / ml Geneticin. Ändern Medien einmal pro Woche. Wenn die Zellen eine konfluente Monoschicht, übertragen Sie sie auf einer 24-Well-Platte. Unterkulti Zellen zweimal die Woche in einem Verhältnis von 1: 5 in Medien, die 1,5 mg / ml Geneticin. Schließlich analysiert man den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen durch Immunoblot-Analyse und Durchflusszytometrie. </li></ol> 2. Analyse der stabilen Zelllinien durch Immunoblot-Analyse <ol><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal geklebt mit warmem PBS. Die Zellen in 100 ul 2x Laemmli-Probenpuffer, Hitze für 5 min bei 95 ° C und bei -20 ° C. </li><li> Laden etwa 4 x 10 4 Zellen pro Probe auf einem 12% SDS-PAGE-Gel. Zusätzlich Last 6 &amp; mgr; l eines handelsüblichen Protein Leiter als Molekulargewichtsmarker. Gele laufen in einem Gel-Elektrophorese-System unter einer konstanten Spannung von 180 V für 45 bis 60 min mit 1x Laemmli-Laufpuffer. </li><li> Auslöschen Proteine ​​auf PVDF-Membranen (Porengröße von 0.45 &amp; mgr; m) bei einer konstanten Spannung von 16 V für 60 min unter Verwendung einer Trans-Blot SD Semi-Dry Übertragungszelle. </li><li> Block Membranen in 10 ml 5% fettfreier Trockenmilch in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) für 1 h bei RT. </li><li> Verdünnter 4 ul anti-GFP-Antikörper in 4 ml MPT und inkubieren Membranen O / N bei 4 ° C. </li><li> Führen drei 10 min Waschschritten mit 10 ml PBS / 0,05% Tween 20. </li><li> Membranen mit 0,8 &amp; mgr; l Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Antikörper inkubieren in 4 ml MPT. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 2.6 beschrieben) und Meerrettich-Peroxidase-Aktivität zu detektieren mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des Herstellers. Bewerben Standardausrüstung für Filmentwicklung bis Proteinbanden sichtbar zu machen. </li></ol> 3. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer. <ol><li> Die Zellen in PBS. Verwenden HEK293-Zellen als Negativkontrolle zu sc vorwärts einstellenAtter (FSC) und Seitenstreuung (SSC), so dass die Zellen auf der Skala. Zeichnen Sie ein Tor an lebenden Zellen durch den Ausschluss von Zell Dubletten, Zuschlagstoffe und Zelltrümmer. </li><li> Stellen Sie den Photomultiplier (PMT) Verstärkung, so dass die ungefärbten Zellen sind auf der anderen des Histogramms für die FL1-Kanal (488 nm Argonlaser) links. </li><li> Um die Fluoreszenzintensität von HEK293-GFP und HEK293-GFP-Zellen zu analysieren CAEB öffnen Sie das Histogramm des FL1-Kanal und zu erwerben 10.000 Events auf der gated Bevölkerung. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit Hilfe von kommerziellen FACS-Analyse-Software. </li></ol> 4. Transfektion der stabilen Zelllinie mit dem induzierbaren Expressionsvektorsystem <ol><li> Samen HEK293-Zellen, die GFP oder GFP-CAEB in einer Platte mit 12 Vertiefungen bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen / Vertiefung. </li><li> 19 Stunden nach der Aussaat, Co-Transfektion der Zellen mit Plasmid-Regler und Antwort Plasmid entweder kodiert Bax oder aktivierte Caspase-3. <ol><li> Co-Transfektion der stabilen HEK293-Zellenmit 100 ng pWHE125-P-Regler Plasmid (Figur 2) und 100 ng der Antwort Plasmide pWHE655-hBax oder pWHE655-revCasp3 (Abbildung 3) und 0,4 &amp; mgr; l Polyethylenimin. </li><li> Bereiten Sie die DNA und Polyethylenimin Transfektionsreagenz jedes in 75 &amp; mgr; l Opti-MEM-Medium und Inkubation für genau 5 min bei RT. Für die Komplexbildung, Inkubation sowohl Mischungen zusammen für 15 min bei RT. </li></ol></li><li> Füge das Polyethylenimin / DNA-Lösung tropfenweise zu den Zellen und inkubiere bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 5. Induktion der Apoptose <ol><li> 5 h nach der Transfektion induziert die Expression der pro-apoptotische Proteine ​​durch Zugabe von 1 &amp; mgr; g / ml Doxycyclin zum Kulturmedium. Inkubieren Zellen 18 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 6. Analyse der Wirtszell-Apoptose, die durch Immunblot-Analyse <ol><li> Untersuchen Zellen vor der hie Ernte unter dem Lichtmikroskop für Zelltodinduktion überprüfen. Apoptotische Zellen nachweisbaren durch die Anwesenheit von apoptotischen Körpern um die sterbende Zelle. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal geklebt mit warmem PBS. Die Zellen in 100 ul 2x Laemmli-Probenpuffer, Hitze für 5 min bei 95 ° C und bei -20 ° C. </li><li> Laden etwa 4 x 10 4 Zellen pro Probe auf einem 12% SDS-PAGE-Gel. Zusätzlich Last 6 &amp; mgr; l eines handelsüblichen Protein Leiter als Molekulargewichtsmarker. Gele laufen in einem Gel-Elektrophorese-System unter einer konstanten Spannung von 180 V für 45 bis 60 min mit 1x Laemmli-Laufpuffer. </li><li> Blot Proteine ​​auf PVDF-Membranen (Porengröße 0,45 um) bei einer konstanten Spannung von 16 V für 60 min unter Verwendung einer Trans-Blot SD Semi-Dry Übertragungszelle. </li><li> Block Membranen in 10 ml 5% fettfreier Trockenmilch in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) für 1 h bei RT. </li><li> Verdünnter 4 μl anti-gespaltenen Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) Antikörper, der in 4 ml MPT und inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Führen drei 10 min Waschschritten mit 10 ml PBS / 0,05% Tween 20. </li><li> Inkubieren Membranen mit 0,8 ul Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper in 4 ml MPT verdünnt. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben), und erfassen Meerrettichperoxidase Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. Bewerben Standardausrüstung für Filmentwicklung bis Proteinbanden sichtbar zu machen. </li><li> Entfernen gebundenen Antikörper durch 30 min Inkubation bei RT mit 7 ml Western Blot Stripping Buffer. </li><li> Nach drei Waschungen mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben), zu sondieren, die Membranen mit 4 &amp; mgr; l anti-Aktin-Antikörper in 4 ml MPT O / N bei 4 ° C. </li><li> Nach drei Waschschritten mit MPT (wie in 6.7 beschrieben), Inkubation der Membranen mit 0,8 ul horseradish Peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper in 4 ml MPT verdünnt. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben, und detektieren Meerrettichperoxidase Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des Herstellers. Wenden Standard-Ausrüstung für die Filmentwicklung, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Anmerkung: Alle Inkubationsschritte wurden auf einem Plattenschüttler für die angegebene Zeit und Temperatur durchgeführt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Viele pathogene Bakterien beherbergen Sekretionssysteme zur Sekretion oder translozieren bakteriellen Effektorproteine ​​in die Wirtszelle. Diese Effektor-Proteine ​​haben die Fähigkeit, Prozesse und Pfade in der Wirtszelle zu modulieren, so dass die Bakterien zu überleben und zu replizieren, innerhalb ihrer jeweiligen intrazelluläre Nische. Das Verständnis der biochemischen Aktivitäten und die molekularen Mechanismen der Effektor-Proteine ​​werden zu einem besseren Verständnis der Pathogenität zu helfen und kann dazu b...

Die Virulenz von vielen Gram-negative bakterielle Erreger hängt von spezialisierten Sekretionssysteme zu eukaryotischen Wirtszellen zu entführen. Bakterien nutzen diese Sekretionssysteme bakterieller Virulenzproteine ​​(Effektoren) in die Wirtszelle injiziert werden, um eine Vielzahl von zellulären und biochemischen Aktivitäten modulieren. Das Studium der Effektorproteine ​​nicht nur bemerkenswerten Einblick versehen, in grundlegende Aspekte der Wirt / Pathogen-Interaktionen als auch in die grundlegende Biologie von eukaryotischen Zellen 1. Modulation der Wirtszelle Apoptose wurde gezeigt, dass ein wichtiger Mechanismus für die Virulenz viele intrazelluläre Pathogene zu sein, und eine Anzahl von Effektor-Proteine ​​modulieren Apoptose identifiziert wurden 2-9. , Ihren genauen molekularen Mechanismen der Tätigkeit bleiben jedoch schwer in vielen Fällen. Apoptose, eine Form des programmierten Zelltods, spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf eine Infektion 10. Zwei Hauptwege, die zu Apoptose habenidentifiziert: zur Förderung der Mitochondrien (intrinsische Apoptose) oder direkte Weiterleitung des Signals über den Zelltod-Rezeptoren an der Plasmamembran (extrinsische Apoptose). Die intrinsische oder Mitochondrien vermittelte Zelltod wird durch intrazelluläre Signale ausgelöst und beinhaltet die Aktivierung von Bax und Bak, zwei proapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Diese Familie wird von pro- und anti-apoptotischen Regulatorproteine, die den Zelltod 11-14 steuern zusammen. Die Aktivierung der Apoptose führt zu Oligomerisierung von Bax und Bak, gefolgt von nachfolgenden Permeabilisierung der mitochondrialen Außenmembran, was zu einer Freisetzung von Cytochrom c in das Zytoplasma. Freisetzung von Cytochrom c initiiert Aktivierung der Effektor-Caspasen 3 und 7 durch die Aktivierung von Caspase-9 in der apoptosome 15. Dies führt zu einer Proteolyse von ausgewählten Substraten, die unter anderem führt die Exposition von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche 16 und befreit einen dedizierten DNase, die CH-Fragmentenromatin 17,18. Um zu bestimmen, wo innerhalb der Apoptosekaskade eine individuelle Effektorprotein stört, wurde ein induzierbares Expressionssystem 19 eingesetzt wird. Regulierungssysteme für die bedingte Expression von Transgenen wurden ein wertvolles Werkzeug in der Funktion eines Proteins innerhalb der Zelle oder ihrer Bedeutung für Gewebe, Organ und Entwicklung des Organismus, als auch während der Initiation, Progression und Wartung der Krankheit 20-23 analysiert. Typischerweise induzierbare Kontrollsysteme, wie das Tet-System 24 hier verwendet wird, bilden einen künstlichen Transkriptionseinheit (siehe Abbildung 1). Eine Komponente ist eine künstlich konstruierte Transkriptionsfaktor genannt tTA (Tetracyclin-abhängige Transkriptionsaktivator), durch Fusion des bakteriellen Transkriptionsrepressor TetR 25 an einen Säugetier-Protein-Domäne, die die transkriptionale Aktivierung vermittelt oder Schalldämpfer 24,26 gebildet. Die zweite Komponente ist ein HybridPromotor bezeichnet TRE (tetracycline-responsive element), bestehend aus einem eukaryontischen minimalen Promotor, mindestens eine TATA-Box und eine Transkriptionsinitiationsstelle enthält, verbunden mit mehrfachen Wiederholungen der passenden DNA-Bindungsstelle für TetR, tetO 24,25. Die dritte Komponente ist der natürliche Ligand von TetR, Tetracyclin oder eines seiner Derivate, wie Anhydrotetracyclin und Doxycyclin 25. Bei Ligandenzugabe zum Kulturmedium verliert TetR seine Affinität für tetO und distanziert von der TRE. Als Ergebnis wird die Transkription des Zielgens aufgelöst. Transgen-Expression kann somit fest in einer zeit- und dosisabhängigen Art und Weise sowohl in der Zellkultur und in Tier 20,23,24 gesteuert werden. Mit tTA tritt Transgen-Expression konstitutiv, außer in Gegenwart von Tetracyclin. Dies kann ein Nachteil in der Studie von cytotoxischen oder onkogene Proteine ​​sein, weil Tetracyclin zunächst vom System entfernt werden, bevor Transgen expression erfolgt und Wirkungen des Zielproteins auf der Zelle überwacht werden. Dies kann zeitaufwendig sein und ist nicht immer vollständig, insbesondere in transgenen Tieren 27. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein TetR-Mutante mit einer umgekehrten Reaktion auf die Anwesenheit von Doxycyclin verwendet, um einen neuen Transkriptionsfaktor zu erzeugen, rtTA (reverse tTA) 28. Es bindet nur an dem TRE und damit einhergehend die Transkription in Gegenwart von Doxycyclin. Restundichtheit des Systems, dh., Transgen-Expression in Abwesenheit von TRE-gebundenen Transkriptionsfaktor Ursprung entweder (i) von Positionseffekten in einer genomischen Integrationsstelle, (ii) von der TRE selbst 29 oder (iii) aus nicht -spezifische Bindung von tTA / rtTA 28 wurde durch Einführung eines zusätzlichen transkriptionalen Schalldämpfer gerichtet, sogenannte TTS (Tetracyclin-abhängige Transkriptions Schalldämpfer) 30 an das System. Es bildet sich ein Zweiregler Netzwerk zusammen mit rtTA (siehe Abbildung 1).In Abwesenheit von Doxycyclin, bindet TTS TRE und schaltet alle verbleibenden Transkription aktiv. In Gegenwart von Doxycyclin, distanziert tTS von TRE und rtTA bindet gleichzeitig Induktion der Expression des Zielgens. Diese zusätzliche Schicht aus Stringenz ist oft notwendig, hochaktive zytotoxische Proteine ​​31-34 exprimieren. Mit diesen streng kontrollierten Doppelregler-System kann die Apoptosekaskade bei einer definierten Schritt kann Analysen, ob die gegebene Effektorprotein mit Apoptose stören initiiert werden. Dieses Verfahren kann nicht nur verwendet werden, um die anti-apoptotische Aktivität von bakteriellen Effektorproteine ​​studieren, sondern auch für die induzierbare Expression von pro-apoptotischen oder toxische Proteine ​​oder zum Präparieren Interferenzen mit anderen Signalwegen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>life technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr>Pen<td>/Strep</td><td>life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>life technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td></td><td>Roche 6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Polysciene</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP&nbsp;</td><td>life technologies</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>anti-gespaltenes PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Aktin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Restore Plus Western Blot Stripping Puffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

anlegen eines induzierbaren expression system zu störungen der bakteriellen virulenzfaktoren mit intrazelluläre signal studieren

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt es, zu analysieren, zu dem Schritt für ein Zielprotein, oder alternativ ein kleines Molekül, interagiert mit den Komponenten eines Signalwegs. Das Verfahren basiert auf der einen Seite, auf der die induzierbare Expression eines spezifischen Proteins mit einem Signalisierungsereignis zu einem definierten und vorgegebenen Schritt in der gewählten Signalkaskade initiieren. Gleichzeitige Überexpression, andererseits aus dem Gen von Interesse ermöglicht dann der Prüfer zu beurteilen, ob die Aktivität des exprimierten Zielprotein stromaufwärts oder stromabwärts von dem eingeleiteten Signalereignisses, abhängig von der Ablesung der Signalweg, der gewonnen wird. Hier wurde die Apoptosekaskade als definierte Signalweg zum Protokollfunktionalität zu demonstrieren ausgewählt. Pathogene Bakterien, wie Coxiella burnetii, translozieren Effektorproteinen, die mit dem Host-Zelltod-Induktion in der Wirtszelle eingreifen, um Überleben der Bakterien in der Zelle zu gewährleisten und zur Förderung ihrerVerbreitung im Organismus. C. burnetii Effektorprotein CAEB wirksam inhibiert Wirtszelle Tod nach Induktion der Apoptose mit UV-Licht oder mit Staurosporin. Zu verengen, bei der Schritt CAEB stört die Ausbreitung des apoptotischen Signals wurden ausgewählte Proteine ​​mit gut charakterisierte pro-apoptotische Aktivität vorübergehend in einer Doxycyclin-induzierbaren Weise exprimiert. Wenn CAEB wirkt stromauf dieser Proteine ​​wird Apoptose ungehindert ablaufen. Wenn CAEB wirkt stromabwärts wird Zelltod gehemmt werden. Die Testproteine ​​wurden ausgewählt Bax, die auf der Ebene der Mitochondrien und Caspase 3, die die Hauptscharf Protease wirkt. CAEB stört Zelltod durch Bax-Expression induziert, aber nicht von Caspase-3-Expression. CAEB somit in Wechselwirkung mit der apoptotischen Kaskade zwischen diesen beiden Proteinen.

Zunächst wurden HEK293-Zelllinien, stabil das Protein von Interesse (CAEB) Exprimieren als GFP-Fusionsprotein hergestellt. Als Kontrolle wurden HEK293-Zelllinien, die stabil GFP generiert. Expression von GFP und GFP-CAEB wurde durch Immunoblot-Analyse verifiziert. Der Vertreter Immunoblot (4A) zeigt stabile und klar nachweisbare Expression von GFP und GFP-CAEB. Jedoch kann dieser Assay nicht bestimmen, ob alle Zellen exprimieren GFP oder GFP-CAEB. Daher wurden die stabil transfizierten HEK293-Zelllinien...

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Interferenz bakterieller Virulenzfaktoren mit der intrazellulären Signalübertragung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem stabile Zelllinien etabliert werden, die das Protein von Interesse exprimieren, um dessen Aktivität auf der Ebene der Gesamtzellpopulation zu untersuchen. Als zweiter Schritt wird ein induzierbares Expressionsvektorsystem erstellt, das es ermöglicht, eine Signaltransduktionskaskade in der Wirtszelle zu einem definierten Zeitpunkt zu aktivieren. Anschließend wird analysiert, ob das Protein von Interesse die Aktivierung der Signaltransduktionskaskade in der Wirtszelle beeinflussen kann, um den Wirkungspunkt des Proteins von Interesse einzugrenzen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Coxiella-burnetii-Virulenzfaktor KAB in die apoptotische Kaskade stromabwärts von Bax und stromaufwärts der Caspase-3-Aktivierung eingreift, basierend auf der Western-Blot-Analyse.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Infektionsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung des entscheidenden Schritts in einer Signaltransduktionskaskade, an dem ein gegebenes bakterielles Effektorprotein eingreift. Dies wird nicht nur zum besseren Verständnis beitragen, wie pathogene Mikroorganismen ihre Wirtszellen manipulieren, sondern auch Aufschluss geben über die Funktionsweise dieser grundlegenden zellulären Prozesse. Obwohl diese Methode Einblicke in bakterielle Strategien zur Verhinderung des apoptotischen Zelltods ermöglicht, kann sie ebenso auf andere Signaltransduktionssysteme im Bereich des Zelltods angewandt werden, wie beispielsweise onkos oder Pyroptose, oder auch auf Signalnetzwerke, die an der Zellproliferation, Genregulation oder Immunreaktionen beteiligt sind.Demonstriert wird dieses Verfahren von Stephanie Besler, einer Doktorandin aus dem Labor von Mann. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie HEK 293-Zellen, die stabil GFP oder GFP, sagen wir B, exprimieren, in einer 12-Loch-Platte mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Loch ansäen.Bereiten Sie anschließend DNA und Polyethylen als Transreagenz getrennt in jeweils 75 µL Opti-Medium vor und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur zur Komplexbildung. Inkubieren Sie beide Mischungen gemeinsam 15 Minuten bei Raumtemperatur. Danach geben Sie die Polyethylen-DNA-Lösung tropfenweise zu den Zellen und inkubieren bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid.Fünf Stunden nach der Transfektion die Expression der pro-apoptotischen Proteine induzieren, indem ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin dem Kulturmedium zugesetzt wird. Anschließend die Zellen 18 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid unter dem Lichtmikroskop inkubieren. Vor der Gewinnung die Zellen auf Induktion des Zelltods untersuchen.Untersuchen Sie die induzierten apoptotischen Zellen, die anhand von apoptotischen Körpern nachweisbar sind. Entfernen Sie anschließend den Überstand und waschen Sie die anhaftenden Zellen. Suspendieren Sie die Zellen danach einmal mit warmer PBS in 100 Mikrolitern 2x Lamby-Puffer.Anschließend fünf Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzen und für die spätere Verwendung danach bei minus 20 Grad Celsius lagern. Danach sechs Mikroliter einer kommerziellen Protein-Standardlösung als Marker für die Molekularmasse auftragen. Anschließend etwa 40.000 Zellen pro Probe auf ein 12 % SDS-PAGE-Gel auftragen.Führen Sie die Gele in einem Gelelektrophorese-System unter konstanter Spannung von 180 Volt für 45 bis 60 Minuten mit einem x Läufpuffer lauf. Danach übertragen Sie die Proteine auf PVDF-Membranen bei konstanter Spannung von 16 Volt für 60 Minuten. Verwenden Sie eine Trans-Blot-SD-Semi-Dry-Transferzelle, anschließend blockieren Sie die Membranen in 10 Milliliter MPT für eine Stunde bei Raumtemperatur.Verdünnen Sie sieben Mikroliter Anti-cleaved-PARP-Antikörper in sieben Milliliter MPT. Inkubieren Sie die PVDF-Membran über Nacht bei vier Grad Celsius mit der Antikörperlösung. Entfernen Sie die Antikörperlösung und führen Sie drei 10-minütige Waschschritte mit PBS 0,05 % Tween 20 durch. Danach inkubieren Sie die Membranen eine Stunde bei Raumtemperatur mit 1,4 Mikrolitern mit Horse-Radish-Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern, die in sieben Milliliter MPT verdünnt wurden.Waschen Sie die Membranen dreimal mit PBS 0,05 % Tween 20 und detektieren Sie die Aktivität der Meerrettichperoxidase mit einem kommerziellen Kit gemäß der Herstelleranleitung. Verwenden Sie anschließend Standardgeräte zur Filmentwicklung, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Entfernen Sie dann gebundene Antikörper, indem Sie die Membranen nach dreimaligem Waschen mit PBS 0,05 % Tween 20 mit sieben Millilitern Western-Blot-Abstreifpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, und inkubieren Sie die Membranen über Nacht bei vier Grad Celsius mit vier Mikrolitern Anti-Aktin-Antikörper in vier Millilitern MPT.Am nächsten Tag drei Waschschritte à 10 Minuten auf den Membranen mit jeweils etwa 10 Milliliter PBS mit 0,05 % Tween 20 durchführen, anschließend die Membranen mit 1,4 µL sekundären, mit Horse-Radish-Peroxidase konjugierten Antikörpern inkubieren, die in sieben Milliliter MPT verdünnt wurden, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Membranen dreimal mit PBS mit 0,05 % Tween 20 waschen, die Horse-Radish-Peroxidase-Aktivität mit einem kommerziellen Kit nachweisen und Standardgeräte zur Filmentwicklung verwenden, um Proteinbänder sichtbar zu machen. In diesem Experiment wurden Gesamtzelllysate von HEK 293 GFP- und HEK 293 GFP-sabe-Zellen mittels Immunoblotting auf GFP untersucht, um die stabile Expression nachzuweisen.Die repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse von HEK 293 GFP- und HEK 293 GFP sabe-Zellen zeigt die Intensität der GFP-Expression. HEK 293 GFP- und HEK 293 GFP sabe-Zellen wurden sechs Stunden lang mit vier Mikromolar Sporin behandelt, um die intrinsische Apoptose auszulösen. Die Apoptose wurde mittels Immunoblot-Analyse der gespaltenen PARP-Proteine analysiert, wobei eine verminderte Spaltung von PARP in HK 293 GFP SA B-Zellen im Vergleich zu HK 293 GFP-Zellen festgestellt wurde.CB schützt vor der durch Bax induzierten Apoptose, nicht jedoch vor der durch Caspase-3 induzierten Apoptose. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, so viele Bestandteile des Signalwegs wie möglich zu untersuchen, um den Interaktionsschritt zu identifizieren. Es ist außerdem sinnvoll, Proteine zu testen, die sowohl in ihrem inaktiven als auch in ihrem aktivierten Zustand vorliegen, um festzustellen, ob das gewählte Effektorprotein den Signalweg selbst beeinträchtigt oder vielmehr den Aktivierungsschritt nach diesem Verfahren.Andere Methoden wie Knockdown, Knockout, Hefe-Zwei-Hybrid-Pull-down, Untersuchungen der posttranslationalen Modifikation oder der proteolytischen Stabilität können durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise: Welche genauen molekularen Mechanismen setzen diese mikrobiellen Effektoren ein, um die normale Physiologie der Wirtszelle zu manipulieren? Und wie trägt dies zum Überleben und zur Ausbreitung des Pathogens bei?

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Berens, C. et al. Anwendung eines induzierbaren Expressionssystems zur Untersuchung der Interferenz bakterieller Virulenzfaktoren mit der intrazellulären Signalübertragung. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert die Verwendung eines induzierbaren Expressionssystems, um zu bestimmen, wo das bakterielle Effektorprotein CaeB die apoptotische Kaskade des Wirts stört. Es beschreibt die Schritte zur Transfektierung von CaeB-exprimierenden Zellen mit einem tetracyclin-responsiven System,...

Transfektion eines induzierbaren Genexpressionssystems in Zellen, die ein bakterielles Effektorprotein exprimieren

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

Dieses Video beschreibt die Methode zur Regulierung der Genexpression in kultivierten Zellen durch Transfektion mit einem Plasmid, das ein Gen von Interesse und ein regulatorisches Plasmid enthält. Die Expression dieses Plasmids kann durch Tetracyclin oder seine synthetischen Analoga gesteuert werden, was dieses System zu einem nützlichen Modell für die Untersuchung der regulierbaren Genexpression macht.

Induzierbares Tet-Off-regulierbares System: Eine In-vitro-Methode zur Modulation der Genexpression in kultivierten Zellen mit dem Tetracyclin-Off-System

Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Dieser Artikel veranschaulicht die Verwendung von Pulse-Chase-Radiomarkierung in Kombination mit ortsspezifischer Photovernetzung, um Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Faktoren in E. coli zu überwachen. Im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Vernetzungsmethoden erzeugt dieser Ansatz hochauflösende "Schnappschüsse" eines geordneten Assemblierungswegs in einer lebenden Zelle.

Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung

Elektroporation wurde verwendet, um gereinigte bakterielle Virulenzeffektorproteine direkt in lebende eukaryotische Zellen einzubringen. Die Proteinlokalisation wurde durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie überwacht. Diese Methode ermöglicht Studien zum Transport, zur Funktion und zu Protein-Protein-Wechselwirkungen mit aktiven exogenen Proteinen, wodurch die Notwendigkeit einer heterologen Expression in eukaryotischen Zellen vermieden wird.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Erregern und ihren Wirten ist ein wichtiger Bereich der biologischen Forschung. Hier beschreiben wir die notwendigen Techniken Effektor - Translokation durch Coxiella burnetii während siRNA Gen - Silencing mit BlaM Substrat zu messen.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Das beschriebene hydroponische Kokultivierungssystem unterstützt intakte Pflanzen mit Metallgittersieb und kokultiviert sie mit Bakterien. Pflanzengewebe, Bakterien und sezernierte Moleküle können dann separat für nachgeschaltete Analysen geerntet werden, wobei gleichzeitig die molekularen Reaktionen sowohl der Pflanzenwirte als auch der interagierenden Mikroben oder Mikrobiome untersucht werden können.

Ein Hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse von Pflanzen- / Mikroben-Molecular-Wechselwirkungen und Signalgebung

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Erfahren Sie, wie induzierbare Expressionssysteme bakterielle Virulenzfaktoren bei der Störung intrazellulärer Signalwege untersuchen. Diese Methode nutzt Western Blot zur Analyse apoptotischer Kaskaden in stabilen Zelllinien.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren (Video) | JoVE Journal

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

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