Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

Summary

Wir beschreiben hier ein kosteneffizientes Granzym-Expressionssystem mit HEK293T Zellen, das hohe Ausbeuten an reiner, vollständig glykosylierter und enzymatisch aktiver Protease produziert.

Abstract

Wenn zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) oder natürliche Killerzellen (NK) Tumorzellen oder Zellen, die mit intrazellulären Krankheitserregern infiziert sind, erkennen, setzen sie ihren zytotoxischen Granulatgehalt frei, um die Zielzellen und den intrazellulären Erreger zu eliminieren. Der Tod der Wirtszellen und intrazellulären Krankheitserreger wird durch die granulären Serinproteasen, Granzyme (Gzms), ausgelöst, die durch das porenbildende Protein Perforin (PFN) in das Zytosol der Wirtszelle und durch das prokaryotische membranstörende Protein Granulysin (GNLY) in bakterielle Krankheitserreger abgegeben werden. Um die molekularen Mechanismen des durch das Gzms vermittelten Zielzelltods in experimentellen in-vitro-Settings zu untersuchen, sind Proteinexpressions- und Reinigungssysteme notwendig, die hohe Mengen an aktiven Enzymen produzieren. Sekretierte Proteinexpressionssysteme von Säugetieren implizieren das Potenzial, korrekt gefaltetes, voll funktionsfähiges Protein zu produzieren, das posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Glykosylierung, aufweist. Daher haben wir eine kosteneffiziente Calciumfällungsmethode zur transienten Transfektion von HEK293T Zellen mit humanen Gzms verwendet, die in das Expressionsplasmid pHLsec kloniert wurden. Die Gzm-Aufreinigung aus dem Kulturüberstand wurde durch immobilisierte Nickelaffinitätschromatographie unter Verwendung des C-terminalen Polyhistidin-Tags erreicht, der vom Vektor bereitgestellt wurde. Die Insertion einer Enterokinase-Stelle am N-Terminus des Proteins ermöglichte die Erzeugung einer aktiven Protease, die schließlich durch Kationenaustauschchromatographie aufgereinigt wurde. Das System wurde getestet, indem es hohe Mengen an zytotoxischen humanen Gzm A, B und M produzierte und sollte in der Lage sein, praktisch jedes Enzym im menschlichen Körper in hohen Ausbeuten zu produzieren.

Introduction

Die Gzms sind eine Familie von hoch homologen Serinproteasen in spezialisierten Lysosomen von CTL und NK-Zellen ¹ lokalisiert. Die zytotoxischen Granula dieser Killerzellen enthalten auch die Membran-störenden Proteinen PFN und GNLY, die gleichzeitig mit den Gzms bei Erkennung einer Zielzelle für die Eliminierung ^2,3 bestimmt werden freigegeben. Es gibt fünf Gzms beim Menschen (GZMA, B, H, K und M) und 10 Gzms in Mäusen (GZMA - G, K, M und N). GZMA und GzmB sind die häufigsten und umfassend in Menschen und Mäusen ¹ untersucht. Allerdings haben neuere Studien begonnen, die Zelltod Wege sowie die zusätzlichen biologischen Wirkungen von den anderen, so genannten Orphan-Gzms in Gesundheit und Krankheit ⁴ vermittelt zu untersuchen.

Das am besten bekannte Funktion der Gzms, insbesondere GZMA und GzmB, ist die Induktion von programmiertem Zelltod in Säugerzellen, wenn sie von PFN ^5,6 in die Zielzellen geliefert. JedochZeigten neuere Studien auch extrazelluläre Effekte der Gzms mit tiefgreifenden Auswirkungen auf die Immunregulation und Entzündungen, unabhängig von zytosolischen Lieferung durch PFN ^7,8. Das Spektrum von Zellen, die effizient nach cytosolischen Eingabe der Gzms getötet wurde vor kurzem auch aus Säugerzellen, Bakterien ^9,10 und sogar bestimmte Parasiten ¹¹ verbreitert. Diese jüngsten Entdeckungen auf ein ganz neues Feld für GZM Forscher eröffnet. Daher wird eine kostengünstige, High-Yield-Säugetier-Expressionssystem deutlich den Weg für die künftige Studien erleichtern.

Nativen menschlichen, Maus und Ratte Gzms wurden erfolgreich aus der Kornfraktion von CTL und NK-Zellen Linien ^12-14 gereinigt. Jedoch in unseren Händen die Ausbeute solcher Reinigungsverfahren ist in dem Bereich von weniger als 0,1 mg / l Zellkultur (unveröffentlichte Beobachtung und ^12). Darüber hinaus die chromatographische Auflösung eines einzelnen GZM ohne Verunreinigung durch other Gzms und / oder Proteine, die ebenfalls vorhanden sind, in den Granulaten ist eine Herausforderung (unveröffentlichte Daten und ^12,14). Rekombinante Gzms wurden Bakterien ^15, Hefe ^16, Insektenzellen ¹⁷ und auch in Säugerzellen, wie HEK 293 ^18,19 hergestellt. Nur die Säugetier-Expressionssysteme tragen das Potenzial, rekombinanten Enzyme mit posttranslationalen Modifikationen identisch mit dem nativen zytotoxischen Protein zu produzieren. Posttranslationale Modifikationen der spezifischen Aufnahme durch Endozytose und die intrazelluläre Lokalisation der Protease in Zielzellen ^20-22 gebracht. Daher kann unter Verwendung pHLsec ²³ (ein freundliches Geschenk von Radu Aricescu und Yvonne Jones, University of Oxford, UK) als Plasmidrückgrat für GZM Ausdruck haben wir ein einfaches, zeit- und kosteneffizientes System für High-Yield-Proteinproduktion in HEK293T-Zellen. pHLsec kombiniert eine CMV-Enhancer mit einem Huhn Β-Actin-Promotor; Zusammen bilden diese Elemente Demonstrationented der stärkste Promotor-Aktivität in verschiedenen Zelllinien ^24. Zusätzlich enthält das Plasmid ein Kaninchen Β-Globin-Intron, optimierte Kozak und Sekretionssignalen, einen Lys-6xHis-Tag und einem Poly-A-Signal. Inserts können bequem zwischen dem Sekretionssignal und dem Lys-6xHis-tag (Abbildung 1) eine optimale Expression und Sekretion Effizienz für Proteine ​​fehlen geeignete N-terminalen Domänen geklont werden. Für die Expression der Gzms, die endogene Sekretionssignal-Sequenz mit dem Sekretionssignal von dem Vektor, gefolgt von einer Enterokinase (EK) Website (DDDDK) versehen ist, so dass wir ersetzt EK Behandlung aktiviert die sezernierten Gzms (aktiv Gzms beginnen mit dem N-terminalen Aminosäuresequenz IIGG ^25). Zusätzlich zugunsten für dieses Verfahren, HEK293T Zellen schnell wachsen in günstiges Medium, wie Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und sind für eine kosteneffiziente Calciumphosphat-Transfektionsverfahren gut geeignet.

Protocol

1. Herstellung des Expressionsplasmids pHLsec-GZM

1. Bereiten Gesamt-RNA aus menschlichen NK-Zellen (Primärzellen, wie in ²⁶ oder der NK-Zelllinie NK-92 exprimieren, alle fünf menschlichen Gzms hergestellt) mit einer geeigneten RNA-Isolierungsverfahren und Umkehr transcribe unter Verwendung eines ersten cDNA synthetisieren Satz, nach dem manufacturer` s Empfehlungen. Verstärken GZM cDNA mittels PCR und Klon in pHLsec wie in ²³ (Art Geschenk der Radu Aricescu und Yvonne Jones, University of Oxford, UK) beschrieben mit den AgeI und KpnI-Stellen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden in Tabelle 1 angegebenen Primer.
2. Bestätigen richtigen Inserts durch Sequenzierung. Erweitern Sie die Expressionsplasmide in DH5a-Zellen und zu reinigen mit einem Endotoxin-freiem Plasmidisolierung Satz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
3. Resuspendieren der gereinigten Plasmide in Endotoxin-freiem, sterilem Wasser bei einer Konzentration von 2 mg / ml und bei -20 ° C until Einsatz.

2. Expression von Gzms in HEK293T-Zellen

1. Zubereitung von Reagenzien
   1. Bereiten Standardkulturmedium. In Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt (25 mM), Glutamax (4 mM), Natriumpyruvat (1 mM) in 10% der Standard fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin ( 100 ug / ml).
   2. Bereiten Transfektionsmedium. Um Kulturmedium ohne Penicillin-Streptomycin hinzufügen 25 ug / ml Chloroquin (Add frisch am Tag der Transfektion von 1,000x Aktien in PBS, bei -20 ° C gelagert).
   3. Vorbereitung serumfreien Kulturmedium: Zu einem serumfreien Medium für HEK293 Zellen hinzuzufügen Glutamin (4 mM), Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 ug / ml) und 2,5 mg / l Amphotericin B.
   4. Herzustellen, die in Tabelle 2 und der Filter mit einem 0,45 um Filter vor der Verwendung beschriebenen Lösungen:
2. Ausbau HEK293T-Zellen
   1. Wachsen HEK293T-Zellen in 20 ml Kulture Medium unter Verwendung von 150 x 25 mm-Gewebekulturschalen.
   2. Split-Zellen bei 80% Konfluenz (Split-Verhältnis von 1: 4, in der Regel jeden ^3. Tag). Zellen lose befestigen, sie mechanisch ohne Trypsinierung abgelöst werden kann durch eine konsequente Auf- und Abpipettieren.
   3. Plattenzellen in der Nacht vor der Transfektion auf 60-70% Konfluenz am Tag der Transfektion (Aussaatdichte ~ 2 x 10 ⁵ Zellen / ml) zu ergeben. Eine übliche Vorbereitung Größe besteht aus 20 bis 25 Kulturschalen.
3. Calciumphosphat-Transfektion
   1. 1 Stunde vor der Transfektion, ändern Sie die Standard-Kulturmedium auf 20 ml Transfektionsmedium. Kurz vor dem Ende dieser 1 h Inkubationsschritt mischen 400 ug Plasmid-DNA mit 10,95 ml ddH ₂ 0 und 1,55 ml 2 M CaCl ₂ in 50-ml-Röhrchen (1 Röhrchen / 5 Gerichte).
   2. 1 bis 2 min vor der Transfektion wurden anschließend 12,5 ml 2x HBS bis 12,5 ml der DNA-Calcium-Lösung, Mischung durch Umdrehen der Röhrchen und Inkubation für 30 s bei RT.
   3. In the-Gemisch in 2.3.2 direkt auf die Zellen (5 ml pro Schale), tropfenweise in das Medium. Streuen gleichmäßig über die gesamte Fläche, Drehen des Mediums auf eine leicht orange Farbe.
   4. Die Kulturschalen inkubieren 7-11 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO ₂ in angefeuchteter Luft). Nach der Inkubation ist ein feiner Niederschlag sichtbar. Entfernen Sie das Transfektionsmedium gründlich vorsichtig mit vorgewärmten PBS und 20 ml Serum-freiem Kulturmedium in 2.1.3 vorbereitet. Inkubiere für 72 h in einem Brutschrank.
   5. Analyse der Transfektion und Expressionseffizienz, indem eine Probe (~ 20 & mgr; l) der Zellüberstand auf SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie Brilliant Blue, ein Granzym Band visualisieren.
4. Reinigung von Gzms aus Kulturüberstand von Nickel-IMAC
   1. Nach der Inkubation dekantieren die Zellkulturüberstände in 250-ml-Röhrchen und klar durch Zentrifugation. Führen Sie eine erste Spin (400 g, 10 min, 4 °C), die das Medium von abgelösten Zellen löschen wird. Den Überstand in frische 250 ml-Röhrchen und Schleudern bei 4000 xg, 30 min bei 4 ° C, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen.
   2. 5 ml 5 M NaCl, 6,25 ml 2 M Tris-Base (pH 8) und 1 ml von 0,25 M NiSO ₄ pro 250 ml der geklärten Überstand. Den Überstand unter Verwendung eines 500 ml Vakuum-Filtereinheit (0,45 mm).
   3. Äquilibrieren eine Nickel-IMAC-Säule mit His-Bindungspuffer A (10 Säulenvolumen, CV) mit einem geeigneten FPLC-System.
   4. Gelten die geklärte Überstand auf die äquilibrierte Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min bei 4 ° C.
   5. Nachdem der Überstand aufgebracht wurde, Waschsäule mit His-Bindungspuffer, bis die UV-Absorption Basislinie erreicht ist (normalerweise 10 CV).
   6. Eluieren Gzms mit einem linearen 20 ml-Gradienten (0 bis 250 mM Imidazol) bei einer Flussrate von 0,5 ml / min, während das Sammeln 2 ml-Fraktionen. Analyse der Elutionsfraktionen durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung.
5. Enterokinase (EK)Behandlung und Endreinigung durch Kationenaustauschchromatographie
   1. Pool GZM haltigen Fraktionen in einem Dialyseschlauch mit ≤10 MWCO. Bewahren Sie eine kleine Probe bei -20 ° C als Pre-EK Kontrolle.
   2. In EK bei 0,02 Einheiten / 50 ml anfänglichen Überstand direkt auf die vereinigte Fraktion im Dialyseschlauch dialysiert und O / N (mindestens 16 h) bei RT in EK-Puffer (4 L, ändern Puffer einmal).
   3. Am nächsten Tag analysiert EK behandelt Gzms im Vergleich zur vorge EK Kontrolle durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung.
   4. Wenn N-terminale Verarbeitung abgeschlossen ist, ändern Dialysepuffer auf S Puffer A (4 l) dialysiert und für weitere 4 h bei RT. Filter Dialysat (0,45 um).
   5. Äquilibrieren eine S-S-Säule mit Puffer A. Laden der Probe auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min bei 4 ° C.
   6. Nach der Probenbeladung, waschen Sie die Säule mit S-Puffer A, bis die UV-Absorption Basislinie erreicht ist (ca. 10 CV). Eluieren die Gzms mit einer 30 ml linearen Gradienten (150 bis 1000 mM NaCl). GZMA eLauten bei ~ 650 mM NaCl, GzmB bei ~ 700 mM NaCl und GzmM bei ~ 750 mM NaCl.
   7. Analysieren Elutionsfraktionen durch SDS-PAGE und kolorimetrische Assays (siehe unten). Pool enthaltenden Fraktionen Gzms und Konzentrat (etwa 30-fach, auf eine Konzentration von etwa 100 uM) in Spinfilter (15 ml, 10 MWCO). Aliquot der konzentrierten GZM Vorbereitungen und bei -80 ° C.

3. Prüfung GZM Aktivität

1. Zubereitung von Reagenzien
   1. Vorbereitung kolorimetrischen Assay-Puffer: 50 mM Tris-Base, pH 7.
      1. Für die Messung der GZMA fügen Na-CBZ-L-Lysin thiobenzyl ester (S-Bzl) (BLT) mit dem Assay-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,2 mM und 5,5'-Dithio-bis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) in einer Konzentration von 0,22 mM. Für GzmB umfassen 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) und 0,22 mM DTNB. Für GzmM umfassen 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-Nitroanilid (pNA) (AAPL). Synthetische Peptide werden von entsprechenden Stammlösungen in DMSO (, stored bei -20 ° C) zu dem Puffer frisch vor dem Assay.
   2. Vorbereitung Spaltungstestpuffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,5
2. Kolorimetrische Assays
   1. Verteilen Sie kleine GZM Proben (<5 & mgr; l) von Elutionsfraktionen oder konzentrierte Aktien in den 96-Loch-Flachbodenplatten. Fügen Sie eine positive Kontrolle (getestet GZM Zubereitungen oder rohe NK Zell-Lysate) und eine Negativkontrolle (nur Puffer).
   2. Füge 100 & mgr; l Assay-Puffer in jede Vertiefung (unter Verwendung einer Mehrkanalpipette). Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. Messen der OD bei 405 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät.
3. Spaltungsassay
   1. Für Spaltungs-Assays unter Verwendung von gereinigten Substrate, Co-Inkubation ein Protein-Substrat (native oder rekombinante, 100-400 nM; einige Beispiele für effiziente GZM Substrate werden in der Ergebnisbereich und in dem Hinweis am Ende dieses Abschnitts dargestellt) mit seriellen Verdünnungen einer GZM (beginnend bei 400 nM) in Assay-Puffer für verschiedene Zeiten.Analyse durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Coomassie; oder durch Western-Blot unter Verwendung spezifischer Antikörper.
   2. Zur Abspaltung Assays unter Verwendung Zelllysaten auszusetzen 10 ⁶ HeLa-Zellen (oder einen beliebigen verfügbaren Tumorzelllinie) in 1 ml Testpuffer und Lyse durch Einfrieren in einem Ethanol / Trockeneis-Bad und Auftauen bei 37 ° C dreimal. Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugation (15.000 × g für 10 min bei 4 ° C).
   3. Co-Inkubation mit dem geklärten Lysat Gzms in verschiedenen Konzentrationen und Zeiten wie oben. Spaltung wird durch Immunoblotting unter Verwendung von geeigneten Antikörpern nachgewiesen.
      HINWEIS: Einige Beispiele für Bona-fide-Substrate, für die kommerzielle Antikörper verfügbar sind: Bid (BH3-Domäne interagieren Tod Agonist) und Caspase 3 durch GzmB ^27,28 gespalten; mehrere heterogene Kern Ribonukleoproteine ​​(hnRNPA1, A2 und U) durch GZMA ²⁹ gespalten wird; Cytomegalovirus Phosphoprotein 71 durch GzmM ^30.

Results

Im folgenden Abschnitt werden wir eine vollständige Dokumentation eines GZMA Vorbereitung zu präsentieren, um die Methode zu beleuchten. Wir haben auch erfolgreich gereinigt GzmB und GzmM, die ähnliche Ergebnisse in Bezug auf Reinigungsleistung und Aktivität. Doch von diesen später Vorbereitungen werden wir nur zeigen einige ausgewählte Stücke von Daten. Wurden GzmB Präparate aus 293T-Zellen nach dem aktuellen Protokoll in mehreren veröffentlichten Studien verwendet, Hervorhebung ihrer Tätigkeit in verschiedenen biologi...

Discussion

Die klassische und ausgiebig untersucht Rolle GZMA und GzmB ist die Induktion von Apoptose in Säugetierzellen nach ihrer zytosolischen Lieferung durch den porenbildendes Protein PFN ^1. Kürzlich wurde die zytotoxische Spektrum der Gzms signifikant von Säugetierzellen, Bakterien ^9,10 sowie bestimmte Parasiten ¹¹ verbreitert. Darüber hinaus sind die nicht-klassischen, extrazelluläre Funktionen GZMA und GzmB sowie die biologische Bedeutung der verschiedenen Waisen Gzms noch unklar. Daher ist...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol-Reagenz	Invitrogen	15596-026	Gesamt-RNA-Isolationskit
SuperScript II Reverse Transkriptase	Invitrogen	18064-014
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	NEB	M0530L
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
EX-CELL 293 serumfreies Medium für HEK 293 Zellen	Sigma	14571C
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, Pyruvat	Gibco	31966-021
SnakeSkin Dialyseschlauch, 10K MWCO	Thermo Scientific	68100
Enterokinase aus dem Rinderdarm	Sigma	E4906	rekombinant, &ge 20  Einheiten/mg Protein
HisTrap Excel 5 ml Säule	GE Healthcare	17-3712-06	Nickel IMAC
HiTrap SP HP 5 ml Säule	GE Healthcare	17-1152-01	S-Spalte
N-α-Cbz-L-Lysin thiobenzylester (BLT)	Sigma	C3647	GzmA Substrat
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)	MP Biomedicals	2193608 _10mg	GzmB Substrat
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (AAPL)	Bachem		GzmM Substrat
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB)	Sigma	D8130	Ellmans Reagenz