Methodenartikel

Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen

DOI:

10.3791/52919

⸱

12. Mai 2015

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben ein Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Dieses Protokoll kann sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite angewendet werden.

Zusammenfassung

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Die Induktion der extrazellulären phosphoryliert-regulierten Kinase (pERK) ist ein zuverlässiges Auslesen der molekularen Lernabhängige neuronale Aktivierung. Hier beschreiben wir ein Perk Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Genauer gesagt, haben wir pERK Immunfärbung auf neuronale Aktivierung zu studieren folgenden Morris-Wasserlabyrinth (MWM, ein klassisches Hippocampus-abhängige Lernaufgabe) in Engrailed-2-Knockout (En2 - / -) Mäusen, einem Modell des Autismus-Spektrum-Störungen (ASD). Im Vergleich zum Wildtyp (WT) steuert, En2 - / - Mäuse zeigten eine signifikante räumliche Lernen Defizite in der MWM. / - - Nach MWM wurden signifikante Unterschiede in der Anzahl von pERK-positiven Neuronen in spezifischen Unterfelder hippocampalen En2 detektiert Mäusen im Vergleich zu WT-Tieren. So kann unser Protokoll robust Schiede erkennenpERK-positiven Neuronen zu Hippocampus-abhängige Lernwertminderung in einem Mausmodell der ASD verbunden. Allgemeiner kann unser Protokoll angewandt werden, um das Profil des Hippocampus Aktivierung sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite zu untersuchen.

Einleitung

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Neurologische Entwicklungsstörungen umfassen eine große und heterogene Gruppe von Erkrankungen wie das Down-Syndrom, fragile X-Syndrom (FXS), Rett-Syndrom, Neurofibromatose, tuberöser Sklerose und ASD, in dem die Entwicklung und Reifung des zentralen Nervensystems (ZNS) wird früh während gestört der pränatalen Phase 1. Diese Entwicklungsfunktionsstörungen des Gehirns können tiefe, lebenslange Auswirkungen auf die Motorik, Sprache, Lernen und Gedächtnis-Prozess führen. Eine Vielzahl von genetischen und Umweltfaktoren bei der Pathogenese von Störungen der neurologischen Entwicklung während der letzten Jahre 2,3 gebracht. Auch wenn die molekularen Mechanismen, die klinische Phänotyp zugrunde liegenden unbekannt bleiben, haben die oben genannten Erkenntnisse die Entwicklung von mehreren Mausmodellen dieser Erkrankungen erlaubt. Lern- und Gedächtnisdefizite in einer Reihe dieser Mausmodelle wie Tsc1 +/-, Tsc2 +/- identifiziert worden ist,Nf1 +/- und En2 ​​- / - Mäusen 2,4-7. Eine wichtige Herausforderung auf dem Gebiet der Neuroentwicklungsstörungen ist die Identifizierung von zellulären und molekularen Prozesse zugrunde liegenden Speicher und Lernstörungen. Ausgewählte Signalwege während der Lern- oder Speicher aktiviert die Transkription bestimmter Gene zu induzieren und schließlich zur de novo Proteinsynthese führen. Immediate-Early-Gene (IEGs) Aktivierung und Protein-abhängige synaptische Modifikationen schnell in Gehirnneuronen als Reaktion auf neuronale Aktivität und Verhaltenstraining 8,9 induziert.

Defizite in der Signalwege mit neurofibromin haben mit dem Lernen in neurologische Entwicklungsstörungen beeinträchtigt Verbindung gebracht. Neurofibromin ist das Produkt aus dem NF1-Gen, dessen Mutation Neurofibromatose Typ 1, einem komplexen genetischen Syndrom mit Tumoren des Nervensystems, Verhaltens- und Motor verzögert und kognitive disakeiten 10. Mäuse heterozygot für Nf1 Löschung zu hemmenden Nervenzellen beschränkt Defizite in der Frühphase der Langzeit-Potenzierung (LTP) sowie kompromittiert räumlichen Lernen in MWM 5,11,12. Interessanterweise Nf1 Mangel in diesem Mausmodell führt zu einer Überaktivierung des Ras-Signalisierung in hemmenden Inter während des Lernens, was zu erhöhten ERK-Phosphorylierung und schließlich in einer abnormalen Steigerung der GABA-Freisetzung aus diesen Neuronen 5.

Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, die Visualisierung der neuronalen Aktivität nach Verhaltens Aufgaben stellt eine Möglichkeit, bestimmte Schaltungen in der Entwicklung des Nervenerkrankungen beteiligt rekonstruieren. Die hier beschriebene Immunhistochemie Protokoll zielt darauf ab, zu bewerten und zu quantifizieren Hippocampus ERK Phosphorylierung folgenden MWM in einem ASD Mausmodell mit kognitiven Defiziten. MWM wird häufig zur hippocampalen abhängigen räumlichen Lernen und Gedächtnis bei Nagetieren 13,14 untersuchen . Wir entscheiden uns, ERK-Phosphorylierung als Molekular Auslesen aufgabenabhängige hippocampalen Lernen verwenden, da ERK wurde gezeigt, dass eine wesentliche Rolle bei Lern- und Gedächtnisbildung 15 haben. Darüber hinaus ist die ERK Weg für erfahrungsabhängige Plastizität im Entwicklungs Sehrinde 16 notwendig. Schließlich Mäusen fehlt einer der beiden ERK Isoformen (ERK2) im ZNS zeigen deutliche Anomalien in kognitiven, emotionalen und sozialen Verhaltensweisen, 17, die anzeigt, dass ERK-Signal könnte eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Neuroentwicklungsstörungen wie ASD zu spielen.

Wir verwendeten Engrailed 2 knockout (En2 - / -) Mäusen als Modell für neurologische Entwicklungsstörungen. En2 - / - Mäuse zeigen anatomische und Verhaltens "ASD-like" Funktionen, einschließlich Verlust von Vorderhirn Inter 18, verminderte Expression von ASD-verwandte Gene 19, verringert Geselligkeit und Beeinträchtigung der kognitiven Flexibilität 6,7,20. Spatial learning und Gedächtnisstörungen, wie sie in der MWM erkannt, sind in En2 besonders robust - / - Mäusen 6,7 und möglicherweise relevant für die ASD-Patienten in 21 beobachteten kognitiven Beeinträchtigungen werden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass eine beeinträchtigte räumliche Lernen in MWM mit reduzierten neurofibromin Expression und erhöhter pERK Spiegel im Hilus En2 - / - erwachsenen Mäusen 7. Hier präsentieren wir die detaillierte Protokoll für die immunhistochemischen Charakterisierung pERK folgenden MWM in diesem ASD-Mausmodell.

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Protokoll

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Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie 2010/63 / EU durchgeführt und wurden von der italienischen Gesundheitsministerium genehmigt.

1. Tierpflege, Wohnen und Behandlung

  1. Führen Sie alle Versuchsprotokolle unter Verwendung von Mäusen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen institutionellen Tierpflege.
  2. Pflegen Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung.
  3. Haus die Mäuse in Gruppen von 2-4, in Standardgröße Polycarbonat Mauskäfige mit Sägemehl und Einstreu werden wöchentlich gewechselt.
  4. Verwenden Alter und Geschlecht abgestimmte Mäuse, weil die Anfälligkeit für Krankheiten können mit Alter und Geschlecht in verschiedenen Mausmodellen für neurologische Entwicklungsstörungen variieren.
  5. Wählen einer geeigneten Anzahl von Tieren, statistische Signifikanz (ein Minimum von 10 Mäusen pro Genotyp für Verhaltensstudie und 4 Mäuse pro Genotyp für die Immunhistochemie Experiment) zu erreichen.

2. Morris Water Maze (MWM)

  1. Verwenden Sie ein Rundbecken (Durchmesser 100 cm, Höhe 50 cm).
    1. Platzieren Sie einige visuelle Hinweise auf den Raumteiler um den Behälter.
    2. Legen Sie eine 10 cm Plattformdurchmesser in den Behälter an einer festen Stelle in der Mitte von einer der vier gedachte Quadranten. Halten Sie die versteckte Plattform im selben Quadranten für alle Studien in allen Trainingseinheiten.
    3. Füllen Sie den Pool mit Leitungswasser, bis die Plattform 1 cm über der Wasseroberfläche. Äquilibrieren Wassertemperatur sollte möglichst nahe bei 22 ° C sein; Dieser Schritt kann mehrere Stunden dauern. In heißem Wasser, um den Zeitaufwand für die Wassertemperatur ins Gleichgewicht zu verkürzen.
    4. In ca. 1,5-2 l weiß, ungiftige Farbe das Wasser undurchsichtig zu machen.
  2. Spuraufnahmeverfahren
    1. Einrichten MWM-Tracking-System mit Standard-CCD-Kameras und Video-Boards. Wählen Sie ein Video-Tracking-System zur Überwachung und Analyse mehrerer Variablen wie Weglänge, escape Latenz und Zeit in jedem Quadranten verbringen.
    2. Teilen Sie die Arena in vier Quadranten und passen Erkennungseinstellungen, um eine optimale Kontrast zwischen Tieren und Hintergrund für die Live-Tracking zu gewährleisten.
    3. Geben Sie den Plattformbereich.
    4. Stellen Sie die maximale Probezeit als 60 Sek.
  3. MWM Testing
    1. Vor Verhalten Tests erlauben Mäusen eine Anpassungszeit von 20-25 min in einem Gebiet, wo sie nicht sehen können den Pool oder den räumlichen Informationen.
    2. Trainieren Sie jede Maus für 9 Tage (zwei aufeinander folgenden Prüfungen am Tag, mit 20-30 min Abstand zwischen ihnen).
    3. Schalten Sie den Computer und die Kamera ein und starten Sie das Video-Tracking-System-Software.
    4. Nehmen Sie die Maus am Schwanz und legen Sie sie in das Wasser, mit dem Kopf wies auf die Seite des Pools, ausgehend von einer der vier Startpositionen (Nord, Süd, Ost, West). Für jede Maus, sollte die Startposition und in verschiedenen Studien pseudorandomized sein.
    5. Lassen Sie die Maus schwimmen und die Suche nach dem Plattform für maximal 60 sec. Sobald das Tier die Plattform erreicht, lassen Sie es auf der Plattform 20 Sekunden bleiben.
    6. Wenn der Maus konnte die Plattform innerhalb dieser Zeit finden, sanft in die Maus, um die Plattform, wobei sie an den Schwanz und lassen Sie ihn dort für 20 Sekunden zu bleiben. Sobald das Tier alle zwei Studien abgeschlossen, trocknen Sie es mit einem Tuch und legen Sie sie zurück in Käfig.
    7. Jeder Tag der Ausbildungszeit, wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 2.3.4-2.3.6).
    8. Führen Sie den Sondentest am 9. Tag nach der letzten Trainingspfad.
    9. Entfernen Sie die Plattform aus dem Pool.
    10. Lassen Sie die Maus schwimmen und die Suche nach der Plattform für maximal 60 sec.
    11. In regelmäßigen Abständen überprüfen Sie die Wassertemperatur, so dass sollte es die gleiche (22 ° C), und reinigen Sie den Pool.

3. Herstellung von Abschnitten aus perfundierten Tiere

  1. Opfern die Mäuse am Ende der MWM. Vier Mäuse pro Genotyp muss vor betäubt zu werden euthanization nach lokalen und internationalen Richtlinien.
  2. Perfusion des Tieres transkardial (cut das Recht auriclewith scheren Blutung zu ermöglichen und die Einführung einer Flügelkanüle in den linken Ventrikel zu perfundieren) mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 4-5 min, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in PBS für 10-15 22 min.
  3. Sezieren und post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für mindestens 12 Stunden.
  4. Legen Sie die Gehirne in 50 ml Polystyrol konische Röhrchen mit 15 ml 0,02% Natriumazid in 0,1 M PBS und bei 4 ° C bis zum Schneiden erforderlich.
  5. Schneiden Sie und entfernen Sie das Kleinhirn vor Vibratom Schneiden.
  6. Kleben Sie das Gehirn aufrecht mit der Schnittstelle, mit Sekundenkleber, auf die Halteplatte der Vibratom.
  7. Schneiden Sie das Gehirn in 20-40 um dicke Koronalschnitte, in serieller Reihenfolge in den dorsalen Hippocampus, auf entsprechende Vibratom.
  8. Sammeln Vibratom Scheiben mit einem Pinsel und in ein 24 Multi-Well-Platte mit 1 ml 0,1 M PBS für jeden gut.
  9. Shop Sektionen für kurzfristige in PBS oder langfristig in 0,02% Natriumazid in PBS bei 4 ° C (Gewebe könnte für bis zu einem Jahr) eingesetzt werden.

4. Immunhistochemie

  1. Transfer 3-5 dorsalen Hippocampus-Abschnitte für jede Maus in 24-Multiwell-Platte, die 500 ul 0,1 M PBS für jede Vertiefung.
  2. Waschen Sie die in jeder enthaltenen Abschnitte auch mit 500 ul 0,1 M PBS (5 min, 3-mal mit leichtem Schütteln).
  3. Stillen endogenen Peroxidase-Aktivität durch Inkubieren Abschnitte in 1% H 2 O 2 in PBS für 20 min unter leichtem Schütteln.
  4. Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min).
  5. Permeabilisierung Gewebe: inkubieren Abschnitte für 5 min in 0,2% Triton X-100 in PBS.
  6. Während der obigen Schritte (4.4; 4.5), stellen genug Blockierungspuffer (10% Ziegenserum und 0,1% Triton-X100 in PBS) für das gesamte Experiment (number der Abschnitte x 100 ul x 3 Stufen).
  7. Anmerkung: Die Verwendung Serum von derselben Spezies, in denen die sekundären Ab (an Biotin konjugiert) gemacht wurde.
  8. Verhindert die unspezifische Bindung des Antikörpers durch Inkubieren Abschnitte in Blocking-Puffer (100 & mgr; l / Schnitt) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Schütteln.
  9. Inkubieren Abschnitte in primären Ab (pERK) in Blockierungspuffer über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Rühren verdünnt.
  10. Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min).
  11. Inkubieren mit dem sekundären Ab mit Biotin (1: 250) konjugiert in Blockierungspuffer verdünnt, für 1 h bei RT unter leichtem Rühren (das gleiche wie in Schritt 4.6 verwendet wird).
  12. Vorbereitung ABC Reagenz gleichzeitig, weil Avidin und Biotin sind mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur bis komplex.
  13. Bereiten Sie das erforderliche Volumen des ABC-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  14. Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min).
  15. INCUBATe Schnitte für 45 min bei RT mit ABC-Reagenz.
  16. Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min).
  17. Bereiten DAB Arbeitslösung muss jeder Schritt, der DAB im Abzug durchgeführt werden, wie DAB ist karzinogen und teratogen.
  18. Übertragen DAB-Lösung auf eine neue Platte mit Kunststofftransferpipette.
  19. Platz Abschnitte in der Platte, die DAB-Arbeitslösung und langsam Wirbelplatte mit der Hand, um maximale Exposition gegenüber Abschnitten zu ermöglichen.
  20. Überwachen DAB Reaktion auf Mikroskop, bis eine ausreichende Signal entwickelt (2-5 min).
  21. Die Reaktion bei der gewünschten Farbintensität, die durch das Waschen des Gewebes in 0,1 M PBS (3 x 5 min).
  22. Bleichmittel verwenden, um alle verbleibenden DAB Substratlösung im Abzug über Nacht ausschalten und entsorgen Sie es nach den Laborrichtlinien.
  23. Berg Abschnitte auf Gelatine beschichtete Objektträger durch schwimmende in PBS. Dann trocknen Sie sie bei Raumtemperatur mindestens 3-4 Stunden.
  24. Die Abschnitte der Reihe nach zu entwässern in 50%, 70%, 95%und 100% Ethanol für jede 2 min, und klar, in 100% Xylol für 5 min.
  25. Deckglas mit Eindeckmedium und lassen in Abzug über Nacht trocknen.

5. Cell Count

  1. Zählen pERK-positive Zellen sollte drei vor fünf Abschnitte auf dem Niveau des dorsalen Hippocampus pro Tier analysiert werden.
  2. Erwerben Sie mehrere Hellfeld-Bilder von jedem Abschnitt bei 200-facher Vergrößerung unter Verwendung eines geeigneten Mikroskop und dann montieren sie mit einer Bildbearbeitungssoftware.
  3. Führen Zellzahlen auf tiff-umgewandelt Mosaikbilder mit dem ImageJ freie Software.
  4. Zählen pERK-gefärbten Zellen im Hilus und Körnerzellschicht über zwei bis drei Kästen von 100 × 100 & mgr; m jeder Zählung.
  5. Zelldichten, wenn die Anzahl markierter Zellen pro Zählung Fenster (100 x 100 um) ausgedrückt werden.
  6. Statistische Analysen zu signifikanten Unterschied zwischen den Genotypen zu bewerten. Dies kann mit Student-t erreicht werdenTest oder ANOVA, gefolgt von entsprechenden Post-hoc-Test unter Verwendung von kommerziellen Software. Legen statistische Signifikanzniveau bei p <0,05.

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Ergebnisse

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Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um sichtbar zu machen, mittels Immunhistochemie die Expression eines spezifischen Marker der Hippocampus-Neuronen-Aktivität nach MWM in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. Alle hier gezeigten experimentellen Daten wurden von unserer jüngsten Arbeiten 7 übernommen. Männliche und weibliche WT und En2 ​​- / - gleichaltrigen Erwachsenen Wurfgeschwistern (3-5 Monate alt, Gewicht = 25-35 g) aus heterozygoten Verpaarungen erhalten ver...

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Diskussion

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Hier stellen wir ein Protokoll für die Immunhistochemie pERK enthüllt neuronale Aktivierung folgt MWM in En2 - / - Mäuse, ein Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. / - - Erniedrigte pERK wurden in der CA3 Teilgebiet der En2 erkannt Mutanten im Vergleich zu WT. Anders, als in CA3 Unterfeld, eine allgemeine Erhöhung der pERK-positiven Neuronen beobachtet stattdessen sowohl hilus erkannt und GCL von En2 - / - Mäusen im Vergleich zu WT. Eine mögliche Erklärung für diese gegenlä...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Danksagungen

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Wir möchten für die Unterstützung danken, die Verwaltungspersonal CIBIO (Universität Trient) und CNR Neuroscience Institute. Giovanni Provenzano wird von einem Post-Doc-Stipendium Fondazione Veronesi (Mailand, Italien) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das italienische Ministerium für Universität und Forschung (PRIN 2008 Grant # 200894SYW2_002 und PRIN 2010-2011 Stipendium # 2010N8PBAA_002 zu YB), Universität Trento (CIBIO Gründungszuschuss zu YB) und Telethon Foundation (Grant # GGP13034 finanziert YB).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EthoVision XT 8Noldus InformationstechnologieDiese Softwareplattform ist keine Voraussetzung – es gibt viele andere Verhaltenssoftware auf dem Markt.
TemperafarbeGiotto - Fila Group Unternehmen Weißund flüssig, ungiftig. Wird verwendet, um undurchsichtiges Wasser im Wasserlabyrinth von Morris zuzubereiten.
VibratomeLeicaVT1200Es können gleichwertige Modelle anderer Hersteller verwendet werden.
24-Well-PlatteSigmaCLS3524
100% EthanolFisher ScientificA406-20Wird verwendet, um einen Ethanolgradienten für die Dehydrierung vor der Montage des Objektträgers herzustellen.
XylolVWR66004-950Giftig - zur Verwendung unter der Motorhaube. Wechseln Sie das Xylol jeden Monat je nach Verbrauch.
NatriumazidSigma  S2002
PBSSigmaP3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100Sigma T-8787
WasserstoffperoxidSigmaH1009-100ML
Normales ZiegenserumAbcamG9023-10ML
ABC Kit Vectastain Vector LaboratoriesPK-6100Geben Sie in einem Volumen von 5 ml PBS 2 Tropfen Reagenz A hinzu, mischen Sie und fügen Sie dann 2 Tropfen Reagenz B hinzu und mischen Sie.
DAB-Peroxidase-SubstratVector LaboratoriesSK-4100Geben Sie ein Volumen von 5 ml ddH2O hinzu: 2 Tropfen Pufferlösung und mischen; 4 Tropfen DAB und mischen; 2 Tropfen H2O2 und mischen.
[header]
pERK AntikörperZellsignaltechnologien 4370Verdünnung 1:500
Biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen IgG AntikörperVektor LaboratorienBA-1000 Verdünnung 1:250
SuperFrost Folien Carl Roth1879
DeckgläserFisher12-548-B
DPXSigma317616Eindeckmedium für Dias. Es kann ein gleichwertiges Eindeckmedium verwendet werden.
Mikroskop  Zeiss kann ein gleichwertiges Mikroskop mit AxioImager.M2
Adobe PhotoshopAdobe Systems, San Jose, CAZum Zusammenfügen von Bildern.
ImageJ SoftwareNational Institute of HealthKostenlose Software kann heruntergeladen werden unter http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0Systat Software Inc. (USA)Gleichwertige Software für statistische Analysen kann verwendet werden.
Prism 6GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)Gleichwertige Software für statistische Analysen kann verwendet werden.
Es verwendet werden.

Referenzen

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