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Methodenartikel

Asymmetrische Walkway: Roman Behavioral Assay zur Untersuchung Asymmetrische Locomotion

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DOI:

10.3791/52921

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15. Januar 2016

 ,  , 
1Neural Engineering Laboratory, Biomedical Research Center, West Virginia University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung des präzisen Tretens bei Nagetieren. Kortikale und spinale zentrale Mustergeneratorsignale sind für eine präzise Fußpositionierung bei behinderter Fortbewegung erforderlich. Wir berichten hier über die neuartige eingeschränkte Gehaufgabe, die das präzise Schrittverhalten direkt untersucht.

Zusammenfassung

Verhaltenstests werden gewöhnlich für die Beurteilung der sensomotorischen Beeinträchtigung des zentralen Nervensystems (ZNS) verwendet. Die raffiniertesten Methoden zur Quantifizierung Bewegungsdefizite bei Nagetieren soll Minute Störungen unbeschränkte Gangoberirdisch zu messen (z. B. Hand BBB-Score oder automatisierte CatWalk). Jedoch kortikalen Eingänge für die Erzeugung von Grund Beförderung auf dem Rücken zentralen Mustergenerator (CPG) hergestellt erforderlich. So ungezwungen Walking Aufgaben testen Bewegungsdefizite aufgrund von Motor kortikalen Wertminderung nur indirekt. In dieser Studie, schlagen wir eine neue, präzise Fuß-Platzierung Bewegungs Aufgabe, die kortikale Eingänge zum Rücken CPG wertet. Eine instrumentierte peg-Weg wurde verwendet, um symmetrische und asymmetrische Bewegungsaufgaben imitiert lateralisiert Bewegungsdefizite zu verhängen. Wir zeigen, dass Verschiebungen von äquidistanten interSchrittLängen von 20% produzieren Veränderungen in den Vorderbein Standphase Eigenschaften während der Fortbewegung mit prefirrte Schrittlänge. Außerdem schlagen wir vor, dass die asymmetrische Gehweg erlaubt Messungen der Verhaltensergebnisse durch kortikale Steuersignale erzeugt. Diese Maßnahmen sind für die Beurteilung der Wertminderung nach dem kortikalen Schäden relevant.

Einleitung

Nach Schlaganfall Morbidität in der überlebenden Bevölkerung enthält grobmotorischen Beeinträchtigungen, die eine Herausforderung für die quantitative Auswertung in beiden Menschen darstellen Post Schlaganfall und Tiermodellen von neurologischen Beeinträchtigungen 1. In der klinischen Einstellung werden diese motorischen Beeinträchtigungen mit subjektiven Kriterien, die mehr empfindlich gegen starke anstatt moderate Wertminderung von der Mehrheit der Patienten zeigten gemessen. In ähnlicher Weise sind solche subjektiven Einschätzungen der posttrauma motorisches Verhalten bei Tieren gemeinsam, z. B. das Basso, Beattie, und Bresnahan (BBB) ​​Bewegungsskala Methode 2,3. Während diese subjektiven Bewertungsmethoden Übersetzung zwischen Gangrehabilitation Studien in Vierbeiner Tiermodellen und Menschen zu helfen, werden die Details der motorische Defizite mit Aktivität aus getrennten Muskelgruppen verbunden sind, nicht beurteilt. Darüber hinaus ist die Bewertung der Kraft kortikalen Beitrag zur Fortbewegung, wie die mutmaßlichen Täter von Kraftdefizit Apoplexie,kann nur erhalten indirekt auch mit den meisten neuen automatisierten quantitativen Methoden 4,5 werden, da sie auf offenem Feld oder lineare Fuß Aufgaben verlassen. Diese Aufgaben erfordern nicht kortikalen Beitrag und kann von den neuronalen Mechanismen des Rückenmarks, das heißt der zentralen Mustergenerator (CPG) Netzwerk, das in den meisten Tiermodellen von Nervenschäden verschont wird, beispielsweise spinalisierten Tiere 6 durchgeführt werden. -. 8 . Wesentliche kortikalen Beitrag zu diesen Rückenmechanismen wurde experimentell in Aufgaben, die erwarteten Haltungsanpassungen 9 und 10 erreichen, sowie präzise Schritt 10 erfordern in Verbindung gebracht.

Darüber hinaus ist den meisten neurologischen Schäden asymmetrische; bewirkt zum Beispiel Schlaganfall hemiparesis dh Schwäche auf einer Seite des Körpers, die in asymmetrischer Gang 11 ergibt. - 14. Die Asymmetrie der hemiplegischen Gangart wird durch asymmetrische spatiotempor hergestelltal Muskelaktivierung am deutlichsten in der Verkürzung des Extensor-assoziierten Standphase und der Verlängerung des Flexor-assoziierten Schwungphase des Schrittzyklus auf der paralytischen Seiten 15,16 manifestiert. Dieser Trend hat sich noch nicht in einer Reihe von Bewegungsgeschwindigkeiten bei gesunden oder paretischen Tieren erforscht. In der aktuellen Studie, verwendeten wir die Analyse von Phasendauer Merkmale 17, die die Beziehung zwischen der Dauer der Schaukel oder Standphase als Funktion der Zyklusdauer in jedem Schritt beschreibt. Das erhaltene lineare Regressionsmodell wurde dann weiter mit einer Analyse der Asymmetrie in allen Gliedern beschrieben.

Berichten wir eine neuartige kostengünstige Methode zur Bestimmung der Aktivität von absteigend kortikalen Eingänge im Motorsystem Vierfüßlers Tiere auf der Grundlage eines präzisen Bewegungsschritt Aufgabe. Diese Aufgabe wird entworfen, um die Motorkortex durch die Einführung Anforderungen an Fußplazierung über einen natürlichen Bereich von Gehgeschwindigkeiten herauszufordern. Außerdem, Fuß-Platzierung Anforderungen werden manipuliert, um den linken oder rechten Seite des Motorsystems bevorzugt herauszufordern. In einer ähnlichen Bewegungsaufgabe, Metz & Whishaw (2009) untersuchte die Ausfallraten, die Anzahl der verpassten Schritte auf unregelmäßige Sprosse Gehweg, bei Ratten. Unsere Methode ist komplementär zu dieser früheren Studie, und es beschreibt die Qualität der Phasensteuerung in "erfolgreichen" Schritte 18.

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Protokoll

Die folgende Trainingsparadigma verwendet die Analyse von Phaseneinstellungen des durchschnittlichen erwachsenen Sprague-Dawley-Ratte. Bitte stellen Sie sicher, dass die hier beschriebene Protokoll ist in Übereinstimmung mit Ihren Institutional Animal Care-Richtlinien. Alle Verfahren in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) und Büro für Laboratory Animal Welfare (OLAW) an der West Virginia University School of Medicine durchgeführt und hält sich an die National Institutes of Health Richtlinien für den Einsatz von Versuchs Tiere.

1. Geräte-Setup

  1. Konstruieren Sie die asymmetrische Gehweg als Open-Top-Kunststoff-Box mit Alu-verspannt unterstützt an jeder Ecke messen 155 cm x 104 cm (Abbildung 1). Brace die oberen Kanten der Box mit Aluminiumstangen auf beiden Seiten gerillt, um für alternative PEG-Anlage zu ermöglichen, entlang des Umfangs der Box, so dass jeder aufeinanderfolgenden Zapfen auf der gleichen Seite definiert die Schrittlänge.
  2. Legen Sie eine 20 cm x 20 cm-Plattform an jeder Ecke (vier insgesamt) Trennen der auf jeder Seite dargestellt Bedingungen. Dieser Abstand sollte ausreichend sein für die Aufnahme von dem Abstand von einer einzigen Ratte Schritt überfahren werden kann.
    1. Verwenden Zapfen aus Aluminium mit den Abmessungen 20 cm x 1 cm x 0,5 cm. Biegen Sie den oberen Rand jeder Zapfen 2,5 cm von der Spitze, um einen Fuß Vermittlungsplattform zu erzeugen.
    2. Sichern Sie sich die Zapfen auf die Rillenschienen mit Schiebetüren in Klammern durch bearbeitete Löcher im gleichen Abstand, um sicherzustellen, Ebene horizontale Aufstellung. Stellen Sie Positionen mit einem Schraubendreher und ein Lineal. Verwenden Sie eine 1 cm Zapfenbreite, die in etwa dem durchschnittlichen Rattenpfote Größe entspricht; Verdünner oder breitere Heringe sind entweder unbequem oder erhöhen die Fußplazierung Variabilität.
  3. Bearbeiten Sie die PEG-Anlage auf jeder Seite auf eine der drei präzise Schritt Herausforderung Bedingungen zu produzieren.
    1. Erzeugen eine symmetrische Bewegungsaufgabe mit einem 15 cm Schrittlänge (SL15), indem Sie den linken inter-Schrittlänge (l ISL) und rechts interSchrittLänge (r ISL) auf die Hälfte der Schrittlänge (7,5 cm).
    2. Impose einen zusätzlichen symmetrischen Bedingung (SL12), indem Sie l und r ISL ISL Längen bis 6,0 cm.
    3. Produzieren die asymmetrische Aufgaben, indem der Abstand zwischen Zapfen an der linken und der rechten Seite, der sogenannten Inter-Schrittlänge. Um das Motorsystem asymmetrisch herauszufordern, ändern Sie die ISL l und r ISL um 20% auf kurzen inter-Schrittlängen entweder auf der linken Seite (L6R9 Zustand) oder rechts (L9R6) Seiten verhängen. 1,5 cm Störungen auferlegen l ISL von 6 cm und r ISL von 9 cm für den L6R9 Bedingung oder ein L ISL von 9 cm und einer r ISL von 6 cm für den Zustand L9R6
  4. Für Ratten, halten Sie die Schrittlänge für alle Bedingungen mit Ausnahme SL12 bei einer bevorzugten 15 cm.
  5. Der Einfachheit halber wird ein asymmetrisches Zustand begünstigen die linke oder die r weisen Sie jeder langen Seite der Gehwegight Seite des Themas, während die Reservierung der beiden kurzen Seiten des symmetrischen Steuer Zustand.
  6. Einrichten einer Hochauflösungskamera mit einer Abtastrate von mindestens 60 Hz, so dass die Platzierung der Schenkel an Haken frei ist, mit der Kamera senkrecht zum Steg mit dem Blickfeld, die etwa 7 Stufen zeigt. Der erste und der letzte Schritt in der Nähe Plattformen werden ignoriert.

2. Training am Gerät

  1. Bitte verwenden Sie Standard-Schulungsressourcen, z. B. NIH Ausbildung in grundlegenden Biomethodology für Laborratten, um mit allgemeinen Verhaltenstraining von Nagetieren vertraut zu machen.
  2. Am Anfang der Ausbildung, zu akklimatisieren Themen, indem und belohnte sie auf dem 20 x 20 cm Plattform für mindestens 5 min. Dann führen die Tiere über eine PEG-Anordnung mit einem 1 cm inter-Schrittlänge auf die nächste Plattform durch die Präsentation einer Futterbelohnung. Belohnen Tieren verbal und mit Streichelzoo für das Erreichen der Plattform.
  3. After 5 Trainingsläufe, Raum die Zapfen eine zusätzliche 1-2 cm auseinander und führen Sie die nächsten 5 Trainingsläufe. Die Anzahl der Wiederholungen hier aufgeführt ist ausreichend, um statistisch geeignete Probengröße zu produzieren (20 - 35 Stufen).
    1. Wenn das Tier übernimmt die Aufgabe, langsamer durch Konsistenz der Schritt (kein Halten) und Körperhaltung (zurück gewölbt) beurteilt, dann konzentrieren Ausbildung über den Ausbau dieser Fähigkeiten an den kurzen Schrittlängen (S12) vor der Wiederaufnahme Training auf den langen Schritten ( S15) schließlich nähert sich der gewünschte Schrittlänge.
    2. Wenn der neue Abstand induziert Angst oder Unbehagen mit der Aufgabe, stellen Sie die Zapfen auf die vorherige Einstellung und wiederholen Sie das Training Paradigma.
    3. Fahren Sie mit diesem Training, bis die entsprechenden inter-Schrittlängen sind für die vier Bedingungen und Bewegungsnormen eingehalten werden erreicht. Unserer Erfahrung nach reagieren die Ratten auch Gesangs Ermutigung als Hinweise für die Einleitung eines Prozesses. Die Tests können an demselben Tag durchgeführt, wie Ausbildung vorgesehen seindie Themen sind motiviert, um die Aufgabe zu erfüllen.
      Hinweis: Die Bewegungs Standards sind wie folgt: Gehen ist konsistent und nicht stoppt oder Fehltritte zu beteiligen; Kopf-Wippen ist minimal; der Rücken ist gewölbt und der Schwanz wird während der Fortbewegung angehoben; jedes Glied ist eindeutig von einer orthogonalen Ansicht des Weges beim Einsetzen sichtbar und Versatz der Standphase. Dieser Auswahlprozess ist wichtig, da die vorliegende Studie konzentriert sich nur auf Fuß, anstatt anderen Gaiting Verhalten.

3. Prüfung und Datenanalyse

  1. Versuchstiere auf S12, S15, L9R6 und L6R9 Aufgaben mit randomisierten Session-Design (in Abschnitt 1.3 beschrieben). Benutzen Sie Pausen, um die Anpassung innerhalb einer Aufgabe zu vermeiden.
  2. Nehmen Sitzungen mit High-Definition-Kamera mit einer Abtastrate von mindestens 60 Hz. Import Videoaufnahmen ohne erneute Probenahme in Videobearbeitungssoftware und wählen Sie nur die Fuß-Kämpfe für die weitere Analyse.
  3. Mark Onsets und Offsets der kinematischen Phasenin Video-Aufnahmen aus jedem Thema.
  4. Hier verwenden Sie die benutzerdefinierte Software namens Videoa in Matlab geschrieben, um die Zeit der Haltung Ausbruch manuell identifizieren und Offset für jede Extremität auf einer Frame-by-Frame-Basis, wo Haltung Einsetzen wird durch den Verlust der Bewegungsunschärfe mit dem Schenkel Platzierung auf einhergeht ein Zapfen oder Haltung versetzt sind, beim Einsetzen der Schenkel Abheben auftritt, wird durch den ersten Nachweis einer Bewegungsunschärfe, angegeben.
  5. Berechnen Sie die Dauer der Schwungphase als die übrigen zwischen zwei aufeinander folgenden kinematischen Haltung Onsets Zeit. Schließen jede Verhalten nicht mit oberirdischen quadrupedal Fuß konsistente, z. B. beim Gang über ein Doppelschwungphase (beide Vorderbeine oder Hinterbeine über dem Boden), vom Verfahren analysiert.
  6. Zeichnen Sie die Dauer jeder Phase in Abhängigkeit von dem entsprechenden Schritt Zyklusdauer. Erfassen Sie die Beziehung mit dem linearen Regressionsmodells (Tphase = B1 + B2 * Tc) für jede Extremität, wobei Tc Zyklusdauer erhalten wird, ist Tphase either Te Streckbezogene Haltung oder Tf, die die Beugebezogenen Schwung ist und B1 und B2 empirische Konstanten (Offset und Steigung) des Regressionsmodells.
    Anmerkung: Die Steigung (B2) den Betrag der Änderung der Phasendauer mit der Änderung in der Geschwindigkeit der Fortbewegung.
  7. Verwenden der Gleichungen 1 und 2 (2C) für jeden Schenkel eine Asymmetrie Index zu berechnen (AI). Beide Gleichungen haben die gleiche Form einer einfachen Verhältnis, das die Differenz der beiden Werte zu ihrer Summe normalisiert.
    1. Unter Verwendung von Gleichung 1, die Berechnung der horizontalen Differenz (AI h), die den Unterschied zwischen Hängen Haltung Modulations linken (L) und rechten (r) Glieder verwendet. In ähnlicher Weise berechnet die vertikale Asymmetrie (AI v) mit den Pisten von vorne / anterioren (a) und zurück / posterior (p) Glieder. Das Ergebnis der Anwendung dieser beiden Gleichungen ist die Datenmenge von 4 xy Punkte entsprechend 1) forelimb Asymmetrie AAI h; 2) Hinterlauf Asymmetrie pAI h; 3) nach links Vorderbein-Hinterlauf Asymmetrie, Lai v; 4) rechte Vorderbein-Hinterlauf Asymmetrie Rai v.
    2. Plotten diese Werte als Patch (2B) für die visuelle Darstellung der Asymmetrie in allen Gliedern.
  8. Berechnen Diagonalität Indizes (DI), um diagonale Kopplung zwischen Parameter einer Vorderbein und seine kontralaterale Hinterlauf (Gleichung 3, 2C) zu beurteilen.
  9. Testen Sie die DI sowie den Unterschied von vier KIs zwischen Bedingungen entgegen Asymmetrie (ΔAI = | AIL9R6 - AIL6R9 |) auf statistische Signifikanz unter Verwendung einer Einweg-ANOVA mit post-hoc-Vergleich von mittels Analyse 19

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Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die Analyse der Asymmetrie in den Bewegungsaufgaben für einen einzigen Vertreter unterliegen. (- 400 g, 3 250), wurden die Werte für alle Bedingungen unter Verwendung von Gleichung 1 und 2 von allen Probanden individuell (Abbildung 2) und von zusammengesetzten Daten von 8 weiblichen Sprague-Dawley-Ratten ermittelt. Im Allgemeinen ist die Modulation der Vordergliedmaße Standphase war weniger für die Seite, auf die die Fo...

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Diskussion

Der Grundgedanke für diese Studie war die Entwicklung einer Verhaltensaufgabe, die die Veränderungen in der präzisen Steuerung des asymmetrischen Bewegungsverhaltens quantitativ bewertet. Die Existenz des spinalen CPG ist seit einiger Zeit funktionell nachgewiesen20, aber die anatomischen und funktionellen Merkmale, die seinen Mechanismus beschreiben, sowie seine modulatorischen Eingaben von absteigenden oder sensorischen Rückkopplungswegen wurden erst im letzten Jahrzehnt charakterisiert6,21,22. De...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Kriss Franklin, Amanda Pollard und Justine Shaffer halfen bei der Tiererziehung und Datenerfassung. Sarah Freeman und Alisa Ivanova trugen zur Datenanalyse bei. Diese Studie wird vom WVU School of Medicine Start-Up, dem NIH/NIGMS U54GM104942 und dem NIH CoBRE P20GM109098 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MATLAB® R2013aMathWorksDesign-Plattform für benutzerdefinierte Videoseine Videoannotationssoftware
Sony HDR-CX380/B High Definition HandycamSony27-HDRCX330/BVideoaufnahmegerät.
Jif Creamy Peanut Butter - Glutenfrei 454 gJ.M. Smucker CompanyFood Belohnungsreiz.
Saccharose Tablette - Schokolade 1800 gTestDiät1811256Belohnungsreiz für Lebensmittel.
Manzanita Holz-NagestäbchenBioServeW0016Zur Präsentation von Belohnungsreizen für Lebensmittel.

Referenzen

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