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Methodenartikel

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

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DOI:

10.3791/52959

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17. August 2015

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1Cellular Networks Proteomics Unit, Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie absolute Quantifizierungsassays von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben unter Verwendung ausgewählter Reaktionsüberwachung durchgeführt werden. Es wurde verwendet, um Proteine des Chemotaxis-Signalwegs von Mausmakrophagen genau zu quantifizieren. Die Auswahl des Zielpeptids, die Assay-Entwicklung sowie qualitative und quantitative Assays werden ausführlich beschrieben.

Zusammenfassung

Die absolute Quantifizierung von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben ist entscheidend für eine breite Palette von Forschungs- und klinischen Anwendungen. Dieses Protokoll enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entwicklung und Anwendung quantitativer Assays mit Hilfe der Massenspektrometrie (Selected Reaction Monitoring, SRM). Zunächst werden wahrscheinliche quantotypische Zielpeptide anhand zahlreicher Kriterien identifiziert. Dazu gehören die Identifizierung proteotypischer Peptide, die Vermeidung posttranslationaler Modifikationsstellen und die Analyse der Einzigartigkeit des Zielpeptids mit dem Zielprotein. Als nächstes werden rohe externe Peptidstandards synthetisiert und zur Entwicklung von SRM-Assays verwendet, und die resultierenden Assays werden verwendet, um qualitative Analysen der biologischen Proben durchzuführen. Schließlich werden gereinigte, quantifizierte, mit schweren Isotopen markierte interne Peptidstandards hergestellt und zur Durchführung von SRM-Assays der Isotopenverdünnungsserie verwendet. Es wird eine Analyse aller resultierenden MS-Daten vorgestellt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die absolute Häufigkeit von Proteinen des Chemotaxis-Signalwegs in RAW 264.7-Zellen (einer Maus-Monozyten/Makrophagen-Zelllinie) genau zu bestimmen. Die Quantifizierung von Gi2 (ein heterotrimeres G-Protein α-Untereinheit) wird ausführlich beschrieben.

Einleitung

Proteom-Experimente, die Massenspektrometrie (MS) können so gestaltet werden, entweder nicht-zielgerichtete (Schrotflinte) oder gezielte Methoden verwenden. Entdeckung Proteomik beruht in der Regel auf Bottom-up-Schrotflinte MS, entweder durch die Verwendung eines herkömmlichen datenabhängigen Erfassungsmodus oder mit Hilfe eines der neu entwickelten Datenunabhängige Techniken (zB MS E, SWATH) 1,2. Shotgun Proteomics ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Hochdurchsatz-Peptid-Identifikation und relative Quantifizierung, aber es in der Regel für die absolute Quantifizierung oder auf kleine, definierte Sets (~ zig) von Proteinen ungeeignet ist. Die MS-Methode die am häufigsten für gezielte Proteomics ist wegen seiner hohen Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Dynamik 3-5 gewählten Reaktionsüberwachung (SRM). Alternativen zu SRM sind parallel Reaktionsüberwachung, die Vorteile der hochauflösenden Voll MS Scan-6 nimmt.

SRM ist in der Regel unter Verwendung einer Nanofluss reverSED Phasen-Hochleistungschromatographie (Nano RP-LC) Gerät in einen Nanoelektrospray-Ionisations (nano-ESI) Ionenquelle zu einer Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (QqQ-MS) angebracht ist. In einem typischen Experiment werden Probenproteinen proteolytisch verdaut und die resultierenden Peptide werden chromatographisch getrennt, desorbiert und ionisiert. Die erhaltenen Vorläuferionen m / z durch den ersten Quadrupol (Q1) gefiltert und fragmentiert in der zweiten Quadrupol (Q2) durch Kollision sie mit einem Stoßgas. Die resultierenden Fragmentionen m / z-gefiltert in dem dritten Quadrupol (Q3) und durch eine Dynode quantifiziert. Jedes Vorläufer- und Fragmentionenpaar wird als Übergang bezeichnet, und jeder Übergang wird für eine bestimmte Zeitdauer (die Verweilzeit, typischerweise 2-50 ms) überwacht. Während LC-SRM, die QqQ-MS durchläuft einer vordefinierten Liste von Übergängen (das Tastverhältnis ist typischerweise ≤3 s) und ein Chromatogramm jedem Übergang entsteht.

Alternative strategies zur Proteinquantifizierung verwenden in der Regel Immunoassays wie Dot-Blots, Western Blots, ELISAs, Antikörper-Mikroarrays, Reverse-Phase-Protein-Microarrays, Mikrofluid-Immunoassays, digital ELISAs, und Mikrokügelchen basierende Immunoassays 7. Die besten Immunoassays deutlich empfindlicher als LC-SRM ist, und der Probendurchsatz von Immunoassays deutlich höher als die der LC-SRM 5 sein. Jedoch kann die Entwicklung Immunoassays teuer und / oder zeitaufwendig, und die resultierenden Assays können anfällig für Cross-Reaktivität und / oder Störungen, inkompatibel mit Zell- / Gewebe Lyse / Homogenisierungsverfahren werden und / oder nicht zugänglich Multiplexen 5,8. Einige dieser Probleme können durch Kopplung Antikörper- und MS-basierte Techniken behandelt werden. Zum Beispiel können Zielproteine ​​mittels Immunpräzipitation vor Proteolyse und LC-SRM 9-12 angereichert werden. Alternativ verwendet der SISCAPA Technik Immunpräzipitation im Anschluss an die Proteolyse im Peptid level 13,14. Neben Strategien immunoenrichment kann Immunodepletion hoher Fülle Proteine ​​eingesetzt werden, um LC-SRM Empfindlichkeit durch Reduzieren von Interferenz erhöhen koeluierender Analyten 15,16.

MS-basierte Proteinquantifizierung kann in relative und absolute Quantifizierung in markierungsfreien und stabilen Isotopenmarkierung (zB metabolische Markierung, chemische Markierung, und Heavy-markiertem Protein und Peptid-interne Standards) unterteilt werden, und auch. Markierungsfreie Techniken können nützlich für die relative Proteinquantifizierung, sind aber für eine genaue absolute Quantifizierung ungeeignet. Im Vergleich dazu haben Markierungstechniken Fehler mit Probenvorbereitung und MS assoziierten Varianz reduziert und werden häufig für die relative Proteinquantifizierung 17 eingesetzt. Zum Beispiel unter Verwendung einer kultivierten humanen Zelllinie aktiviert relative Quantifizierung Biomarkern über LC-SRM von menschlichem Serum 18 hergestellten stabilen Isotop markiert Proteoms (SILAP) -Standards. Genaue absolute Proteinquantifizierung von MS verlangt, dass gereinigte, quantifiziert, isotopenmarkierte Protein oder Peptid internen Standards versetzt, in biologischen Proben vor der MS werden. Der Einbau von schweren Isotopen-markierten internen Standards in ein LC-SRM-Workflow ermöglicht absolute Quantifizierung, die nachweislich hoch reproduzierbar und übertragbar zwischen Laboratorien 16,19 sein.

Stabiles Isotop markierten internen Standards für die absolute Proteinquantifizierung von MS gehören Peptid-Standards unter Verwendung von Festphasensynthese 20, Proteine ​​von verketteten Protease-spaltbare Peptidstandards 21, und in voller Länge Proteinstandards 22 vorbereitet. Zielprotein kovalente Modifikation und unvollständig Probenvorbereitung (dh unvollständige Lyse der Probe und Homogenisierung und unvollständiges Protein-Solubilisierung Denaturierung, Alkylierung und Proteolyse) kann eine genaue Quantifizierung zu untergraben. Interne protein Normen sind die am wenigsten von den meisten dieser potentiellen Probleme betroffen sein, aber sie sind in der Regel die schwierig herzustellen. Eine Alternative ist es, jede Zielprotein Verwendung mehrerer interner Peptidstandards, die dazu bestimmt sind, Amino- und Carboxy-terminalen nativen flankierenden Reste umfassen analysieren. Unabhängig davon, welche Art von interner Standard verwendet wird, sollte es während der Probenvorbereitung wie möglich Spike-in werden die biologischen Proben in einem möglichst frühen Zeitpunkt. Außerdem sollten mehrere Probenpräparationstechniken (zB unterschiedliche Denaturierungsbedingungen) getestet werden. Die Verwendung von mehreren orthogonalen experimentellen Techniken (experimentell Kreuzvalidierung) ist eine praktikable Strategie zur Überwindung meisten Quantifizierung mögliche Herausforderungen 23-25.

LC-SRM Quantifizierung von Proteinen ist ein sehr flexibles Verfahren, das in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet worden ist. Bemerkenswerterweise wurde verwendet, um Peptid- und Protein-Biomarkern in studierenklinischen Proben, wie Serum, Stanzbiopsien und Feinnadelabsaugungen 5. LC-SRM ist auch verwendet worden, um die Stöchiometrie von Proteinkomplexen 5,26 messen, Botulinumneurotoxine 27 zu erfassen, um die Proteinphosphorylierung Dynamik innerhalb Signalwege 5 quantifizieren und um Änderungen in der Proteinkonformation 28 zu quantifizieren.

Unser Labor ist mit LC-SRM, die Signalproteine, die Makrophagen-Chemotaxis vermitteln, um die Entwicklung von Chemotaxis Signalweg Simulationen unterstützt quantifizieren. Das Gesamtkonzept des Protokolls (Abbildung 1) beginnt mit Ranking der vorläufige Soll Peptide. Anschließend werden rohe externen Peptidstandards synthetisiert und verwendet werden, um LC-SRM-Assays für die qualitative Analyse von biologischen Proben zu entwickeln. Wenn der biologischen Probe stammenden Zielpeptid erfaßt wird, werden gereinigte Schwer markierten internen Peptid-Standards für die quantitative LC-SRM hergestellt. Dieses Protokoll kann zu ac verwendet werdennau Quantifizierung von Proteinen aus einer Vielzahl von biologischen Proben und zur Untersuchung einer Vielzahl von Proteinziele zu unterstützen.

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Protokoll

Hinweis: Diese Methode wurde bereits beschrieben 56 worden.

1. Peptidzielauswahl

  1. Stellen Sie eine Liste der Zielproteine, und verfügen über eine kleine Anzahl von Housekeeping-Proteinen für die Normalisierung in biologischen Proben, und auch eine interne Proteinstandard (zB Glühwürmchen-Luciferase). Verdauen die Zielproteine ​​in tryptischen Peptide in silico mit einem Software-Tool, wie beispielsweise Proteinverdauung Simulator 29,30.
  2. Erfordern, dass die Peptide sind voll tryptischen und enthalten keine fehlenden Trypsin-Spaltstellen. Vermeiden Peptide mit den Nachbar Trypsin-Spaltstellen, um möglicherweise unvollständig Trypsinverdau 31 zu vermeiden.
  3. Erfordern, daß die Länge jedes Peptid 5-20 Resten. Betrachten Sie längere Peptide, aber beachten Sie, dass sie in der Regel teurer zu synthetisieren.
  4. Vermeiden Sie ein Peptid, wenn sie auf eine natürliche genetische Variante (zB ein Single-Nukleotid entsprichte-Polymorphismus). Vergewissern Sie sich außerdem, dass die Trypsin-Websites sind nicht betroffen (Schritt 1.2).
  5. Vermeiden Sie ein Peptid, wenn es zu einem Ort der posttranslationalen Modifikation (PTM) entspricht. Ähnlich zu vermeiden, die ein Peptid, wenn es während der LC-MS Probenvorbereitung wäre anfällig für chemische Modifikation. Insbesondere vermeiden Peptide anfällig für Cystein und Methionin-Oxidation, Asparagin und Glutamin Desamidierung und Amino-terminalen Glutamin Bildung von Pyroglutamat. Bestätigen, dass die Trypsin-Websites sind nicht betroffen (Schritt 1.2).
    1. Außerdem vermeiden Peptide, die von Protein-Amino- und Carboxy-Termini stammen, da Protein-Termini sind anfällig für posttranslationale Modifikation (aminoterminales Methionin Verlust und Acetylierung und Carboxy-terminale Amidierung).
  6. Verlangen, dass jedes Zielpeptid ist einzigartig für jedes Zielprotein. Wenn dies nicht möglich ist, erfordern, daß das Peptid ist einzigartig für einen Satz von Isoformen / Homologen. Gönnen Peptide sich nur durch Leucin / Isoleucin-Substitutionals ob sie identisch waren bei der Ermittlung Peptid Einzigartigkeit, denn diese führen fast identisch bei LC-SRM.
    1. Ist eine umfangreiche transkriptomischen Analyse aller der biologischen Proben wurde (zB RNA-seq) durchgeführt wird, zu bestimmen Peptid Einzigartigkeit Verwendung in silico Übersetzungen der Transkript-Sequenzen 32 anstelle der Verwendung der Proteom der Arten.
  7. Erfordern, dass die Zielpeptide sind proteo. Identifizieren proteo Peptide mit Schrotflinte Massenspektrometrie 1,2 der biologischen Proben untersucht. Alternativ abrufen Peptid Identifikationen proteotypischen Peptide, die von Online-Proteomics-Datenbanken wie die NIST-Massenspektrometrie Bibliotheken 33 (http://peptide.nist.gov/), der weltweit Proteome-Maschine 34 (X HUNTER Spektrenbibliotheken von http: // www .thegpm.org / Jäger / index.html und GPMDB Peptididentifikationen von http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas 35 (http://www.peptideatlas.org/), und der Stolz-Datenbank 36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
  8. Wenn quantitative Transkript Ebene Analysen von biologischen Proben durchgeführt wurden (zB RNA-seq, qPCR) dann vermieden wird, die Peptide, die an den relativ niedriger Abundanz Transkripten entsprechen.
  9. Bei Bedarf können Sie Zielpeptide, die für die LC-SRM-Assays an Zielprotein Orthologe eingesetzt werden könnten (beispielsweise, um sowohl der menschlichen und der Maus-Formen von einem Target-Protein-Assay).
  10. Wählen Sie mindestens zwei Zielpeptide pro Zielprotein (wenn möglich).

2. Herstellung von Peptidstandards

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls wird die Herstellung einer Reihe von zwanzig lyophilisierten Peptids Standards (wobei jeder 1 nmol in Menge) für Downstream-Analysen. Für eine unterschiedliche Anzahl von Peptiden oder für unterschiedliche Peptidmengen, es müssen entsprechend angepasst werden.

  1. Vorbereiten lyophilisierten Peptids Standards (≥1 nmol) unter Verwendung eines Peptidsynthesetechnik wie SPOT Synthese 20,37.
    1. Sicherzustellen, dass die Cysteinreste externer Peptidstandards carbamidomethylated (die chemische Struktur von Iodacetamid Alkylierung gebildet). Im Gegensatz dazu sicherzustellen, dass die Cysteinreste des internen Peptidstandards unmodifiziert sind (diese werden bei der Probenvorbereitung, alkyliert werden, wie unten beschrieben).
    2. Gestalten Sie interne Peptidstandards, so dass sie Amino- und Carboxy-terminalen nativen flankierenden Reste enthalten (für Trypsinverdau Effizienz kontrollieren; jeder ist in der Regel drei Minuten vor sechs Reste lang).
    3. Entwerfen internen Peptidstandards, so dass sie mit stabilen Isotopen markiert. Stellen Sie sich das natürliche Isotopenprofil der Zielpeptid und die Masse Messgenauigkeit der MS bei der Auswahl eines Peptidmarkierungsstrategie. Verwenden Sie keine deuterierten Peptidstandards weil Peptid Deuterierung Ursachen Umkehrphasen-LC-Retentionszeits 38 zu verschieben.
      Anmerkung: In der Regel werden tryptische internen Peptidstandards mit ~ 98% rein synthetisiert [13 C 6, 15 N 4] Arg und [13 C 6, 15 N 2] Lys am Carboxy-Terminus eingebaut.
    4. Reinige interne Peptidstandards unter Verwendung von HPLC 39, und genau zu quantifizieren 40.
  2. Geben Sie 100 ul 0,1% v / v Ameisensäure, kann 20% v / v Acetonitril (ACN), um je 1 nmol lyophilisierten Peptids Standard, um eine Peptidkonzentration von 10 uM (Aufpassen, da lyophilisierten Peptids zu erzeugen eine sehr geringe Dichte haben und kann leicht verloren gehen). Wirbel die Proben für 2 min und Bade beschallen sie für 5 min, um sicherzustellen, dass das Peptid die Auflösung vollständig ist.
  3. Bündeln die gelösten Peptide und konzentrieren das erhaltene Gemisch im Vakuum-Konzentrator auf ein Endvolumen von 80 ul. In 20 ul ACN, jede ausgefallene Peptid aufzulösen.
    Hinweis: der Beispiel jetzt Contains 10 uM von jedem Peptid und 20% v / v ACN.
  4. Für interne Peptid-Standards, bereiten eine Verdünnungsreihe zur quantitativen LC-SRM:
    1. Vorzubereiten 100 ul einer 1 uM Verdünnung: Kombinieren 90 ul 20% v / v ACN und 10 ul der 10 & mgr; M Peptidmischung.
    2. Vorzubereiten 100 ul einer 100 nM verdünnt: Kombinieren 90 ul 20% v / v ACN und 10 ul der 1 & mgr; M Peptidmischung.
  5. Für externe Peptidstandards, bereiten 100 ul einer 1 & mgr; M Verdünnung für die LC-MS indem 90 ul 0,1% v / v Ameisensäure und 10 ul der 10 & mgr; M Peptidmischung.
    Hinweis: Die Probe enthält jetzt 1 & mgr; M von jedem Peptid, 0,1% v / v Ameisensäure und 2% v / v ACN, und ist bereit, für LC-SRM Assay-Entwicklung verwendet werden.

3. LC-SRM-Assay-Entwicklung

  1. Analyse der Mischungen der externen Peptidstandards (ungefähr 1-10 pmol jedes Peptid pro Injektion) von Shotgun MS unter Verwendung eines Nano-Strömungs HPLC System zu einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (LC-QqQ-MS (/ MS)) gekoppelt ist.
    1. Verwenden Sie ein LC-MS-System mit einer Kapillarsäule mit C-18-Medien (≤5 um Durchmesser, ~ 200 Å Poren, Länge ≥10 cm, id = 50-100 um) gepackt ausgestattet und ein Nano-ESI-Spitze (in der Regel unter Verwendung hergestellt ein Laser-Puller). Sicherzustellen, dass jeder LC-MS Lauf umfasst eine ~ 60 min linearer Gradient (typischerweise 0-40% Lösungsmittel B), eine Spalte Regenerationsschritt (~ 80% Lösungsmittel B) und eine Spalte Reäquilibrierung Schritt (~ 0% Lösungsmittel B ) (Lösungsmittel A = 0,1% v / v Ameisensäure in H 2 O, Lösungsmittel B = 0,1% v / v Ameisensäure in ACN, Fließgeschwindigkeit = 200-800 nl / min, ESI-Spannung = 1800 V, Q3 Isolationsbreite = 0,7 m / z, q2 Argondruck = 1,5 mTorr).
    2. Für jede Vorläuferionenscan, dynamisch wählen Sie die oben ~ 10 intensivsten Vorläuferionen für die Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS). Führen jeder Probe in Doppelbestimmung, so dass zwei unterschiedliche Kollisionsenergie Rampen verwendet werden: ein optimal, wenn fragmentieren +2 Vorläuferionen und die anderefür drei Vorläuferionen 41.
    3. Führen Sie das LC-QqQ-MS (/ MS) Analysen mit Q3 Vorläuferion Scannen (Q1 Vorläuferion Scannen kann Tailing der Vorläufer-Ionen-Peaks, die aus niederenergetischen Argon Kollisionen in Q2 verursachen).
    4. Stellen Sie sicher, dass der LC-MS-System ausreichend Durchführung durch die Analyse von QC Proben und technische Replikate. Verhindern von Probenmaterial unter Verwendung von frisch zubereiteten LC-Säulen und Ausführen mehrerer Rohlinge zwischen den Proben.
  2. Analyse der resultierenden shotgun LC-QqQ-MS (/ MS) von Daten mit Datenbanksuche gegen den Sequenzen der externen Peptidstandards 42. Falls verwerfen mehrdeutig Peptididentifikationen mit den Peptididentifikations Konfidenzbewertungen (zB Erwartungswerte) oder mit statistischen Modellierung 42. Unabhängig davon, manuell alle Peptididentifikationen 43 überprüfen, um sicherzustellen, dass sie alle eindeutig.
  3. Verwenden Sie die Schrotflinte MS Peptididentifikationen construct eine Spektrenbibliothek mit einem Software-Programm wie Skyline.
    1. Bereiten Sie ein LC-SRM Übergang Liste mit den 3-10 intensivsten Übergänge pro Vorläuferion (+2 und +3 Vorläuferionen; +1 und +2 Fragmentionen, y-, b- und a-Ionen, die ≥2 Reste lang).
    2. Entsorgen Sie einen Übergang, wenn die Vorläufer- und Fragmentionen m / z-Werte überlappen, in der Masse Messgenauigkeit des QqQ-MS (Vorläuferionenfragmentierung ist manchmal unvollständig, denken Sie daran, die Mono-Isotope und die schweren natürlichen Isotopenformen, wie auch die nicht-markierten berücksichtigen und Schwer markierte Formen).
    3. In ähnlicher Weise einen Übergang zu verwerfen, wenn das Fragment-Ion m / z mit der von einem anderen Fragment-Ionen aus dem gleichen Vorläuferionen.
  4. Mit den daraus resultierenden Übergangslisten durchzuführen LC-SRM-Analysen der Mischungen der externen Peptidstandards (führen Massenspektrometrie, wie in Schritt 3.1 beschrieben; Q1 und Q3 Isolationsbreite = 0,7 m / z; Verweilzeit = 2-50 ms).
  5. Manually überprüfen Sie die resultierende LC-SRM-Daten und löschen Sie alle mit schlechter Leistung Assays (die Analyse der LC-SRM-Daten ist in Kapitel 5 beschrieben).

4. LC-SRM-Assays biologischer Proben

  1. Bereiten Sie die Speisen von kultivierten Zellen 44. Wenn mehrere Versuchsbedingungen werden, Block verglichen und zufällig die Proben, um mögliche systematischer Fehler 45 zu reduzieren.
  2. Für jedes Gericht von Zellen, saugen Sie den Zellkulturmedium zu verschwenden und die Zellen in einem Serum-freien Puffer 44. Falls erforderlich, die Zellen werden in einem serumfreien Puffer, um alle verbleibenden extrazelluläre Protein zu entfernen.
  3. Für jede Probe, zählen die Anzahl der lebensfähigen Zellen und insgesamt durch die Verwendung eines Lebensfähigkeit Fleck (zB Trypanblau) und einer Zählkammer oder eines automatisierten Zellzählers 44.
  4. Pellet die Zellen durch Zentrifugation, und saugen Sie den Überständen zu verschwenden 44 (eine typische Zellpellet Volumen ist ~ 30 & mgr; l).
  5. In 400 ul Lysispuffer Harnstoff oder Tensid Lysepuffer zu jedem Zellpellet (100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, 10 & mgr; M Bestatin Hydrochlorid, 10 uM Pepstatin A und entweder 8 M Harnstoff oder 0,1% w / v Tensid (bzw. ); frisch zubereiteten, verwenden eine säurelabile MS-kompatible Tensid wie RapiGest SF oder PPS Stumm Tensid). Bei Verwendung anderer Proteaseinhibitoren, sicherzustellen, dass sie nicht Trypsin hemmen.
  6. Mischen Sie jede Probe mit sanften Pipettieren, und übertragen Sie die jeweils mit einem 2-ml-Tube (mit einem Schraubdeckel mit einem O-Ring) mit ~ 100 & mgr; l von 0,1 mm Zirkonia / Silica-Kügelchen (beachten Sie, dass die Perlen können Schnappdeckelröhrchen führen zu lecken ). Lyse der Zellen durch Verwirbeln der Proben für 5 min bei voller Geschwindigkeit (das die Zellen lysiert durch Kugelschläge).
    1. Alternativ lysieren die Zellen unter Verwendung eines anderen mechanischen Verfahren (zB mit einem Französisch Presse oder Homogenisierung Tipps).
      Hinweis: Vermeiden Sie Zentrifugieren Zelllysate da dies ausgefällte Protein pelletieren, die ot könntechts, sonst tryptisch verdaut und durch LC-MS nachgewiesen werden.
  7. Das Tensid denaturierten Proben, inkubieren bei 90 ° C für 10 min, Proben Homogenisierung und Proteindenaturierung zu unterstützen.
  8. Bad beschallen die Proben für 10 min bei Raumtemperatur zu einer Homogenisierung und Proteindenaturierung zu unterstützen.
    Anmerkung: Die Lysate und Lysepuffer kann bei -80 ° C gelagert werden (der Lysepuffer wird für die Schritte 4.9 und 4.13 erforderlich).
  9. Durchführen einer Proteinkonzentration Assay 46 (zB ein Bicinchoninsäure-Assay) der Lysate (und des Lysepuffers als Kontrollversuch).
  10. Für qualitative Analysen (dh, werden keine internen Standards versetzt Peptid-in die Proben werden), Pipette 200 ug (Proteinmasse) Zelllysat in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für quantitative Analysen, bereiten vier solcher Proben für einen stabilen Isotopenverdünnungsreihe.
  11. Für jede Probe, fügen Sie eine interne Proteinstandard (zB </ Em>, fügen ~ 5 pmol von ~ 98% rein Firefly Luziferase).
  12. Für quantitative Analysen, fügen Isotopenverdünnungsreihe der äquimolaren Mischung der internen Peptidstandards (beispielsweise 0, 0,2, 2, 20 pmol von jedem Peptid) an den Proben.
    1. Parallel dazu vorzubereiten Kontrollproben unter Verwendung der internen Peptidstandards alleine (dh ohne Zelllysat) (beispielsweise 0, 0,2, 2, 20 pmol von jedem Peptid).
    2. Auch bereiten Kontrollproben mit den externen und internen Peptidstandards (zum Beispiel: 2 pmol von jedem externen Peptid-Standard, und 0, 0,2, 2, und 20 pmol von jedem internen Peptid-Standard).
      Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Peptid-Standards sind frei von Ameisensäure als es mit dem Trypsinverdau stören.
  13. Hinzuzufügen Lysepuffer so dass alle Proben identische Volumina. Hinweis: Eine typische Probenvolumen 70 & mgr; l, so wird dieses Volumen für dieses Protokoll verwendet werden.
  14. Reduzieren Protein Cysteinreste durch Zugabe 0.7 ul 1 M DTT (frisch hergestellt) zu jeder Probe (die endgültige DTT Konzentration 10 mM) und die Inkubation der Proben bei 60 ° C für 30 min.
  15. Alkylat Protein Cysteinen durch Zugabe von 7 ul gepufferter Iodacetamid (500 mM Iodacetamid, 1 M HEPES ∙ NaOH pH 8; frisch hergestellt) zu jeder Probe (die endgültige Iodacetamid Konzentration 50 mM) und die Inkubation der Proben bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln (Iodacetamid ist lichtempfindlich). Falls erforderlich, löschen den verbleibenden Jodacetamid durch Zugabe DTT bis zu einer Endkonzentration von 50 mM.
  16. Für jede der Proben unter Verwendung von Harnstoff denaturiert, fügen 482 ul 100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, so dass der endgültige Harnstoffkonzentration 1 M (Trypsin signifikant bei> 1 M Harnstoff 47 gesperrt).
  17. Tryptisch verdauen die Proteine ​​in Peptide.
    1. Für jede Probe, das Zelllysat enthält, hinzuzufügen 8 ul 0,5 ug / ul Sequenziergrad modifizierten Trypsin so daß das endgültige Konzentrat TrypsinIon ist 01.50 (Protein w: w) Trypsin: Probe und inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 18 Stunden.
    2. Für jede Probe, die nicht Zelllysat enthält, werden 0,5 ul 0,5 ug / ul Sequenziergrad modifizierten Trypsin und Inkubation der Probe bei 37 ° C für 2 Stunden (jede dieser Proben sind für Kontrollversuche und enthalten typischerweise nur 10 ng -10 ug Peptid + Proteinmasse).
  18. Für jede der Harnstoff denaturierte Proben, fügen 440 ul 2% v / v Ameisensäure (die endgültige Ameisensäurekonzentration auf 1% v / v). Bestätigen Sie, dass diese Proben sind pH ~ 3.
    1. Für jede der Tensid denaturierten Proben, fügen 914 ul 0,5% v / v TFA (die endgültige TFA-Konzentration 0,5% v / v). Bestätigen Sie, dass diese Proben sind pH ~ 1,5. Diese Proben bei 37 ° C, 60 min, um das Tensid zu hydrolysieren.
  19. Mikrozentrifugen alle Proben bei 21.000 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um das Tensid Schwanzgruppe und andere prec Pelletipitates, die eine C-18-SPE-Kartusche verstopfen würde.
  20. Festphase zu extrahieren jedem der Überstände mit einer Einweg C-18-SPE-Kartusche (Puffer A = 0,1% v / v Ameisensäure; Puffer B = 0,1% v / v Ameisensäure, 80% v / v ACN; ~ 100 mg C- 18-Harz pro Kassette). Zwingen den mobilen Phasen durch die C-18-SPE-Kartusche mit einem ebenflächigen Gummiball, mit einem Extraktionsverteiler oder durch Zentrifugieren der Kassette in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen bei 10 × g für 5 min.
    1. Befeuchten Sie die Spalte, indem 1 ml Puffer B, ins Gleichgewicht, indem sie 1 ml Puffer A zweimal, gelten die Probe, und waschen Sie die Patrone, indem 1 ml Puffer A zweimal. Elution der Peptide, indem 1 ml Puffer B langsam (ca. 2 min).
  21. Konzentrat jedes Eluats im Vakuumkonzentrator auf ein Endvolumen von 100 ul zu verdampfen ACN. Zugeben von 200 & mgr; l H 2 O zu jeder Probe und engt jeweils im Vakuum-Konzentrator auf ein Endvolumen von 98 ul zu verdampfen mögliche Wiederverwendung entferntRest ACN.
  22. Add 2 ul von 5% v / v Ameisensäure in ACN zu jeder Probe (die endgültige Probenkonzentration 0,1% v / v Ameisensäure, 2% v / v ACN).
    Anmerkung: Die Proben können bei -80 ° C gelagert werden.
  23. Analyse der Proben mittels LC-SRM (wie in Schritt 3.4). Für qualitative LC-SRM-Analysen, führen Sie die biologischen Proben und die externen Peptid-Standards, und alle der erhaltenen Daten zusammen zu analysieren. Für quantitative LC-SRM-Analysen, führen Sie den Isotopenverdünnungsreihe von jeder biologischen Probe, und auch laufen die Proben, die aus den Peptid-Standards allein, und alles der erhaltenen Daten zusammen zu analysieren.

5. LC-SRM Datenanalyse

HINWEIS: Peptide Identifizierung und Quantifizierung kann stark vereinfacht werden und mit Software wie Skyline teilweise automatisiert, aber es ist immer noch dringend empfohlen, dass alle Daten-Annotation manuell überprüft werden. Auch ist es am besten, um Protein-Ebene Informationen während der manuellen annot ausschließenation der LC-SRM-Daten um Verzerrungen zu vermeiden.

  1. Für jedes Peptid Identifizierung, zu bestätigen, dass die Form jeder Übergang Elutionsprofil ist in etwa gaußförmig. Für jeden Übergang, zu bestätigen, dass das Elutionsprofil ist das Produkt mehrerer Signale von der MS-Detektor gemessen (das heißt, nicht das Produkt von einer oder zwei zufällige Spitzen von MS-Rauschen).
  2. Für jedes Peptid Identifizierung, sicherzustellen, dass das gesamte Peptid Elutionsprofil ausgewählt. Vermeiden Sie manuell die Anpassung der Elutionsprofil Grenzen der Teilkomponenten des Peptid-Identifikation (Schwer-markierten Peptidform, die nicht markierten Form, einzelne Vorläuferionen, und individuelle Übergänge).
  3. Zu bestätigen, dass jeder Übergang Elutionsprofil hat einen Signal-Rausch-Verhältnis (S / N) ≥3. Hinweis: "Noise" bezieht sich auf Zufalls MS Lärm, nicht auf Signal von koeluierender Analyten reproduzierbar. Chromatogram Glättungsfunktionen können die Analyse von stark verrauschten Daten zu unterstützen.
  4. Für jedes Peptid Identifikation,zu bestätigen, dass alle Übergänge nahezu identische Elutionsprofile (nicht nur gleiche Spitzenscheitelzeiten, Elutionsprofile können verschiedene Amplituden aufweisen).
  5. LC-SRM Analysen einer großen Menge der Peptid-Standards (typischerweise ≥100 fmol jedes Peptids), bestätigen, daß die entsprechende Peptid-Elutionsprofile sind sehr intensiv (typischerweise s / n ≥100) und daß die Peptididentifikationen eindeutig. Anmerkung: Diese sehr zuversichtlich Identifikationen kritisch für die Identifizierung der entsprechenden biologischen Probe abgeleitete Peptide sein.
  6. Für jedes Peptid Identifizierung, zu bestätigen, dass die relativen Übergangsstärken mit denen der selbstbewusst identifizierte Peptid-Standard. Falls erforderlich, verwerfen laut, relativ niedriger Intensität Übergang Elutionsprofile, aber bestätigen, dass keiner der relativ starke Übergänge fehlen. Ignorieren Sie relativ starke Übergangs Elutionsprofile, die durch eine Zusammenarbeit deutlich und eindeutig betroffen sindeluierenden Verunreinigung.
  7. Für jedes Peptid Identifikation, schätzen die Wahrscheinlichkeit, dass sie nach dem Zufallsprinzip von Hintergrundsignal (random MS Rauschen plus reproduzierbare Signal von koeluierender Analyten) produziert wurde.
    1. Manuell schätzen diese Wahrscheinlichkeit durch die Untersuchung der gesamten LC-SRM Chromatogramms und der Schätzung der Einzigartigkeit jedes Peptid-Identifikation. Produzieren eine Reihe von zuversichtlich Peptididentifikationen, die einen geschätzten False Discovery Rate (FDR) von 5% hat. Verwenden strengere Kriterien (zB FDR ≤1%), wenn ein höheres Vertrauen gesetzt von Identifikationen erforderlich (Verwendung von lockerere Kriterien wird nicht empfohlen).
    2. Alternativ können Sie die mProphet Algorithmus 48 bzw. des Prüfungsalgorithmus 49, aber die Ergebnisse manuell überprüfen.
  8. Für jedes Peptid Identifizierung, zu bestätigen, dass die beobachtete Elutionszeit ist konsistent mit der Hydrophobie des Peptids (Skyline ist entworfen, um diese Berechnung durchzuführen).
  9. Für jedes Peptid, zu bestätigen, dassdessen Elutionszeit ist konsistent über die LC läuft.
    Hinweis: LC-SRM-Analysen manchmal produzieren Elutionsprofile, die systematisch zwischen den Läufen verzerrt werden. Systematischen Verschiebungen nach Instrument Veränderungen, wie das Ersetzen einer Spalte zu erwarten. Auch kann früh eluierenden Peptide anfällig Verschiebung (insbesondere wenn die Säule geladen nahe Kapazität) ist, und späte Elution Peptide können auch anfällig für verlagern. Peptididentifikation ist nun abgeschlossen.
  10. Zur Verbesserung Peptid Quantifizierung einmal inspizieren jedes Peptid Identifizierung und verwerfen einen Übergang Elutionsprofil, wenn es besonders laut Vergleich zu den anderen Übergangs Elutionsprofile der Peptididentifikation. Wirf eine Übergangs Elutionsprofil wenn seine relative Übergangsintensität ist falsch (im Vergleich zur Peptid-Standard).
  11. Überprüfen Sie die Grenzen jedes Vorläuferion und Übergangs Elutionsprofil. Falls notwendig, sorgfältig die Elutionsprofil Grenzen anpassen, um Hintergrundsignal beschneiden entfernt (oder improve Hintergrundsignal Schätzung).
  12. Für jede interne Peptid-Standard, zu überprüfen, ob es mit einer nachweisbaren Menge an Licht Peptid verunreinigt (von der LC-SRM-Analysen der internen Peptidstandards allein, oben beschrieben). Anschließend verwerfen Licht Peptid Elutionsprofile, die wesentlich durch Licht-Peptid-Verunreinigungen innerhalb der internen Peptidstandards kompromittiert wurden.
  13. Quantifizieren jeden Übergang Elutionsprofil durch Berechnung seiner LC-Peakfläche. Gegebenenfalls Abzug der geschätzten Hintergrundsignal. Quantifizierung jedes Peptid Elutionsprofil durch Addition der entsprechenden Übergangs Quantifizierung Werte (nachfolgend wird dies als "Sum_Peak_Area" Wert bezeichnet). Für jede biologische Probe Peptid Sum_Peak_Area Wert, die Berechnung der biologischen Probe Peptid molaren Überfluss mit Daten aus LC-SRM von internen oder externen Peptidstandards (nur die Übergänge, die erfolgreich sowohl von der biologischen Probe Peptid quantifiziert wurdenLC-SRM, und dass der Peptidstandard).
    1. Quantifizierung mittels externer Peptidstandards (nicht empfohlen):
      1. Zeichnen Sie die externe Peptids Standard Sum_Peak_Area Werte im Vergleich zu den externen Peptid Standardwerte molarer Überfluss. Herstellung einer Standardkurve, indem eine lineare Regression auf die Daten (typischerweise nur die lineare Komponente des dynamischen Bereichs verwendet werden soll, jede nichtlineare Komponente mit äußerster Vorsicht verwendet werden). Für jede biologische Probe Peptid Sum_Peak_Area Wert, verwenden Sie die Standardkurve, um das Peptid molaren Überfluss zu berechnen.
        Anmerkung: Dieser Quantifizierungsverfahren ist nicht empfehlenswert, weil es erfordert, dass die Probenvorbereitung und die LC-SRM sein demonstrability robust, da die biologischen Proben und externen Peptidstandards werden durch LC-SRM getrennt hergestellt und analysiert. Auch dann, wenn es nicht für die Matrixeffekte (Wirkungen aufgrund von Komponenten von einer anderen als der Analyt-Probe) zu berücksichtigen.
    2. Quantifizierung mittels internerPeptid-Standards (empfohlen):
      1. Für jede biologische Probe Peptid Sum_Peak_Area Werte und entsprechende Schwer markierten internen Standardpeptid Sum_Peak_Area Wert, berechnen Sie die leicht / schwer Verhältnis. Verwenden Sie dieses Verhältnis als ein Maß für die entsprechende leichte / schwere Peptid molaren Häufigkeitsverhältnis, das molare Fülle der biologischen Probe-Peptid zu berechnen. Insbesondere entspricht die biologische Probe Peptid molaren Überfluss der internen Peptidstandard molaren Überfluss multipliziert mit dem leicht / schwer Sum_Peak_Area Verhältnis.
      2. Für jeden biologischen replizieren und Zielpeptid, identifizieren den linearen Bereich der LC-SRM Quantifizierung durch Erstellen einer Standardkurve unter Verwendung einer linearen Regression. Insbesondere zeichnen die internen Peptidstandard molaren Überfluss Werte im Vergleich zu den schwer / leicht Sum_Peak_Area Verhältniswerte (beachten Sie, dass die biologische Probe Masse konstant ist über die Datenmenge). Verlangen, dass jede biologische Probe Peptid Sum_Peak_Area Wert im linearen Bereich ist (typicFall sollte nur die lineare Komponente des dynamischen Bereichs verwendet werden; beliebige nichtlineare Komponente sollte mit äußerster Vorsicht verwendet werden). Ebenso führen Sie diesen Schritt für jede Zielpeptid Übergang.
        Hinweis: Analyt Quantifizierung mit LC-QqQ-SRM sollte linear über einen weiten Dynamikbereich (~ 10.000) sein. Am unteren Ende wird das Hintergrundsignal (random MS Rauschen plus reproduzierbare Signal von koeluierender Analyten) Quantifizierung Genauigkeit und Präzision zu reduzieren. Am oberen Ende wird Detektor Sättigungsnichtlinearität verursachen (schließlich kann dies dazu führen, Elutionsprofile flach ab einer bestimmten Signalstärke sein).
  14. Falls führen eine globale Normierungs für die Proben, wie beispielsweise eine zentrale Tendenz Normalisierungs 50, um geringe Unterschiede in der Probenmenge vor der Spiking-in der internen Peptidstandards zu korrigieren. Wenn nötig, verwenden Sie nur die Hauswirtschaft Proteine ​​aus Schritt 1.1.
  15. Bei Bedarf unterstellen fehlen quantificatIonen-Werte 51,52.
    Hinweis: Es ist unangemessen, einfach ersetzen fehlende Werte durch die Hälfte der unteren Bestimmungsgrenze (LLOQ) oder Halb der Nachweisgrenze (LOD), da dies würde künstlich reduzieren Quantifizierung Varianz und konnte in einem statistischen Test zur Folge haben (zB eine ANOVA ), die ein falsch positives Ergebnis (ein Typ-I-Fehler). Allerdings ignoriert fehlende Werte können auch problematisch sein. Zum Beispiel, wenn die Hälfte der wahren Fülle Werte unter der Nachweisgrenze, und die andere Hälfte über dem LLOQ, dann die mittlere Überfluss beobachtet würde überschätzen die meine wahre Fülle.
  16. Stellen Sie sicher, dass die Tests erfüllen die allgemein akzeptierte Richtlinien für die LC-SRM 23-25. Bemerkenswert ist, erfordern, dass der Variationskoeffizient der Quantifizierungswerte typischerweise ≤25% für klinische Assays und ≤35% für die nicht-klinischen Tests 25. Für LC-SRM-Assays zur Gesundheitsversorgung oder tierärztlichen Produkten oder Dienstleistungen, die für die Regulierungs App berücksichtigt werdenroval, verlangen, dass die Tests die strengeren Genauigkeitsanforderungen für solche Tests zu erfüllen: "Die je Konzentration bestimmt Präzision sollte 15% des Variationskoeffizienten (CV) mit Ausnahme der LLOQ, wo es sein sollte 20% des nicht überschreiten CV "23,24.

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Ergebnisse

Die Entwicklung von Vorhersageberechnungsmodelle von Signalübertragungswegen ist eines der grundlegenden Ziele der Systembiologie 53. Leider ist auch für Signalwege, die ausführlich untersucht worden und haben eine hohe klinische Bedeutung, es ist noch nicht allgemein möglich, quantitativ vorherWegs Verhalten in Reaktion auf Störungen (beispielsweise gilt dies für die MAPK / ERK-Weg 54). Vor kurzem hat eine Untersuchung angestellt gezielte Proteomik, Transkriptomik und rechnerische Modelli...

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Diskussion

Absolute Proteinquantifizierung ist für ein sehr breites Spektrum von biomedizinischen Anwendungen, wie Biomarker-Validierung und Signaltransduktionsweg Modellierung. Vor kurzem hat gezielte Proteomik mit LC-SRM von Verbesserungen an zahlreichen Technologien, einschließlich Peptidstandardpräparat, HPLC, QqQ-MS und LC-SRM Datenanalyse profitiert. Folglich ist es eine leistungsfähige Alternative zu Immunoassays. Immunoassays können extrem empfindlich und Hochdurchsatz, aber die Entwicklung einer robusten Immuntest kann se...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program des NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acetonitril (ACN), LC-MS-QualitätFisherA955-1
BCA (Bicinchoninsäure) Protein-Assay-KitFisher23235
Kügelchen zum Bead-Beating, Zirkonoxid-Siliziumdioxid, 0,1 mmBioSpec Products11079101z
BestatinhydrochloridSigmaB8385-10MG
Zellkultur DMEM (mit Glukose, ohne L-Glutamin)Lonza12-614F
Zellkultur EDTA, 500 mM, pH8Gibco15575
Zellkultur fötales Rinderserum (FBS)Atlanta BiologicalsS11550
Zellkultur L-GlutaminSigmaG8540-25G
Zellkultur Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4Gibco10010-049
Zellkultur Trypanblau Viabilitätsfärbung, 0,4 % w/vLonza17-942E
Cellometer Auto T4 ZellzählerNexcelom BioscienceCellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 Einweg-ZählkammernNexcelom BioscienceCHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545-5G
Ameisensäure, LC-MS-Qualität, AmpullenFisherA117-10X1AMP
Hämozytometer, Neubauer-verbessert, 0,1 mm tiefMarienfeld-Superior0640030
HEPES, 1 m, pH 7,2Mediatech25-060-CI
Salzsäure, 37 % w/wVWRBDH3028-2.5LG
IodacetamidSigmaI1149-5G
Laserbasierter MikropipettenabzieherSutter Instrument Co.P-2000
LC beschichtete Silica-Kapillare, 50 & Mikro; m idPolymicro Technologies1068150017
LC Fläschchen, Autosampler, 12 mm x 32 mm PolypropylenSUN SRI200-268
LC Fläschchen mit Schraubverschluss, Autosampler, vorgeschlitzt PTFE/SilikonSUN SRI500-061
Luziferase, von Photinus pyralisSigmaL9506-1MG
Pepstatin AEMD Millipore516481-25MG
pH-Streifen colorpHast (pH 0,0-6,0)EMD Chemicals9586-1
PhosStop Phosphatase-Inhibitor-CocktailRoche04906837001
RapiGest SFWaters186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg KartuscheWässerWAT023590
Sep-Pak SPE, Extraktionsverteiler, 20Positionen WatersWAT200609
Sep-Pak SPE, Gummikugel mit flacher OberflächeFisher03-448-25
Natriumhydroxid (NaOH)FisherS318-500
SpeedVac VakuumkonzentratorFisherSPD111V
Trifluoressigsäure (TFA), LC-MS QualitätFisherA116-50
Trypsin, Sequenzierqualität, modifiziertPromegaV5113
Röhrchen Decapper für Micronic RöhrchenUSA Scientific1765-4000
Röhrchen, 2 ml Mikrozentrifuge, O-Ring Schraubverschluss, sterilSarstedt72.694.006
UreaSigmaU0631-500g
Wasser, LC-MS QualitätFisherW6-1

Referenzen

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