Methodenartikel

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen Drosophila Embryos

DOI:

10.3791/52985

⸱

10. September 2015

 ,  ,  ,  , 
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, die zelltypspezifische Translation von mRNA zu erfassen. Hier berichten wir über das erste TRAP-Protokoll, das sich der Isolierung von mRNA in seltenen Zellpopulationen von Drosophila-Embryonen widmet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Messung des Niveaus von mRNAs während des Translationsprozesses in einzelnen Zellen liefert Informationen über die Proteine, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an zellulären Funktionen beteiligt sind. Das Protokoll mit dem Namen Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, diesen mRNA-Translationsprozess auf zelltypspezifische Weise zu erfassen. Basierend auf der Affinitätsreinigung von Polysomen, die eine markierte ribosomale Untereinheit tragen, kann TRAP für Translatomanalysen in einzelnen Zellen eingesetzt werden, wodurch es möglich ist, Zelltypen im Verlauf von Entwicklungsprozessen zu vergleichen oder den Fortschritt der Krankheitsentwicklung und die Auswirkungen potenzieller Therapien auf molekularer Ebene zu verfolgen. Hier berichten wir über eine optimierte Version des TRAP-Protokolls, genannt TRAP-rc (rare cells), die sich der Identifizierung von in der Translation engagierten RNAs aus seltenen Zellpopulationen widmet. TRAP-rc wurde unter Verwendung des Gal4/UAS-Targeting-Systems in einer begrenzten Population von Muskelzellen in Drosophila-Embryonen validiert. Dieses neuartige Protokoll ermöglicht die Rückgewinnung von zelltypspezifischer RNA in ausreichenden Mengen für die globale Genexpressionsanalytik wie Microarrays oder RNA-seq. Die Robustheit des Protokolls und die großen Sammlungen von Gal4-Treibern machen TRAP-rc zu einem äußerst vielseitigen Ansatz mit potenziellen Anwendungen in zellspezifischen genomweiten Studien.

Einleitung

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Zu verstehen, wie Zellen während der Entwicklung bestimmte Eigenschaften zu erwerben, ist, um die Komplexität der Organe und deren potenzielle Entwicklung hin zu pathologischen Bedingungen zu schätzen wissen von entscheidender Bedeutung. Es gibt einen großen Forschungs Push, um die Gen-regulatorischen Netzwerke, die das Zell Spezifizierung und Differenzierung zugrunde liegen durch unrevealing globalen Genexpressionsprofile zu entziffern, Pol II bindenden Status, Transkriptionsfaktor-Belegung am regulatorischen Sequenzen bzw. post-translationale Modifikationen von Histonen.

Um die Genexpression auf globaler Ebene Microarrays zu bewerten und RNA-seq Ansätze verwendet. Microarrays erlauben, mRNA-Häufigkeit zu erkennen, während RNA-seq ist besser auf die Information über die verschiedenen Arten von RNAs einschließlich codierenden und nichtcodierenden RNAs wie microRNAs, lncRNAs oder snRNAs. Jedoch können diese Techniken nicht zu unterscheiden aktiv transkribierten, stationären mRNA aktiv umsetze mRNA und mRNA in die Abbauprozess. Mess stationären staß mRNA-Spiegel ist bekannt, dass eine schlechte Schätzung des Proteoms Zusammensetzung 1-3 sein. Im Gegenteil, die Identifizierung aktiv-Übersetzung von mRNA ergibt ein genaueres Bild der Proteinproduktion.

Allerdings transkriptomischen Studien vor allem auf ganze Organismus Ebene durch den Vergleich Gewinn oder Verlust der Funktion eines bestimmten Faktor zu Wildtyp-Zustand 4-7 oder seziert Gewebe, so dass Genexpressionsprofile schwer zu interpretieren geführt worden. Jüngste Fortschritte in der Zell-Targeting-Tools, Affinitätsreinigung und Empfindlichkeit Verbesserungen erlauben jetzt ausführen genomweiten Analysen zu kleinen Zellpopulationen oder sogar einzelne Zellen in einem lebenden Organismus.

In Drosophila, große Sammlungen von transgenen Linien ermöglichen es, bestimmte zeitliche und räumliche Ausrichtung der verschiedenen Geweben und Zellpopulationen über den GAL4 / UAS-System 8-10 wodurch genauere Quantifizierung der molekularen Mechanismen für die Zellfunktion notwendig.

Unter neu entwickelten Ansätze Polysom ​​Profilierung durch Fraktionierung wurde als ein Weg, um zu erfassen aktiv-Übersetzung RNA 11 beschrieben. Diese Methode basiert auf Sucrosegradientenzentrifugation ermöglicht die Auswahl der Polysomen-Fraktion und Bestimmung von mRNA übersetzt genomweite, wenn sie mit Microarrays oder tiefe Sequenzierung analysiert. Polysom ​​Isolation kann mit Nucleaseverdau um ribosomale Fußabdrücke entsprechenden RNA-Fragmente durch die Ribosomen während des Übersetzungsprozesses 12 geschützt identifizieren gekoppelt werden. Ribosomalen Footprinting erhöht die Genauigkeit der Quantifizierung der RNA-Translation und RNA-Sequenzlevel Auflösung und Ribosom Positionierung ermöglicht es, Translationsrate zu messen. Jedoch ist es bis heute nicht zellspezifische Isolierung translatomes aufgebracht worden ist, vor allem aufgrund der starken Abnahme der RNA-Ausbeute am Ende des Ribosoms Footprinting Verfahren erhalten. Da die Größenauswahl der RNA kann potenzielle Falsch p zu erzeugenositives aus verschiedenen RNPs, die auch sein könnte Schutz RNA auf ähnliche Weise werden weitere Entwicklungen notwendig, um ribosomale Fußabdruck zu verbessern und ihre Anpassung an zellspezifische Ansätze.

Eines dieser Verfahren, die so genannte Translating Ribosom Affinitätsreinigung (TRAP) wurde im Jahr 2008 von Heiman et al. und auf die translatome aus einer Untergruppe von Neuronen bei Mäusen zu isolieren. Durch Epitop-Markierung des ribosomalen Proteins in einem zelltypspezifischen Weise kann Polysomen selektiv ohne den mühsamen Schritt der Zelldissoziation und Sortierung gereinigt werden. In diesem Fall wurde die 60S ribosomale Protein L10a an der Oberfläche des Ribosoms mit eGFP 13 markiert. Seit 2008 haben mehrere Studien diese Methode in verschiedenen Arten verwendet werden, die von Mäusen 14-19 bis X laevis 20,21, Zebrafisch 22,23 und Arabidopsis thaliana 24. Die TRAP-Methode wurde auch auf die Drosophila-Modell angepasst und verwendet nach Purify Zelltyp-spezifischen mRNAs von neuronalen Zellen 25 und 26 Astrozyten. Die vielseitige binären GAL4 / UAS-System wurde verwendet, um die GFP-markierten RpL10A in einer gewebespezifischen Weise exprimieren. Leiter der erwachsenen Fliegen wurden seziert, um Polysom ​​Auswahl aus neuronalen Zellen (von pan-neuronalen Elav-Gal4-Treiber gezielte) und isolierten RNAs durchzuführen, wurden sequenziert. Die große Zahl der hochregulierten Genen entsprachen denen bekannt ist, im Nervensystem exprimiert werden, was darauf hinweist, dass der Ansatz eine gute Spezifität und uns eingibt, um es in seltenen Zellpopulationen anzupassen (weniger als 1% der Zellen) vorhanden entwickeln Drosophila-Embryonen .

Innerhalb der Drosophila-Modell ist das Embryonalstadium ein Modell der Wahl für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, wie die molekularen Akteure und Gestaltungsbewegungen sind evolutionär konserviert. Die einzigen Gewebe-spezifische transkriptomischen Ansätze bisher in diesem Modell durchgeführt wurden unter Verwendung von Zellen oder Kern sorting und haben nur einen stabilen Zustand für Transkriptom 27-31 Studie nachgewiesen, wodurch ein Bedarf für Verfahren, um Gewebe / Zell-spezifische translatome Profilierungsfliegenembryo gewidmet. Hier haben wir die erste TRAP-Protokoll, um Drosophila-Embryos gewidmet melden. Mit diesem Verfahren Eingriff-in-Übersetzung mRNA in einer sehr begrenzten Zellpopulation von etwa 100 Muskelzellen pro Embryo wurde erfolgreich mit hoher Qualität und Spezifität isoliert. Der binäre GAL4 / UAS-System wird verwendet, um die Expression von GFP-markierten RpL10A in Subpopulation von Muskeln ohne Toxizität zu fahren, da keine scheinbare Phänotypen oder Entwicklungsverzögerung zuvor. 25 gezeigt Drosophila-Embryos besitzen 30 Muskeln pro hemisegment, die Anlass zu der Muskulatur geben der Larve. Durch Verwendung einer regulatorischen Region in der Nähe der Niete Identität Gen entdeckt, 6 der 30 mehrkernigen Muskeln, werden angezeigt. In diesem Test werden die Ribosomen auf der mRNA unter Verwendung des immobilisierten TranslationselongationInhibitor Cycloheximid. Cytosolische Extrakte werden dann zur Affinitätsreinigung mit GFP Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen verwendet. Qualität der gereinigten RNA wurde unter Verwendung Bioanalyzer validiert. Quantitative reverse Transkriptions-PCR (RT-qPCR) wurde verwendet, um die Spezifität und Empfindlichkeit der Isolierung der mRNA zu bestimmen, und gezeigt, dass unsere verbesserte Protokoll ist sehr effizient.

Protokoll

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1. Fliegenschnur Erstellung

  1. Generieren Sie zwei verschiedene Konstrukte. In dem ersten Konstrukt wird RpL10A cDNA (ribosomale Protein-Untereinheit L10a) stromabwärts von GFP kloniert in pUASP-PL-GFP-Nter Plasmid (modifizierte Version von 32). Die Verwendung einer Keimbahn-Promotor erlaubt eine polyvalente Nutzung der transgenen Linie.
    ANMERKUNG: Beziehen Sie das zweite Konstrukt durch Klonierung des regulatorischen Sequenz Fahrgewebespezifische Expression des slouch Gen stromaufwärts von GAL4 (TF) mit pPTGAL4 Plasmid.
  2. Injizieren Plasmide getrennt in w 1118 Fliegen und legen Konstrukte in-the-fly-Genom durch P-Element-Insertion (nach Standard-Verfahren) 33.
  3. Wählen Sie Trans um Fliegenlinien mit Konstrukten auf zwei verschiedenen Chromosomen erholen. Die endgültige TRAP Linie wird durch die Kombination dieser beiden Linien (genetische Kreuze), um ein Doppel-transgenen stabile Linie zu bekommen erstellt. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massiv verstärken diese Linie und sammeln Sie die gewünschten inszeniert Embryonen.

2. Embryonen

  1. Bereiten Sie 8 große zylindrische Bevölkerung Käfige mit jeweils etwa 40 g junger Fliegen pro Käfig (rund 180.000 Fliegen / Käfig).
  2. Fahren Sie mit dem so genannten Pre-Lays, die Fliegen zu entwickelnden Embryonen aus ihren Eileitern löschen lassen. Dafür lag die Fliegen für 1 Stunde auf zwei 11 cm-Durchmesser Petrischalen, die eine Mischung aus erstarrtem Agar und Traubensaft und decken ⅓ der Oberfläche mit frisch zubereiteten Hefepaste. Nach 3 Austausch von Traubensaft Platten sammeln die realen Embryos auf ähnliche frisch zubereiteten Platten.
    Hinweis: Die Inkubationszeit wird nach Entwicklungszeitfenster untersucht variieren.
  3. Platten entfernen von Käfigen und lassen Sie sie bei der gleichen Temperatur für den Zeitaufwand für die richtige Entwicklungsstufe (zB 3 Stunden der Eiablage + 10 h addit erhaltenional Inkubation erhält man Embryonen aus Stadium 10 bis 13 Stunden nach der Eiablage (AEL)). Resuspendieren Platte Inhalt (Embryonen, Hefepaste, tote Fliegen) mit 50 ml Wasser mit einer Bürste.
  4. Gehen durch eine Reihe von Sieben (700 & mgr; m, 355 & mgr; m, 112 & mgr; m) Embryonen aus toten Fliegen und restlichen Körperteilen zu trennen und sammeln Embryonen auf dem kleinerem Durchmesser Sieb zurückgehalten, dann kurz waschen in VE-Wasser. Verwenden Sie nicht mehr als 18 Platten pro Sammlung, wie es die Siebe verstopfen.
  5. Dechorionate Embryonen in 4,5% Bleichmittel in VE-Wasser für 2 Minuten und gründlich mit VE-Wasser für 30-60 Sekunden. Inkubieren Embryonen in PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml Cycloheximid für 5-10 min bei RT unter Rühren.
  6. Trockener Embryonen auf Celluloseabsorptionslagen und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen. Wiegen Sie die Rohre und Flash-Einfrieren der Embryonen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff. In diesem Stadium können die getrockneten Embryonen für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden.
3. Vorbereitung der Magnetic Beads bis GFP Antikörper gebunden

  1. Gründlich resuspendieren Protein G magnetischen Kügelchen in der Originalflasche durch leichtes Schütteln.
  2. Transfer 90 ul von Perlen auf ein RNase-freies Rohr und sammeln sie auf einem Magneten (30-60 sec). 90 ul Perlen notwendig ist, Immunpräzipitation (IP) mit 1 ml Lysat, 60-80 mg / mL Proteine ​​führen. Respektieren Verhältnisse zu Wulst Sättigung zu verhindern. Verwenden mehrere Rohre nach Proteinmenge.
  3. Wash Perlen mit 1 x PBS 0,01% Tween 20 (500 ul) und sammeln Perlen auf dem Magneten, um Überstand verwerfen. Werden 30 ug des GFP-Antikörper in 350 ul PBS 0,01% Tween 20 auf die Kügelchen und Inkubation bei langsamen Kopfüber-Mischung für 30 min bei RT.
  4. Sammeln Perlen auf dem Magneten (30-60 sec), Überstand verwerfen und gründlich in 500 ul Extraktionspuffer Polysomen (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl 2 5 mM, DTT 0,5 mM Triton 1%, Cycloheximid 100 ug / ml , Protease Inhibitor 1 ×, RNase-Inhibitor 100 U).
  5. Sammle Perlen auf dem Magneten und fügen Sie 500 ul Blockierungspuffer (BSA 0,1 ug / ul, Hefe-tRNA 0,1 ug / ul, Glykogen 0,1 ug / ul in Polysom ​​Extraktionspuffer).
  6. Inkubation für 30 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Blockierungspuffer.
  7. Sammle Perlen auf dem Magneten und spülen in 500 ul Polysom ​​Extraktionspuffer, dann erinnern Perlen und gehen sofort in den Immun Schritt (Abschnitt 6).

4. Lysatherstellung

  1. Bevor Sie beginnen, das Programm einzurichten auf der multidirektionale schnelle Geschwindigkeit Perlen Grinder: 2 x 10 sec bei 5000 Umdrehungen pro Minute, 15 Sekunden Pause. Transfer getrockneten Embryonen (1,5 g), um 15 ml Röhrchen auf Eis enthält Polysom ​​Extraktionspuffer vorgekühlt, und homogenisieren sofort. Homogenisieren 1,5 g Embryonen in 4 ml Extraktionspuffer Polysomen.
  2. Spread homogenisiert Embryonen in zwei vorgekühlt 2 ml-Röhrchen und schleifen die embryos, indem Sie den Homogenisator Programm. Übertragen Sie das Lysat in frische vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und bereiten eine postnukleäre Stand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 2000 g.
  3. Überstand in ein frisches vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, fügen 1/100 Probenvolumen von 10% Nonidet P-40 zu dem Überstand (Endkonzentration = 0,1%), und mischen Sie sie vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens.
  4. Puls Zentrifuge die Probe in einer Minifuge um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln, fügen 1/9 Probenvolumen von 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (DHPC) (Endkonzentration = 30 mM ), mischen Sie es vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens, und Inkubation der Mischung auf Eis für 5 min (Mischung durch mehrmaliges Wenden während der Inkubation).
  5. Vorbereitung der post-mitochondrialer Überstand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 Minuten bei 20.000 g. Messung der Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode: Konzentration im Lysat sollte zwischen 60-80 mg / ml sein. Take den Überstand in ein frisches neues vorgekühltem Mikrozentrifugenröhrchen und gehen sofort in den Pre-Absorptionsstufe (Abschnitt 5).

5. Pre-Absorption

  1. Die Magnetperlen gründlich durch vorsichtiges Schütteln resuspendieren und Transfer 30 ul Kügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur (30 & mgr; l Perlen / 1 ml embryonalen Lysat).
  2. Sammle Perlen auf dem Magneten, einer Pipette aus dem Überstand und resuspendieren die Perlen in Polysom ​​Extraktionspuffer (500 ul). Sammle Perlen auf dem Magneten, fügen embryonalen Lysat, und Inkubation für 1 h bei 4 ° C auf einem Rotator.
    1. Perlen bringen und Überstand auf Eis zur Immun Schritt. Vor Immun, halten 100 ul Überstand (Eingang) zur globalen RNA-Probe mit der RNA-Probe, nachdem Immun gesammelt, durch RT-qPCR zum Beispiel zu vergleichen.

6. Immunreinigung

  1. 1 ml (entspricht 60-80 mg / ml Protein)pre-absorbiert Lysats auf ein RNase-freies Röhrchen mit 90 ul blockierter Perlen GFP-Antikörper gekoppelt ist. Inkubieren der Proben bei 4 ° C für 2 Stunden unter leichtem end-over-end Mischen in einem Rohrdrehgelenk. Alternativ führen die Inkubation O / N bei 4 ° C.
  2. Nach der Inkubation, sammeln Perlen auf dem Magneten. Verwenden Sie einen Minifuge sich zu drehen, die Perlen, so resuspendieren sie in 500 ul Waschpuffer (Hepes 10 mM, KCl 350mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1% DTT 0,5 mM, Cycloheximid 100 ug / ml, RNase-Inhibitor 100 U ) und sammeln sie auf dem Magneten. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal.
  3. Ändern Sie die Perlen auf eine neue vorgekühltem RNase-freies Rohr und zwei Mal waschen. Sammle Perlen auf einem Magneten und zur RNA-Extraktion durch Zugabe von 1 ml Trizol direkt an die Beads und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.

7. RNA Sanierung und Qualitätsbewertung

  1. Verwenden Sie eine RNeasy Micro Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Bei Fertigstellung Elute-RNA mit (x) & mgr; l RNase-freies Wasser. Warm für 2 min bei 60 ° C, und speichern schockgefroren Proben bei -80 ° C. Überprüfen RNA-Qualität mit Bioanalyzer (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers).
  2. Um die Spezifität des Traped RNA zu testen, führen die reverse Transkription von 3 ng gereinigte RNA (Ein- und IP) nach den Anweisungen des Herstellers (hochgestellte III). Verwenden Sie das für die qPCR mit Gen-spezifischen Primer-Sets erhalten cDNA.

Ergebnisse

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Die Drosophila embryonalen somatischen Muskulatur wird von 30 Muskeln pro hemisegment zusammengesetzt, und jeder Muskel hat einen bestimmten Satz von Eigenschaften: Codeidentitätsgene, Position, Anzahl der Fusionsereignisse, Befestigungsstellen und Innervation. Identifizieren übersetzt mRNA in einer bestimmten Muskeluntergruppe geben Informationen über die erforderlich ist, um diese spezifische Muskel Eigenschaften bilden Proteine. Verwenden des TRAP-basierte Verfahren, RNA aus einer Subpopulation von Muskeln, die Identität Gen slouch exprimiert, wurde gereinigt (1A-B). Ein wichtiges Anliegen für diesen Ansatz ist die Qualität und die Spezifität der isolierten RNA. Die optimierte Protokoll hier berichteten aktiviert systematische Verwertung von hochwertigen RNA mit Bioanalyzer-Analyse beurteilt. Die erhaltenen Profil zeigt keinen Abbau von RNA (Abbildung 1c).

In anderen Studien in der Trap-Verfahren entwickelt wurden Fragen über die Spezifität der Daten erhöht. Here we imü ssen die Methode zum Hintergrund nicht-spezifischer Bindung der RNA an die Kügelchen oder die Rohre und durch die Optimierung des Waschpuffers verbunden drücken. Um die Hintergrundebene und Effizienz der Isolierung slouch-exprimierenden Zellen zu bewerten, führten wir RT-qPCR-Studien auf 3 Wiederholungen des gleichen embryonalen Stadium. Fold-Anreicherungen von 4 verschiedenen Genen (MEF2, slouch, Prospero, soxNeuro) wurden im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gen (1D) berechnet. Diese Ergebnisse zeigten, 2,3-fache Anreicherung der pan-Muskelgens MEF2 und 5,6-fache Anreicherung der slouch Gens. Dagegen sind die beiden Gene in das Nervensystem exprimiert wurden, verglichen mit abgereichertem Eingang. Sehr ähnlich fache Änderung Werte wurden auf 3 biologischen Replikaten beobachtet, was zeigt, dass das Protokoll ist robust. Mit Slouch-Gal4-Treiber und ausgehend von 1,5 g, rund 1,5x10 ^ 6 Embryonen wurden gewonnen, die 100 GFP Zellen / Embryos (insgesamt 150 x 10 ^ 6 positive enthaltenZellen).

Nach dem Ausführen des TRAP Experiment ist die Ausbeute in der Umgebung von 25 bis 45 ng spezifische RNA je auf der Bühne von Interesse. Dieses Material ist genug, um Microarray-Analyse oder RNA-seq Verwendung eines Amplifikationsprotokoll um ein RNA-seq-Bibliothek zu erstellen ausführen. Effizienz wird stark von der Stärke der verwendet wird, um RpL10A-EGFP exprimieren Treiber abhängen.

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Abbildung 1. Qualität und Spezifität Beurteilung der TRAP-isolierte RNA aus Slouch-GAL4> UASRpL10A-EGFP Embryonen.

(AB) Konfokale Bilder von einem Stadium 16-Embryo, welches RpL10A-EGFP-Expression spezifisch in den sechs Slouch Muskelzellen pro hemisegment (A). Co-Lokalisation von RpL10A-EGFP mit dem allgemeinen Muskelmarkierung Beta3tubulin auf Merge-Bild (B) beobachtet. (C) Qualitätskontrolle von RNA Traped ran auf Bioanalyzer zeigt perfekte Integrität rRNA 18S und 28S. (D) RT-qPCR-Analyse, die hohe Spezifität der TRAP-isolierte mRNA Experimente an biologischen 3 Wiederholungen der Stufe-16-Embryonen. Falten Änderung im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gens berechnet. In allen Muskelabstammungslinien vorhanden MEF2 Transkripte sind 2,3-fach angereicherte im Vergleich zum Eingang der Erwägung, dass mehr eingeschränkt slouch Transkripte sind 5,6-fach angereicherte. Nervenzellen prospero ausdrücken und soxN Gene sind erschöpft 2,2-fach und 5,5-fach auf. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

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Dieses Papier beschreibt eine modifizierte Translating Ribosom Affinitätsreinigung Protokoll (genannt "TRAP-rc ') auf die Untersuchung von seltenen Zellpopulationen in Drosophila-Embryos gewidmet. Informationen über die wesentlichen Schritte für eine erfolgreiche Isolierung von spezifischen RNA mit einer Ausbeute geeignet für Microarray-oder RNA-seq-Analyse, dh 1) Menge an biologischem Material erforderlich ist und optimierte Verfahren für die Embryo-Lyse und Polysom ​​Extraktion bereitgestellt; 2) Perlen / Antikörper-to-Lysat Verhältnissen für eine optimale Immunfällung; 3) die Schritte ermöglicht Reduzierung der Hintergrund einschließlich Waschpuffer-Zusammensetzung, um TRAP-rc Experimente mit hoher Spezifität und Sensitivität geführt.

Dieses Protokoll liefert reproduzierbare Daten macht es leicht auf andere Zelltypen verwendet. Diese Technik ermöglicht es, differentiellen Genexpression auf der Ebene der aktiv-Übersetzung von mRNA zu analysieren und damit den Weg zum Verständnis der Proteinexpression in einer spec ific Zelltyp in einem bestimmten Zeitfenster. Man beachte jedoch, dass Proteinmenge wird auf die Geschwindigkeit der Übersetzung und Abbauprozesse abhängen. Eine Hauptbeschränkung der Trap-Verfahren ist die Unfähigkeit, Proteingehalt in einer genauen quantitativ zu messen oder posttranslationale Modifikation detektieren. Verbesserung der Quantifizierung durch Messung Ribosom Dichte entlang der mRNA Körper und, damit, in einem zelltypspezifische Weise können TRAP kombiniert mit Ribosomen-Footprinting ein sehr leistungsfähiges Werkzeug zu machen. In einer aktuellen Arbeit 34 wurde diese Verbindung in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen durchgeführt. Die Autoren lief Nuklease Footprinting, gefolgt von Affinitätsreinigung eines induzierbaren biotinylierten Form RpL10A mit Streptavidin-Kügelchen. Dies ist ein Beweis für das Prinzip, daß es möglich ist, Ribosom-Footprinting in einem gesamten Organismus durchzuführen, während Targeting eines spezifischen Zelltyps, die Begrenzung wobei die Menge des biologischen Materials zum Zwecke erforderlich.

"> Darstellende TRAP Experimenten parallel globale Transkriptom Analysen ermöglichen es, Proportionen zwischen neu transkribiert und actively- übersetzen RNA. Diese wird tief informative der potenziellen posttranskriptionale Mechanismen, die sich in spezifischen Entwicklungszusammenhängen oder spezifischer Zellpopulationen sein verfolgen -durch microRNAs zum Beispiel.

Zusammenfassend ist TRAP eine hoch effiziente, spezifische und sensitive Methode zur Identifizierung RNAs aktiv umsetze Ribosomen in einer zellspezifischen Weise gebunden. Dieses Verfahren kann in einer breiten Vielfalt von Organismen und Gewebetypen verwendet werden. Das hier beschriebene neue TRAP-rc-Protokoll wurde für seltene Zellpopulationen (weniger als 1% der Gesamtzellzahl) und für eine Menge von Endmaterial ausreichend für spätere Analysen bei Gesamtgenom-Niveau optimiert.

Eine mögliche Einschränkung dieses Verfahrens ist das Erfordernis einer starken Treiber, den markierten Ribosomen in ausreichender Menge zu produzieren, um compete mit endogenen untagged diejenigen in der Zielzelltyp. In einer neueren Studie 25. geschätzten Autoren zu 10-30% das Verhältnis von markierten gegen unmarkierte Ribosomen.

Um dieses Problem zu steigenden UAS-RpL10A-EGFP Kopienzahl sollte dieses Gleichgewicht deutlich verbessern zu überwinden. Alternativ, zusätzlich zu den beschriebenen genetischen Hintergrund ein UAS-GAL4-Transgens wird die Produktion von GAL4-Protein zu verstärken und die Expression von RpL10A-EGFP indirekt zu erhöhen. Dies sollte eine bessere Auslastung von markierten Ribosomen auf mRNA begünstigen.

Beachten Sie, dass dies bereits effizienten Ansatz kann noch leistungsfähiger durch Anpassung komplementäre Methoden, um einen quantitativen Aspekt zu bringen oder zu entdecken und zu entwirren, die molekularen Mechanismen, die für die Genexpression Kontrolle vorgenommen werden.

Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die Autoren danken Nicolas Allegre, Maud Peyny und Jean-Philippe Da Ponte für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), das INSERM Starting Grant, das ANR ID-CELL-SPE Stipendium, das Equipe FRM und das AFM 15845 Stipendium

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HEPESSigma H4034-1006
1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin Avanti Polar Lipids850306P
Glykogenthermo wissenschaftlich R0561
Gereinigtes BSA 100X BiolabsB9001
Hefe tRNA SigmaR5636
Super RNase In AmbionAM2694
Antikörper GFP-Klon N86/38UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antikörper Incorporated75-132 
Nonidet P40 Roche11754595001
Precellys 24 Lyse-Homogenisierung Bertin Technology
Nukleasefreies Wasser Nalgene
Dynabeads ProteinGInvitrogen10004D
Kaliumchlorid (KCl)Angewandtes Biosystem 
Magnesiumchlorid (MgCl2) Angewandtes Biosystem 
Zellulosewatte, ungebleicht VWR115-2597 
Siebe 112, 355, 710 um Retsch
TRiZol Invitrogen15596-018
MagRack 6GE HealthCare
Filterspitzen mit geringer Bindung ClearLine
Rnase freie Tube 1,5 ml ClearLine390689DD
Tween 20 Fischer Bioreagenz BP337-500
Cycloheximid Sigma C1985
Proteasehemmer Tabletten, Mini-Complete, EDTA-frei Roche11836170001
AM96406AM9530628948964

Referenzen

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