Beobachtung der Flimmerbewegung von Plexus Epithelzellen Ex Vivo

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde eine detaillierte lichtmikroskopische Technik für die Echtzeitbeobachtung und -analyse der Bewegung von CPEC-Zilien ex vivo zusammen mit einer elektronenmikroskopischen Methode zur Ultrastrukturanalyse optimiert.

Zusammenfassung

Der Plexus choroideus befindet sich in der Ventrikelwand des Gehirns, von dessen Hauptfunktion angenommen wird, dass die Produktion von Liquor cerebrospinalis ist. Epithelzellen des Plexus choroideus (CPECs), die die Oberfläche des Gewebes des Plexus choroideus bedecken, beherbergen mehrere einzigartige Zilien, aber die meisten Funktionen dieser Zilien müssen noch untersucht werden. Um die Funktion der CPEC-Zilien unter besonderer Berücksichtigung ihrer Motilität aufzudecken, wurde ein ex vivo Beobachtungssystem entwickelt, um die Ziliarmotilität während der embryonalen, perinatalen und postnatalen Periode zu überwachen. Der Plexus choroideus wurde aus der Hirnkammer präpariert und unter einem videoverstärkten Kontrastmikroskop betrachtet, das mit einer differentiellen Interferenzkontrastoptik ausgestattet war. Unter dieser Bedingung wurde eine einfache und quantitative Methode entwickelt, um die beweglichen Profile von CPEC-Zilien über mehrere Stunden ex vivo zu analysieren. Anschließend wurden die morphologischen Veränderungen der Zilien während der Entwicklung mittels Rasterelektronenmikroskopie beobachtet, um den Zusammenhang zwischen der morphologischen Reife der Zilien und der Motilität aufzuklären. Interessanterweise konnte diese Methode Veränderungen in der Anzahl und Länge der Zilien beschreiben, die am postnatalen Tag (P) 2 ihren Höhepunkt erreichten, während die Schlagfrequenz bei P10 ein Maximum erreichte, gefolgt von einem abrupten Abbruch bei P14. Diese Techniken werden es ermöglichen, die Funktionen von Zilien in verschiedenen Geweben aufzuklären. Während verwandte Techniken in einem früheren Bericht¹ veröffentlicht wurden, konzentriert sich die aktuelle Studie auf detaillierte Techniken zur Beobachtung der Motilität und Morphologie von CPEC-Zilien ex vivo.

Einleitung

Zilien sind haarähnliche Vorsprünge auf der Oberfläche der meisten Wirbeltierzellen, die von medizinischen Forschern wegen einer Klasse von Krankheiten, die als Ziliopathien^2–4 bezeichnet werden, Aufmerksamkeit erregt haben. Trotz der allgegenwärtigen Expression der Organelle wurde über eine Vielzahl von Ziliarfunktionen berichtet, einschließlich Motilität und Biosensorik. Zum Beispiel transportieren bewegliche Flimmerhärchen auf der mukoepithelialen Oberfläche Schleim⁵ und Epitheltrümmer zum Ausgang der Bahnen und verhindern so Krankheiten, indem sie die Oberfläche von Epithelien befreien. Darüber hinaus regulieren Zilien in frühen Entwicklungsphasen und embryonalen Stadien die Proliferation von Stammzellen⁶ und sind an der Bestimmung der Links-Rechts-Asymmetrie des Wirbeltierkörpers beteiligt⁷.

Epithelzellen des Plexus choroideus (CPECs) sind Derivate von Neuroepithelzellen, die die Oberfläche des Gewebes des Plexus choroideus im Gehirn bedecken und durch die Produktion von Liquor cerebrospinalis (CSF) eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der intrakraniellen Umgebung spielen. Es wurde bereits gezeigt, dass CPECs mehrere unbewegliche Zilien haben, die die Produktion von Liquor über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren regulieren, die spezifisch auf die Zilien konzentriert sind⁸. Obwohl diese Zilien als ruhende, unbewegliche Zilien angesehen wurden, wurde festgestellt, dass einige CPEC-Zilien während der Neugeborenenperiode eine vorübergehende Motilität aufweisen¹. Diese Erkenntnis war sehr wichtig, da sie zeigte, dass sogenannte nicht-bewegliche Zilien nicht unbedingt von Beginn der Entwicklung an unbeweglich sind und in bestimmten Zeitfenstern eine vorübergehende Motilität aufweisen können, möglicherweise als Reaktion auf spezifische physiologische Anforderungen und Funktionen⁹. Um die bewegliche Natur von CPEC-Zilien genau zu beschreiben, ist es notwendig, ein ex vivo-Beobachtungssystem zu entwickeln, das die Analyse der für CPEC-Zilien einzigartigen kinetischen Profile umfasst.

In Bezug auf die Motilität sind zwar mehrere technische Berichte Beobachtungen der beweglichen Zilien des Trachealepithels^5,10, der beweglichen einzelligen Flagellen¹¹, der sogenannten konventionellen beweglichen Zilien¹² und der nodalen Zilien¹³ beschrieben worden, aber detaillierte Analysemethoden, die auf relativ gewellte Strukturen wie den Plexus choroideus anwendbar sind, sind bisher nicht gut dokumentiert. Darüber hinaus ist eine hohe Zeitauflösung erforderlich, um die Ziliarbewegung von CPECs zu analysieren, bei der teure Hochgeschwindigkeitskameras unabdingbar sind. Um diese Notwendigkeit zu umgehen und die Überwachung der ziliären Motilität verschiedener Zelltypen zu vereinfachen, wurde eine kostengünstige Hochgeschwindigkeitskamera eingeführt und eine leicht zugängliche und bequeme Methode zur Aufzeichnung der Motilität beweglicher Zilien^entwickelt, insbesondere zur Beschreibung der Geschwindigkeit und des Bewegungsmusters jedes Ziliums. Darüber hinaus wurde hier die originale Bildanalysesoftware "TI Workbench" verwendet, um eine detaillierte Analyse der Motilität zu ermöglichen. Insgesamt bietet diese Methode eine neue, prägnante Strategie zur Analyse der Ziliarbewegung zusammen mit der korrelativen Rasterelektronenmikroskopie (REM), die in einem breiten Spektrum der Ziliumforschung eingesetzt werden kann.

Protokoll

Die Protokolle und die Verwendung von Versuchstieren wurden von den institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüsse an der University of Yamanashi und Waseda University zugelassen. Tierpflege wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. CPEC Vorbereitung

1. Bereiten Sie die folgenden Vorrichtungen und Materialien: ein Stereo-Mikroskop, vorzugsweise geeignet zur Übertragung von Beleuchtung von unten; ein Paar von Uhrmacher Pinzette (Dumont # 3 oder # 4), flammsterilisiert, gerade Betriebs Schere, flamm sterilisiert; zwei sterile 10 cm Plastikschalen mit 20 ml eiskaltem Leibovitz L-15-Medium; 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml RT Leibovitz L-15-Medium; ein 100 ml Becherglas, das 70% Ethanol; neonatalen Maus Welpen.
2. Kurz eintauchen eine neonatale Maus in 70% Ethanol und schnell einschläfern durch Enthauptung mit dem Betriebs Schere.
3. Platzieren Sie den Kopf sofort in eiskaltem Leibovitz L-15-Medium in das sterile 10 cm dish.
4. Entfernen Sie die Haut von den Schädeldecke mit Hilfe der beiden Uhrmacher Zangen, schnitt den Schädel, um das Gehirn freizulegen, und dann schneiden Sie die Hirnnerven, die ganze Gehirn zu isolieren.
5. Übertragen Sie das Gehirn zu einem neuen Schale mit eiskaltem Leibovitz L-15-Medium und beobachten unter dem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass das Gehirn vollständig in das Medium eingetaucht.
6. Stellen Sie die Dorsalseite des Gehirns nach oben ein, und richten Sie das Gehirn, so dass die Riechkolben wohnen an der Drei-Uhr-Position (für Rechtshänder). Halten Sie das Gehirn vorsichtig mit der Pinzette in die linke Hand.
7. Mit den feinen Pinzette Dissektion (Dumont # 3 oder # 4) in der rechten Hand, schneiden Sie den Balken und unterhalb des Parenchyms Verbinden der Gehirnhälften, die entlang der Längsspalte des Großhirns.
8. Schieben Sie die Gehirnhälften entfernt an den Seiten und setzen die Querhirnspalte.
9. Trennen Sie die Hemisphären durch Kneifen out the Parenchym zwischen der Hemisphäre und Thalamus.
10. Ziehen Sie vorsichtig die seitlichen Ventrikel Plexus, die auf der lateralen Seite des Hippocampus durch die Lamina affixa angebracht ist.
11. Übertragen Sie die isolierten Plexus auf die 35 mm Glasbodenschale mit frischen Leibovitz L-15-Medium, und überlagern ein Gewicht (Materialliste) leicht, um das Gewebe in Position zu halten.

2. Live-Imaging von CPEC Cilia

1. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße ultraviolette (UV) und geschlossen (IR) Cut-Filter (n) zu sperren Licht kürzer als 400 nm und länger als 700 nm, und das Neutraldichtefilter (ND) (25% bzw. 6%) in den Strahlengang eingelegt des invertierten Mikroskops.
2. Stellen Sie den Fokus des Objektivs grob durch Auge und stellen Sie dann den Kondensator, so dass das Zentrum und Fokus auf die Köhler-Beleuchtung entsprechen. Legen Sie eine geeignete Differentialinterferenzkontrast (DIC) Prisma, ein DIC-Element sowie Analysator und Polarisator Elemente in der liGHT PATH um das DIC Optik entsprechen.
3. Stellen Sie den Kontrast der Blick von der DIC-Prisma Position, so dass die Struktur der Gewebeoberfläche ist besonders erkennbar. Wenn alle Zilien der Zielzellen sind beweglich, eine klare Sicht auf bewegliche Zilien kann nicht mit dem Auge wegen ihrer Bewegung erreicht werden.
4. Ändern Sie den Lichtweg zu der Videokamera und der ND-Filter zu entfernen, um die Lichtleistung zu erhöhen.
5. Verwenden Sie die Kamera in Fokusmodus, um das Sichtfeld und Fokus einzustellen. Während der Fokussierung, bei der Videobilder in Echtzeit auf dem Monitor angezeigt wird, ist eine klare Sicht auf bewegliche Zilien nicht verfügbar.
6. Mit der Kamera bei 200 Hz mit einer Belichtungszeit von 0,1 ms für den gewünschten Zeitraum (Sekunden bis Minuten). Nach der Übernahme des Bildstapels wird Einzelbilder klar ciliary Strukturen anzuzeigen. Wenn ciliary Kanten sind unscharf, erhöht die Bildrate oder verwenden Sie eine kürzere Belichtungszeit.
7. Nehmen Sie die Bewegung der Flimmerhärchen CPEC innerhalb 25-60 Minuten nach der Euthanasie in LeibovitzL-15-Medium.

3. Analyse der Flimmerbewegung

1. Manuell verfolgen schlagen Muster jedes cilium auf dem Computermonitor. Filter ciliary Spitzenpositionen in jedem Rahmen mit dem Mauszeiger, die Flugbahn-Informationen jedes cilium zusammengesetzt werden. Entweder analysieren die Flugbahn Daten mit der gleichen Software oder den Export in andere allgemeinere Anwendungen für die weitere Analyse. Die Effizienz dieses Analyseschritt auch in der Diskussion beschrieben.
2. Klassifizierung der Bahnen in zwei Bewegungsarten, hin- und her bzw. Dreh, mit dem Auge.
3. Berechnen Sie die Zilienschlag Frequenz (CBF) mit der folgenden Formel: [CBF = (Anzahl der Bilder pro Sekunde) / (durchschnittliche Anzahl der Bilder für einen einzelnen Schlag)] ^14, die aus einer ciliary Spitze Bewegungsdiagramm erhalten werden können (Abbildung 3 ). Wiederhole diese Berechnung für mehrere Zilienschlag Zyklen, weil andere Zilien auf der gleichen Zelle kann mit der Bewegung jedes ciliu interferierenm, was zu Unregelmäßigkeiten.
4. Um die Winkel Gleichmäßigkeit der Zilienschlag Achsen innerhalb einer einzelnen Zelle zu analysieren, definieren das Schlagen Winkel θ für jede Flugbahn (Abbildung 4). Für Hin-und-her-Trajektorien, passen die Positionen der Zilien Spitze auf eine gerade Linie, und definieren θ als Winkel der Linie macht mit x-Achse. Für Dreh Trajektorien, passen die Positionen zu einer Ellipse und definieren θ als Winkel der Hauptachse der Ellipse macht mit x-Achse. Details der Armatur sind im Repräsentative Ergebnisse beschrieben.
5. Zur quantitativen Beschreibung der einzelnen Flugbahn berechnen verallgemeinerte Seitenverhältnis AR. Kurz gesagt, dreht die Trajektorie durch - θ und AR definieren als das Verhältnis zwischen der Breite der Verteilung entlang x - und y-Achsen (4B). Einzelheiten sind in der Repräsentative Ergebnisse Schnitt gezeigt, und die Interpretation, Bedeutung, und die Begrenzung der Parameter sind in der Diskussion beschrieben.

4. Probenvorbereitung für die SEM

Anmerkung: SEM ist ein wichtiges Verfahren, um den Status der Zilien auf CPECs in umfassender Weise auszuwerten. Um Proben für SEM vorzubereiten, berichtete ein Standardverfahren zuvor ¹⁵ mit geringen Modifikationen verwendet.

1. Vor der Zerlegung der Gewebe aus dem Gehirn, bereiten Sie die Fixiermittel in einer 5 ml-Glasgefäß mit einer Polyethylenkappe. Das Fixiermittel besteht aus 2% Paraformaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd (Halb Karnovsky-Lösung ¹⁶⁾ in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4.
2. Präparieren Sie das Gewebe aus dem Gehirn, wie in Schritt 1 beschrieben.
3. Kurz abspülen isolierten Gewebes mit ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) in ein neues Gericht und dann fix das Gewebe in der Fixiermittel in dem Glasfläschchen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Verwenden Sie Einweg-Transferpipetten und behandeln die Proben gently. Nach Spülen in HBSS, wird das Gewebe klebrig.
   1. Um die Proben in die Fixierungslösung zu übertragen, zu vertreiben langsam eine kleine Menge der Lösung, die das Gewebe von der Transferpipette als ein Tröpfchen und zu dem Fixiermittel.
4. Nach der Fixierung, entsorgen Sie die Fixierungsmittel und spülen Sie das Gewebe mit Phosphatpuffer dreimal.
5. Tauchen Sie das Gewebe in einer 10% igen Saccharoselösung zum Auswaschen der verbleibenden Aldehyde. Um vollständige Beseitigung von Aldehyden zu gewährleisten, tauchen Sie die Proben in der Lösung für 10 Minuten und wiederholen Sie dann zweimal mit frischem 10% Saccharose. Dieser Schritt ist wichtig, die richtige Postfixierung in den nachfolgenden Schritten zu erreichen.
6. Tauchen des Gewebes in einer Lösung von 1% Osmiumtetroxid in Phosphatpuffer für 30 min und dann auf Eis für Postfixierung. Beurteilen Sie den Grad der osmification von der Probe Farbe: wenn Aldehyde vollständig entfernt ist die Probe schwarz.
7. Die post-fixierten Gewebeproben umfassend Waschen mit Doppel destilliertd Wasser mehrmals.
8. Dehydratisieren die Proben durch Eintauchen in abgestufte Konzentrationen von Ethanol, in der Regel 65%, 75%, 85%, 95%, 99% und 100%, für jeweils 10 min. Erhalten wasserfreiem Ethanol, indem Molekularsiebe in 99,5% Ethanol aus einer neu gekauften Flasche. Wiederholen Dehydratisierung mit wasserfreiem Ethanol dreimal.
9. Legen Sie die dehydrierten Proben in Isoamylacetat, einem Substitutions Reagenz zum Trocknen am kritischen Punkt, für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Dieses Reagenz schnell verdampft und die Probe kann trocken werden, was zu einer Zerstörung durch die Oberflächenspannung. Daher nicht die Probe vollständig trocknen.
10. Nach dem letzten Austausch von Isoamylacetat, entfernen Sie das meiste Lösungsmittel, sofort wickeln Sie das offene Glas mit Aluminiumfolie, und legen Sie das Fläschchen auf Trockeneis. Mittels einer Nadel oder einer feinen Pinzette, stellen mehrere Löcher in die Folie für den Mund des Fläschchens, so daß flüssiges Kohlendioxid fließt leicht in die Phiole in dem kritischen Punkt Trockner. Fahren Sie mit dem nächsten Schrittso schnell wie möglich.
11. In diesem Schritt minimieren die Übertragung von Isoamylacetat in die Kammer des Trockners, aber lassen Sie die Probe vollständig austrocknen, bevor Trocknen am kritischen Punkt. Hinzu kommt, dass die Probe nicht auf Trockeneis verlassen unnötig lange Zeit, um die Bildung von Frost auf dem Fläschchen zu vermeiden.
12. Übertragen Sie die Folie eingeGlasFläschchen, die die Gewebeproben in den kritischen Punkt Trockner, dass die Oberflächenstruktur des Gewebes bleibt erhalten, während das Wasser im Gewebe enthaltenen gewährleistet. Detaillierte Informationen über den Betrieb der kritischen Punkt Trockner können aus den Anweisungen des Herstellers bezogen werden.
13. Behandeln Sie die Proben vorsichtig mit einem Zahnstocher, um mechanische Schäden zu minimieren. Das resultierende getrocknete Gewebeproben sind zerbrechlich. Montieren Sie die Proben auf Metall Stubs und Mantel mit Gold-Palladium unter Verwendung eines Ionen Sputter.

5. Beobachtung durch SEM

1. Beobachten von SEM und Bilder aufnehmen mit einer Digitalkamerazu Rasterelektronenmikroskop ausgestattet.
2. Übertragen digitaler Bilddaten auf einen PC zur Auswertung.

Ergebnisse

Ein Überblick über den Arbeitsablauf ist in Figur 1 dargestellt ist, einschließlich der Bilder der Geräte.

Live Motion Beobachtungen CPECs

Film 1 zeigt ein Film von CPECs aus einer perinatalen Maus isoliert und Movie 2 zeigt eine vergrößerte Ansicht der Bilder in Film 1. Es wird darauf hingewiesen, dass einzelne ciliary Tipps sind in Vergleich mit denen in Filmen Einzelbilder weniger klar werden....

Diskussion

Perspektiven dieser Methode

Obwohl die hier beschriebene Technik ist eine detailliertere Analyse der Zilien als bisher veröffentlichten Verfahren liefern, die Bedeutung dieser Technik besteht in der Einfachheit des Systems und Kosteneffizienz, die leicht an jede Art von Screening Zilienmotilitätsstörungen ex vivo angewendet werden kann. Insbesondere stellt TI Workbench eine einfache und benutzerfreundliche Schnittstelle, die Forschern die Beobachtung und leichter analysieren Zilienm...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Benötigte Reagenzien
für Live Cell Imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064<
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's ausgewogene Salzlösung	Life Technologies	14170112
Paraformaldehyd	Merck	1040051000
Glutaraldehyd	Nacalai tesque	17003-05
isoamylacetat	Nacalai tesque	02710-95
Molekularsiebe 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	zur Herstellung von wasserfreiem
Ethanolphosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
Phosphatpuffer, 0,1 M			Um 100 ml herzustellen, mischen Sie 19,0 ml mit 0,1 μm; M NaH2PO4 und 81,0 ml von 0,1 μbsp; M Na2HPO4
Mononatriumphosphat (Dihydrat)	Nacalai tesque	31718-15
Dinatriumphosphat (wasserfrei)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
Osmiumtetroxid	Nisshin EM	300
Trockeneis
[header]
Werkzeuge und Materialien zum Sezieren
sowohl für Live-Imaging als auch für die REM-Vorbereitung
Stereomikroskop	Olympus	SZX7
flaches Papierhandtuch
Φ 10 cm Kunststoffschale
100 ml Becherglas
gerade Bedienschere	Sansyo	S-2B
Uhrmacherzange	Dumont	Nr.DU-3 oder -4, INOX
für Live Cell Imaging
Glass Bodenschale	Matsunami Glass	D110300
für die REM-Vorbereitung
alminum Folie
5 ml Glasfläschchen mit Polyethylen-Kappe	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
Transferpipette	Samco Scientific	SM251-1S	für Probentransfer
Zahnstocher			für Probentransfer
Ionensputter mit Gold-Palladium	Hitachi	E-1030
Trockner für kritische Punkte	Hitachi	HCP-2
[header]
Mikroskopische Ausrüstung und Materialien
für Live Cell Imaging
inverses Mikroskop	Olympus	IX81
100 W Quecksilberklumpengehäuse und Netzteil	Olympus	Es können U-ULH und BH2-RFL-T3
100 W Quecksilberlampe	Ushio	USH103D
DIC Kondensator, n.a. 0,55	Olympus	IX-LWUCD
elektrischer Verschluss	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 und VMM-D1	manueller Verschluss verwendet werden.
Bandpassfilter (400-700  nm, Φ 45  mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND Filter (Φ 45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	Kombination aus 25% und 6% ND-Filtern werden verwendet
Objektiv (Wasserimmersion) mit DIC-Element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1,15 mit IX-DPAO40
Hochgeschwindigkeits-Videokamera	Allied Vision Technologies	GE680	≥ Bildrate von 200 Hz und 1 ms Belichtungszeit
Bilderfassungs-/Analysesoftware	Die hauseigene Software	TI Workbench	ermöglicht die Erfassung mit hohen Bildraten.
PC für Kamerasteuerung / -analyse	Apple	Mac Pro
Schwingungsisolationstisch	Meiritsu Seiki	AD0806
Gewicht für Gewebe	Warner Instruments	Scheibenanker-Kits	Es kann mit Nylonnetz hergestellt werden, das auf eine U-Form geklebt ist, gequetscht Φ 0.5  mm Platindraht.
Deckglas (alternatives Gewicht für Gewebe)	Matsunami	auf Bestellung	Als Deckglas kann ein Deckglas verwendet werden.
für REM
inverses Mikroskop	Olympus	IX81
Rasterelektronenmikroskop	JEOL	JSM-6510