Methodenartikel

Kombinierte Shuttle-Box-Training mit Elektrophysiologische Cortex Ableitung und Stimulation als ein Instrument zur Wahrnehmung und Lernen Studie

DOI:

10.3791/53002

⸱

22. Oktober 2015

 ,  , 
1Leibniz Institute for Neurobiology, Magdeburg, Germany, 2Otto-von-Guericke University, Magdeburg, Germany, 3Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS), Magdeburg, Germany

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Shuttle-box Vermeidung Lernen wird in Behavioral Neuroscience etablierte. Dieses Protokoll beschreibt, wie Shuttle-Box-Lernen bei Nagetieren mit ortsspezifischen elektrischen intracortical Mikrostimulation (ICMS) und gleichzeitige chronische in vivo-Aufnahmen als Werkzeug, um mehrere Aspekte des Lernens und Wahrnehmung studieren kombiniert werden.

Zusammenfassung

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Shuttle-box Vermeidung Lernen ist ein etabliertes Verfahren in der Verhaltensneurowissenschaften und Versuchsaufbauten waren traditionell nach Maß; die notwendige Ausrüstung ist nun durch mehrere Handelsunternehmen zur Verfügung. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung eines Zwei-Wege-Shuttle-Box-Vermeidungslernparadigma in Nagetieren (hier Mongolische Rennmäuse; Meriones unguiculatus) in Kombination mit ortsspezifischen elektrischen intrakortikale Mikrostimulation (ICMS) und gleichzeitiger chronisch elektrophysiologische in-vivo-Aufnahmen. Die ausführliche Protokoll ist auf mehrere Aspekte der Lernverhalten und die Wahrnehmung in verschiedenen Nagetierarten zu studieren.

Standortspezifische ICMS auditiver kortikalen Schaltkreisen als konditionierte Stimuli hier als Werkzeug, um die Wahrnehmungs Relevanz von bestimmten afferenten, abführenden und intrakortikale Verbindungen testen. Verschiedene Aktivierungsmuster können durch die Verwendung verschiedener Stimulationselektrode arr hervorgerufen werdenays für die lokale, Schicht abhängige ICMS oder entfernte ICMS Websites. Verwendung Verhaltenssignalerkennungsanalyse festgestellt werden kann, die Stimulationsstrategie ist am wirksamsten zum Hervorrufen einer behaviorally nachweisbar und der Schenkelsignals. Ferner parallelen Mehrkanal-Aufnahmen mit unterschiedlichen Elektrodenkonstruktionen (Oberflächenelektroden, Tiefenelektroden, etc.) zu ermöglichen für die Untersuchung der neuronalen Observablen über den Zeitverlauf eines solchen Lernprozessen. Es wird diskutiert werden, wie sich Änderungen der Verhaltens Design kann die kognitive Komplexität zu erhöhen (zB Erkennung, Diskriminierung, Umkehr Lernen).

Einleitung

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Ein grundlegendes Ziel der Behavioral Neuroscience ist es, spezifische Verbindungen zwischen neuronalen strukturellen und funktionellen Eigenschaften, Lernen und Wahrnehmung zu etablieren. Neuronale Aktivität mit der Wahrnehmung und Lernen verbunden sind, können durch elektrophysiologische Ableitung von Aktionspotentialen und lokaler Feldpotentiale in verschiedenen Hirnstrukturen an mehreren Stellen untersucht werden. In der Erwägung, elektrophysiologischen Ableitungen bieten korrelative Zusammenhänge zwischen neuronaler Aktivität und Verhalten, hat direkte elektrische Mikrostimulation intrakortikale (ICMS) seit über einem Jahrhundert war die direkteste Methode zum Testen von kausalen Zusammenhänge von angeregten Populationen von Neuronen und deren Verhaltens- und Wahrnehmungseffekte 1-3. Viele Studien haben gezeigt, dass die Tiere in der Lage, Verwendung von verschiedenen räumlichen und zeitlichen Eigenschaften der elektrischen Impulse in Wahrnehmungsaufgaben in Abhängigkeit von der Stimulationsstelle innerhalb etwa retinotopic 4, t machenonotopic 5 oder somatotopen 6 Regionen in der Hirnrinde. Vermehrung von elektrisch evozierten Aktivität im Cortex wird hauptsächlich durch die Anordnung der axonalen Fasern und deren Verteilung synaptischer Verbindungen 2, die in Kortex ist klar Schicht abhängige 7 bestimmt. Die sich ergebende polysynaptischen Aktivierung durch ICMS evozierte ist von nun an viel weiter verbreitet als die direkten Auswirkungen des elektrischen Feldes 2,8,9. Dies erklärt, warum Schwellen von Wahrnehmungseffekte intrakortikale Mikrostimulation ausgelöst kann stark Schicht abhängige 8,10,11 und ortsabhängige 9 sein. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, im Detail, dass die Stimulation der oberen Schichten ergab weiter verbreitet Aktivierung corticocortical Kreisen in erster Linie supragranular Schichten, während die Stimulation der tieferen Schichten der Hirnrinde führen zu einer Brenn, wiederkehrende corticoefferent innerhalb der Säulen-Aktivierung. Parallel Verhaltensexperimente zeigten, dass die letztere viel niedriger Wahrnehmungsdetektions thresholds 8. Daher wurde der Vorteil der ortsspezifischen ICMS so konditionierten Stimuli in Kombination mit elektrophysiologischen Ableitungen genutzt kausal beziehen spezifischen kortikalen Schaltung Aktivierungen 8 zu Verhaltensmaßnahmen von Lern- und Wahrnehmungs im Shuttle-Box.

Das Zwei-Wege-Shuttle-Box-Paradigma ist eine gut etablierte Laborgerät zur Vermeidung Lernen 12 zu studieren. Ein Shuttle-Box besteht aus 2 Kammern, die durch eine Hürde oder Tür getrennt. Ein bedingten Reiz (CS), die durch ein geeignetes Signal wie ein Licht oder Ton dargestellt wird, ist um einen aversiven unbedingten Reiz (US) gefolgt, wie beispielsweise ein Fuß-Schock über einem Metallgitterboden. Themen können lernen, die US vermeiden, indem Shuttling von einer Shuttle-Box-Abteil zum anderen in Antwort auf das CS. Shuttle-Box-Lernen beinhaltet eine Folge von unterscheidbaren Lernphasen 13,14: Erstens,Themen lernen, den US vom CS durch klassische Konditionierung vorherzusagen und aus den USA durch instrumentelle Konditionierung zu entkommen, wie die USA auf pendelt beendet. In einer nächsten Phase, Themen zu lernen, um die US-ganz zu vermeiden durch pendelt in Reaktion auf die CS vor dem US-Angriff (Vermeidung Reaktion). Allgemein beinhaltet Shuttle-box Lern klassische Konditionierung, instrumentelle Konditionierung sowie zielgerichtetes Verhalten, je nach Lernphase 14.

Der Shuttle-Box-Verfahren lässt sich leicht und eingestellt werden, in der Regel führt zu robusten Verhalten nach einigen täglichen Trainingseinheiten 15-17. Neben einfachen Vermeidungsanlage (Detektion) kann der Shuttle-Box weiter verwendet werden, um Impulse Diskriminierung durch den Einsatz von Go / NoGo Paradigmen zu untersuchen. Hier werden die Tiere darauf trainiert, den US durch eine konditionierte Reaktion (CR) (go Verhalten; Shuttle in die entgegengesetzte Raum) zu vermeiden, als Reaktion auf ein go-Stimulus (CS +) und von Nogo-Verhalten (Aufenthalt in der Kammer; keine CR) in Reaktion auf ein Nogo-Stimulus (CS) Parallel Mikrostimulation und Erfassung der neuronalen Aktivität mit hoher Dichte Multielektroden-Arrays ermöglichen, um zu studieren. die physiologischen Mechanismen erfolgreiches Lernen zugrunde. Einige technische Details, die grundlegend für die erfolgreiche Kombinationen von Shuttle-Box-Training, ICMS und parallel Elektrophysiologie sind, werden diskutiert.

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Protokoll

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Alle Experimente in dieser Arbeit vorgestellt wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durch das deutsche Recht für den Schutz von Versuchstieren festgelegt durchgeführt. Die Experimente wurden von der Ethikkommission des Landes Sachsen-Anhalt genehmigt.

1. Maßgeschneiderte Multichannel-Elektroden-Arrays für Mikrostimulation und Recording

  1. Maßgeschneiderte Mikrostimulation Array
    1. Für die Bereitstellung von ICMS, bereiten Stimulationselektroden in der gewünschten Raumgestaltung (hier seitliche Anordnung von 2 Kanäle) mit 3-cm lang Teflon isolierten Edelstahldrähte (Ø mit Isolation = 50 um). Siehe Abbildung 2.
    2. Crimp einem Ende der Drähte zu einem männlichen Pin-System (1,25 mm Abstand).
    3. Für einen 2-Kanal-Array mit ~ 0,5 mm oder ~ 0,7 mm Elektrodenabstand Pass Drähte senkrecht durch zwei vertikal ausgerichtete Elektronenmikroskopie Objektträgergitter (Entfernung von Gittern ~ 5 mm) Führen Sie die Drähte (0,1654 mm Abstand).
    4. Kleber Drähte zusammen mit einem kleinen Tropfen von Dentalacryl ca. 4 mm über die Enden der Drähte, die schließlich als Elektrodenspitzen dienen.
    5. Legen Sie Stift in das Steckergehäuse.
    6. Setzen die Elektrode in einer Schale mit Elektrolytlösung (zB 0,9% Natriumchlorid) und Messen der Impedanz jeder Kanal mit einem entsprechenden Impedanzmessvorrichtung (z. B. FHC Impedanz Anlage Module). Zielen darauf ab, Impedanzen im 100 bis 500 kOhm-Bereich.
      1. Wenn Impedanz zu hoch ist, zu liefern kurzen elektrischen Strom (1 sec, 1 mA) durch die Kanäle, um sie zu senken. Überprüfen Impedanz erneut.
  2. Maßgeschneiderte hochauflösende Mehrkanal-Aufnahme-Arrays
    Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Oberflächenarrays zur Aufzeichnung Elektrokortikogramm (ECoG) Daten. Allerdings können Designs zugeschnitten auf die Anforderungen der jeweiligen Fragestellung (Tiefe Aufnahmen, etc.) gerecht zu werden. Hochauflösende Mehrkanal-Arrays sind built durch Teflon isolierten Edelstahldrähte (Ø mit Isolation = 50 & mgr; m) gequetscht, um einen männlichen Pin-System (1,25 mm Abstand).
    1. Für die Oberflächenelektrodenarrays, Führungsdrähte 18 durch ein 3 x 6 Matrix von zwei vorbereitete Elektronenmikroskopie Objektträgernetze.
    2. Betten Sie die 6 x 3 Anordnung der Drähte zwischen den Gittern mit Zahnacryl und legte Stiften im Steckergehäuse.
    3. Grind der Dentalacryl in einen rechteckigen Block unter Verwendung Mühle auf einem Handbohrer angebracht.
    4. Überprüfen Sie, dass Impedanz von allen Kanälen (siehe 1.1.6) ist im Bereich zwischen 100 - 500 kOhm.
    5. Vor der Implantation (siehe Schritt 2) schleifen Oberfläche der Arrays, um die Konvexität der kortikalen Oberfläche entsprechen.

2. Chirurgische Implantation von Arrays in Hörrinde im narkotisierten mongolischen Herbils für chronische Usage

  1. Halten Sie die offizielle Genehmigung, alle erforderlichen experimentellen Schritte, die geplant sind, auszuführen. Tragen approfalls Schutzkleidung (Mantel, sterile Handschuhe, OP-Mundschutz, Haube).
  2. Verwenden erwachsene männliche Mongolische Rennmäuse (Meriones unguiculatus) oder andere Nagetierarten. Schutzhandschuhe und Mantel und verwenden Sie immer sterilisiert und gut identifizierten chirurgische Instrumente.
  3. Im Falle von Gerbils, anaesthetize Tiere mit einer ip Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg) in 0,9% iger steriler Kochsalzlösung verdünnt. Aufrechterhaltung durch Infusion von 0,6 ml / h / kg einer Mischung, zusammengesetzt aus Ketamin: Xylazin: Natriumchlorid (0,9%) im Verhältnis von 9: 1: 10.
  4. Zeigen Tier auf einer Heizplatte für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 37 ° C durch eine Rektalsonde Feedback-System (zB World Precision Instruments).
  5. Rasur Fell bedeckt interoccipital, Scheitel- und Schläfenbeine. Aseptisch bereiten die Inzisionsstelle mit einem wirksamen Desinfektionsmittel (z. B. abwechselnd Betadine oder Nolvasan und 70% Alkohol Peelings 3 mal). Protect Augen vor dem Austrocknen durch Augensalbe.
  6. Schneiden Sie die Schädelhaut für den interoccipital, Scheitel- und Stirnbeine mit einem Skalpell und entfernen Knochenhaut durch sanftes Bewegen eines Bohrers über die Knochenoberfläche.
  7. Bohren kleine Löcher in der Gegen Scheitel- und Stirnbein als seitliche wie möglich, um nicht behindern die spätere Kopfhalterung. Jetzt Schraube zwei Knochenschrauben mit einem Durchmesser von ca. 1 mm fest in die Löcher. Stellen Sie sicher, dass die Beleg Schraube hat einen guten Kontakt zur Dura, da es als gemeinsame Referenz und Masse sowie Rückelektrode zur elektrischen Stimulation später verwendet werden.
  8. Kleben Sie einen kleinen Aluminiumleiste medial über die Stirnknochen und sie als Kopffixierung während der Implantation durch eine headholder.
  9. Entfernen Sie Haut, die den Musculus temporalis auf der einen Seite mit einer Schere.
  10. Schneiden Sie den dorsalen Teil des Schläfenmuskel, um die Zulassung zum Schläfenbein zu erhalten.
  11. Aussetzen auditorischen Cortex durch Kraniotomie (~ 3 mm x 4 mm) ausdas Schläfenbein mit Hilfe eines Zahnbohrers. Identifizieren Standort des auditorischen Kortex auf der Grundlage der typischen Blut-Hirn-Behälter Unterschrift 18,19.
  12. Einen Einschnitt der Dura sorgfältig zu machen mit einem Mikroskalpell an der Stelle, an der Stimulationselektrode in das Gehirn implantiert. Entlang der Oberfläche sanft bewegen, bis die Tränen in die Dura Beschädigung des darunterliegenden Neuropil zu verbieten.
  13. Legen Stimulation Array unter Mikromanipulator Steuer. Wähle eine tangentiale Eingriffswinkel, damit die epidurale Anordnung über dem interessierenden Bereich angeordnet werden. Je nach Eintauchwinkel und Position und der gewünschten Stelle der Stimulation, sorgfältig zu prüfen, die Eintauchtiefe.
  14. Legen Sie die epidurale Oberflächenaufzeichnungs Array mit guten Kontakt zur Hirnoberfläche für die Region von Interesse (hier auditorischen Kortex) durch einen zweiten Mikromanipulator. Darauf achten, dass das Array entspricht der Krümmung des Kortex, die Dura nicht einrücken.
  15. Fixieren Sie beide Elektrodenanordnungen und deren SteckerGehäuse mit Zahnacryl auf den Schädel.
  16. Abdeckung ausgesetzt kortikalen Oberfläche mit einer antiseptischen Schmiermittel (zB KY-Jelly) und in der Nähe Kraniotomie mit Zahnacryl (zB Paladur, Heraeus Ulzer). Beachten Sie, dass Polymerisation kann Wärme erzeugen. Verwenden Sie ausreichend Schmiermittel zwischen Neuropil und Zahnacryl um jeglichen Kontakt der Zahn Acryl- und der kortikalen Oberfläche zu vermeiden, da dies zu Gewebeschäden verursachen.
  17. Nun damit die Tiere vor Beginn der weiteren Vorgehensweise zu erholen. Recovery-Zeiten könnte zwischen den Arten (: ≥3 Tagen, Mäuse: ≥7 Tagen zB Rennmäuse) abweichen. Überwachen Sie sorgfältig den Zustand des Tieres und geben schmerzstillende Behandlungen in den folgenden Tagen, wenn anwendbar (zB Meloxicam; 1 mg / kg postoperativen und 24 Stunden nach der Operation).

3. Zwei-Wege-Shuttle-Box-Designs mit ICMS als bedingten Reiz

  1. Shuttle-Box-Training
    1. Legen Sie ein Shuttle-Box (custom-build oder jedes Handelsprodukt, zum Beispiel E10-E15, Coulbourn Instruments) in einem akustisch und elektrisch abgeschirmten Raum. Die Box enthält zwei Kammern, die durch eine Hürde getrennt. Betrachten Sie die Höhe der Hürde, da sie die Verhaltens Vorspannung der Go-Reaktionen beeinflusst. Verwenden Sie geeignete Höhe für bestimmte Arten (zB ~ 2 cm für Mäuse, ~ 3 cm für Rennmäuse).
    2. Um den Fuß-Schock (US) anzuwenden, verwenden Sie einen Gitterboden mit einem Abstand zwischen den für die Arten zu untersuch 12,15 entsprechende Bars. Achten Sie immer darauf, dass nichts elektrisch Kombinationen der einzelnen Stäbe (Kot, Haare, Elektrodencreme).
    3. Nach einer deutlichen Erholungszeit des Tieres (siehe 2.17), schließen Sie das unter der Ableitung und Stimulation Kabel vorzugsweise ohne Verwendung von Kurzzeitnarkose. Versuchen Sie, das Tier mit einem Handtuch abdecken und vorsichtig nehmen Sie das Tier in die Hände. Entdecken Sie den Kopf und die Anschlüsse des Tieres mit der anderen Hand und schließen Sie die Kabel.
    4. Damit die Tiere auf den Trainingsraum für 3 Minuten vor Beginn jeder Sitzung zu gewöhnen.
    5. Pro Trainingseinheit (1 - 2 täglich) gelten zwischen 30-90 Studien. Verwenden Sie Testlaufzeit von bis zu 15 sec, und inter-Testintervalle, die zufällig schwanken zwischen 25 bis 30 sec.
    6. Für die Bereitstellung von ICMS für konditionierte Stimulation an die Stimulationselektroden mit einem Mehrkanal-Stimulator (zB MCS STG2000). Um Auswirkungen auf das Verhalten ohne Beschädigung des Hirngewebes zu erhalten, gelten Impulsfolgen (zB 300 ms Länge, 100 pps) des zweiphasigen, mit ausgeglichener Ladung Impulse (kathodischen ersten) mit einem 200 & mgr; s Phasendauer. Wiederholen Züge mit einer Pause von 700 ms für die Dauer von 4 Sek (Beobachtungsfenster).
    7. Für die Präsentation von Gehör CS verwenden einen analogen Ausgang PCI-Karte (zB NI PCI-6733). Programmieren Sie diese Geräte mit Matlab, um flexibel zu steuern und Hardware-Trigger mit dem Shuttle-Box-System über die digitalen Ausgangsleitungen.
    8. Führen Sie das analoge Ausgangssignal zu the Shuttle-Box-Lautsprecher über einen Audio-Verstärker.
    9. Bedingt liefern den Fuß-Schock-US durch einen Gitterboden. Für eine optimale elektrophysiologischen Aufzeichnungsqualität, erzeugen den Schock durch einen zweiten High-End-Mehrkanal-Stimulator (MCS STG2000).
    10. Um den Nachweis Trainings derzeit nur CS + Stimuli anzuwenden. Hier präsentieren blank Studien ohne CS und US zwischen den Testversuchen (~ 10%) durchsetzt, um für die vorgespannten Pendelverhalten (siehe 3.2) zu korrigieren. Für eine anspruchsvolle Aufgabe, trainieren Tieren zwischen CS + und CS- Reize in der gleichen Sitzung in zufälliger Reihenfolge präsentiert diskriminieren.
    11. Klassifizieren Sie ein Fach Änderung nach der CS + Einsetzen innerhalb eines kritischen Zeitfensters von 4 sec (CR) als Treffer Antwort. In CS + Studien ohne CR im kritischen Zeitfenster (Miss), sofort liefern ein mildes Fußschock für 6 bis 10 Sekunden als unbedingten Reiz (US).
      Hinweis: sich wiederholende CS + Stimulation, die bei der US überlappt wird den Lernaufwand für die Tiere eine Verringerungnd Verbesserung der Lern ​​Geschwindigkeit und Leistung ("Verspätung" vs. 'trace' Anlage, siehe Diskussion).
    12. Für CS-Studien, zu klassifizieren ein Fach Änderung innerhalb des kritischen Zeitfensters als Fehlalarm Antwort, und wenden Sie die US für bis zu 10 Sekunden unmittelbar nach diesem unangemessen CR. Haben USA nach CS- gelten nicht, wenn das Tier bleibt in der Kammer (ohne CR) während des kritischen Zeitfensters, und klassifiziert diese Studie als richtig Ablehnung.
      Hinweis: Wichtig ist, dass der Fuß Schock US immer ausgeschaltet ist, wenn die Tiere ändert Raum in Reaktion auf sie (Escape). Verwenden Sie mehr kritische Zeitfenster für CS- Studien, zum Beispiel, wenn sich wiederholende bedingten Stimulation verwendet werden, obwohl dies eine konservativere Lernkriterium zu verhängen, wie es bietet höhere Aufwand durch das Tier, um das CR hemmen.
    13. Für eine effektive Zuordnung von CS und US einzustellen Stoßfestigkeit in einem moderaten Bereich, um unangenehmen, aber nicht schmerzhaft sein. Optimale initial Stromstärke unterscheidet sich zwischen den Arten (beispielsweise 50 & mgr; A für Mäuse, 200 & mgr; A für Rennmäuse). Deshalb finden Sie in den nächsten zwei Kugeln für weitere technische Details:
      1. Individuell den Schock Stärke anzupassen in der ersten Trainingseinheit, beginnend mit milden Amplituden (~ 200 & mgr; A für Rennmäuse). Wenn Fußschock Kraft sie zu niedrig ist, zu entkommen Latenzen und Jitter Assoziation zwischen CS und US nicht optimal ist.
      2. Immer darauf achten, wenn die Tiere anfangen zu singen und um in Reaktion auf die CS einzufrieren. In diesem Fall Fußschock Festigkeit zu hoch ist. Dies bedingt Angstreaktion stört Vermeidung Lernen.
    14. Die Fluchtlatenzzeiten sorgfältig zu bestimmen. Erhöhen Fußschock Stärke Schritt-für-Schritt, wenn Fluchtlatenzzeiten länger als 2 Sekunden, nachdem die ersten 20 Studien sind. Prüfen Sie nach jedem Training, wenn das Tier unter Stoßsteuerung, dh, es zeigt entkommen Latenzzeiten deutlich unter 2 sec.
      Hinweis: Vermeiden Sie jedoch zu Fuß zu erhöhenSchock Stärke zu schnell, wie der Verhaltensstrategie eines hoch belasteten Tier geht auf reine Fluchtreaktionen fallen. Daher genau zu beobachten, das Verhalten und insbesondere die Latenzzeiten bei der Einstellung der Amplitude des US. Für ein Beispiel siehe Abbildung 3E.
    15. Wenn das Tier zeigt die CR, stoppen Präsentation des CS sofort. Dies ist entscheidend für die Verstärkung der Vermeidungsreaktion.
    16. Wenn Tiere haben eine Vermeidungsstrategie, dh erworben, zeigen entsprechende CR auf alle CS, variieren Parameter (ICMS Amplitude, Phase Dauer, Wiederholungsrate usw.), um psychometrische Analysen durchführen. Bewerben para CS Variation in blockweise mit US-Paarung, die wird aber Lern- und Anpassungs induzieren.
      1. Um dies zu vermeiden, beginnen Sie mit 15 bis 30 Studien der ursprünglichen Ausbildung, und dann nach dem Zufallsprinzip durchsetzen die CS Variationen ohne USA als Testversuche zwischen den regelmäßigen Schulungen Studien mit dem Original-CS. Maximal use 25% der Testversuche.
    17. Nach dem Training zu entfernen, das Tier aus dem Trainingsraum und sorgfältig reinigen Sie die komplette Box vor dem Training für die nächste Tier. Versuchen Sie zu vermeiden Ausbildung verschiedene Arten in einer Zeit, in der gleichen Box, als ihren natürlichen Geruch könnte mit Trainingsleistung beeinträchtigen.
  2. Analyse der Trainingsdaten
    1. Nehmen Sie alle Fach Veränderungen in der Gewöhnungsphase.
    2. Nehmen Sie alle Fach Veränderungen während des Trainings und teilen sich in Treffern und Fehlalarme, Flucht Antworten (misses und Rücken Shuttles nach einem Fehlalarm) und spontan intertrial Shuttles (ITS).
    3. Berechnen CR Raten CS + und CS- wie folgt: Trefferraten = Hits / Anzahl der CS + Studien; Fehlalarmraten = Fehlalarme / Anzahl der CS- Studien.
    4. Erhalten CR Raten Sitzung weisen. Um jedoch die Lerndynamik mit einer höheren zeitlichen Auflösung zu bewerten, berechnen CR Raten von kürzeren Blöcke der gleichen Anzahl von CS + und CS- Studien ( zB n = 10) dargestellt.
    5. Plot CR Raten als Funktion der Sitzung oder Versuchsblock für die Auswertung der Trainingsfortschritte und Lerndynamik.
    6. Zur Quantifizierung der Verhaltens Empfindlichkeit unabhängig von experimentellen Bedingungen Vorspannen der Reaktion des Tieres, abgeleitet d 'Werte auf der Basis der Signaltheorie 8,9,17.
    7. Für d 'Analyse Einsatz Z-Werte der entsprechenden Hit und Falschalarmrate (Scheidungs ​​Lernen) oder drücken Sie den Preis und die ITS (Nachweis Lernen) von den Umkehrungen eines standardisierten Normalverteilungsfunktion abgeleitet und subtrahieren diese Z-Scores. Einen Schwellenwert-Kriterium für Stimulus Detektion von d '= 1,0, was eine Signalstärke von einer Standardabweichung oberhalb Rauschen entspricht. Siehe Figur 3 als Beispiel.
    8. Zusätzlich bestimmen CR- und Flucht Reaktionszeiten als Reaktion auf verschiedene CS durch Messung der Zeitspanne zwischen CS Beginn und Verhaltensreaktion (komplett Fachändern).
    9. Besorgen Sie sich eine detaillierte Verhaltensanalyse von Videoaufnahmen mit dem Shuttle-Box-Verhalten. Erreichen zeitlichen Synchronisation zwischen Video und Aufzeichnungssysteme durch Aufzeichnen Triggerimpulse vom Shuttle-Box oder Stimulationssystems auf der Audio-Spur des Video. Videoanalyse ermöglicht zu beurteilen, Aufmerksamkeit und Orientierungs Reaktionen des Tieres vor der CR.

4. In vivo elektrophysiologische Techniken in Lern Tiere

  1. Elektrophysiologische Aufzeichnung während des Trainings
    1. Während des Trainings aufzuzeichnen elektrophysiologischen Signale (zB mit den beschriebenen ECoG-Arrays) von mehreren Elektroden monopolar gegen den gemeinsamen Referenz / Masseelektrode.
    2. Feed-Signale aller Elektroden in eine heads Verstärker entweder direkt oder über einen kurzen Adapter in den Kopf-Anschlüsse eingesteckt ist.
    3. Schließen Sie das heads an den Hauptverstärker über einen Kabelbaum von dünnen, flexiblen Kabeln umwickeltdurch ein Metallgitter, um es vor Beschädigungen zu schützen durch Beißen Tiere.
      Hinweis: Mechanische Belastung im Kabelbaum kann durch eine Feder weiterhin eine freie Bewegung und Drehung des Tieres in der Box entlastet werden. Ideal ist die Verwendung von einem drehbaren und motorisierte Schwenk. Doch für Hörversuche legen Sie die Dreh außerhalb der Schallschutzkammer oder stichhaltigen Schild mit Schaum, um die Hochfrequenz-auditive Lärm durch seine Motor Produkts zu reduzieren.
    4. Verwenden Sie einen Vorverstärker in der abgeschirmten Box zu erhöhen Signal-zu-Rausch-Verhältnis und Bandpassfilter das Signal in den gewünschten Frequenzbereich.
    5. Beispieldaten bei mehr als 1 kHz Sampling-Frequenz (lokale Feldpotential-Aufnahmen) und mindestens 40 kHz (für Aktionspotential-Aufnahmen) und speichern Sie auf den PC zur Offline-Analyse. Verwenden Sie geeignete Filtereinstellungen für beide Arten (zB 2 - 300 Hz für lokale Feldpotential; 300 - 4.000 Hz für Aktionspotentiale).
    6. Sorgfältig zu prüfen, Qualität der Aufzeichnung vor dem Beginn der tRegen (nicht Rauschen oder Bewegungsartefakte). Anwenden einer FFT-Online-Signalfilterung, um die Amplitude der 50-Hz-Störgeräusch zu bestimmen. Bei Bedarf überprüfen Sie alle Verbindungen zwischen der Kopfleiste, die Adapter, die headstages, der Kabelbaum und die Verstärker.
    7. Zur Reduktion von Artefakten in den aufgezeichneten Daten durch elektrische Stimulation hervorgerufenen verwenden ein Interpolationsverfahren, alle vom Artefakt 1 ms vor bis ~ 5 ms nach dem Beginn jedes Impulses beeinflußt Datenpunkte zu rekonstruieren. Dazu legen Sie Nullen zwischen den nicht betroffenen Datenpunkte, und wenden Sie einen symmetrischen FIR-Filter, der die mittlere quadratische Fehler zwischen den interpolierten Punkte und ihre Idealwerte (interp.m Funktion Matlab) minimiert. Wenden Sie dieses Verfahren, um das Ausgangssignal, getrennt bei jedem Kanal, bevor weitere Analysen 9.
  2. Technische Details des parallel Shuttle-Box-Training, ICMS und Aufzeichnungs
    1. In der Regel sicher, dass Tiere sich wohl fühlen in der Box umlieng. Lassen Sie das Tier frei bewegen und erreichen alle Ecken der Box. Genügend Zeit, einen Tag vor dem ersten Training (20 min) und vor jeder Sitzung (3 min) zu gewöhnen ist vorteilhaft.
    2. Nach jedem chirurgischen Behandlung, damit das Tier ausreichend Zeit, um darunter Medikamente zu erholen, falls erforderlich (siehe oben 2.17) und beginnen, nur das Tier zu trainieren, wenn die Tiere keine typischen Zeichen leiden oder Schmerzen (geschlossenen Augen, lethargisch Phänotyp, ungepflegten Fell zeigen 20).
    3. Stellen Sie sicher, die richtige Erdung des Gitterboden. Erdschleifen zwischen Aufzeichnungssystem Shuttle-Box und das Tier zu vermeiden. Erden Sie das Tier nur über seinen gemeinsamen Masseelektrode, so dass die gridfloor mit variabler Spannung.
    4. Schließen Sie das Mehrkanal-Stimulator (MCS STG2000) zum Kopf-Stecker des implantierten Stimulationselektrodenanordnung über getrennte Leitungen des motorisierten Schwenk.
    5. Verwenden Sie das gemeinsame Masseelektrode der Aufnahme als Boden oder Rückelektrode für die ICMS, wie gut.

5. Die histologische Analyse von Elektrodenpositionen

  1. Nach der vollständigen Trainingssatz, Steuerung für die stabile Lage des Stimulationselektrodenanordnung durch histologische Analyse.
  2. Anaesthetize Tiere mit einer ip Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg) in 0,9% sterilem Natriumchlorid verdünnt. Dann bewerben Sie monopolare Kathodenstrom (30 & mgr; A für 60 sec) durch alle Stimulationskanäle geliefert, um Eisen Lagerstätte im Gewebe an der Stelle der Implantation 8 zu erhalten.
  3. Nach diesem Verfahren, zu opfern das Tier durch einen geeigneten und zugelassenen Methode der Euthanasie (zB intraperitoneale Injektion einer Überdosis Pentobarbital; 100 mg / kg).
  4. Entfernen Sie das Gehirn des Tieres sofort und frieren sie in 2-Methyl auf -70 ° C abgekühlt, in flüssigem Stickstoff.
  5. Schneiden Sie nun den Bereich von Interesse auf einem Kryostat-Mikrotom in 50 & mgr; horizontal Abschnitten.
  6. Histologie: Nissl und "Prussian Blue" -staining
    1. Zur Identifizierung der kortikalen Schichten behandeln jeden zweiten Scheibe mit Nissl-Färbung. Zuerst baden Scheiben 5 min in 0,05 M Natriumacetat-Trihydrat (pH 4,0 -4,2).
    2. Baden Scheiben für 5 - 10 min in 5% Cresylviolett-Acetat. Spülen Sie Scheiben mit destilliertem Wasser.
    3. Baden Scheiben für 2 min nacheinander in 0,05 M Natriumacetat-Trihydrat (pH 4,0-4,2) und in Lösungen von 50%, 70% und 90% Ethanol auf.
    4. Baden Scheiben zweimal in Isopropanol: 96% Ethanol (2: 1) für jeweils 5 min.
    5. Schließlich baden Scheiben in Roticlear dreimal 5 min.
    6. Erhalten Lage der Stimulationskanäle durch "Prussian Blue" -staining jeder zweiten Scheibe, die die Eisenablagerungen durch lange einphasige Ströme nach den Experimenten sichtbar evozierte macht.
    7. Eine frische Lösung von 1% Kalium hexacyanoferrat (II) Trihydrat K 4[Fe (CN) 6] durch Vermischen von 2 g K 4 [Fe (CN) 6] in 200 ml 1% HCl.
    8. Zugabe von 800 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4).
    9. Baden Gehirnschnitte für 10 Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen und danach für 10 min in der Lösung hexacyanoferrat.
    10. Baden Scheiben zweimal für 10 min in 0,1 M Phosphatpuffer und schließlich für 5 min in destilliertem Wasser.

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Ergebnisse

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Dieser Abschnitt zeigt ein repräsentatives Beispiel der Shuttle-Box-Lernen in einer Wüstenrennmaus. Das Thema wurde geschult, um zu unterscheiden das ICMS Website zwischen zwei Stimulationselektroden implantiert 700 um voneinander im auditorischen Cortex (Abbildungen 1 und 2). Stimulation Arrays können in unterschiedlichen räumlichen Designs (Abbildung 1) angepasst werden. Hier wurde der Diskriminierung der beiden ICMS-Websites innerhalb von 3 Trainingseinheiten mit Dar...

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur gleichzeitigen ortsspezifische ICMS und Mehrkanal-elektrophysiologischen Ableitungen in einem Lern ​​Tier mit Hilfe eines Zwei-Wege-aversiven Fuß-Schock-gesteuerten Shuttle-Box-System. Das Protokoll betont technischen Schlüsselbegriffe für eine solche Kombination und weist darauf hin, wie wichtig die Erdung des Tieres nur über seinen gemeinsamen Masseelektrode, so dass die gridfloor mit variabler Spannung. Hier wurde Gehör Shuttle-box Lernen Mongolische Rennmäuse angewendet ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Deustche Forschungsgemeinschaft DFG und dem Leibniz-Institut für Neurobiologie unterstützt. Wir danken Maria-Marina Zempeltzi und Kathrin Ohl für die technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Teflonisolierter EdelstahldrahtCalifornia Fine WireØ 50µ m mit Isolierung
Pin-Steckverbinder-System Molex Holding GmbH510470200PicoBlade TEM Raster 1,25 mm
Raster QuantifoilScience ServicesEQ225-N27
Dentalacryl PaladurHeraeus Kulzer64707938
Handbohrmaschine OmniDrill35WPI 
Ketamin 500mg/10mlRatiopharm GmbH7538837
Rompun 2%, 25mlBayer Vital GmbH5066.0
Natrium-Chlorid 0,9%, 10mlB.Braun AG 
Gleitgel KY-JellyJohnson & & Johnson
Shuttle-box E10-E15Coulbourn InstrumentsH10-11M-SC
Stimulusgenerator MCS STG 2000Mehrkanalsysteme
Plexon Kopfbühnenkabel 32V-G20Plexon Inc.HSC/32V-G20
Plexon Kopfstufe  32V-G20Plexon Inc.HST/32V-G20
PBX Vorverstärker 32 KanälePlexon Inc.32PBX Box
Mehrkanal-ErfassungssystemPlexon Inc.MAP 32/HLK2
Kryostate CM3050 SLeica Microsystems GmbH
Signalverarbeitungskarte Ni-DaqNational Instruments
Lab StandardTM Stereotaxic InstrumentsStoelting Co. 
Audio-Abschwächer g.pahg.pah Guger technologies
Cresyl violet acetateRoth GmbH7651.2
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Natriumacetat-TrihydratRoth GmbH6779.1
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydratRoth GmbH7974.2
Dinatriumhydrogenphospaht-DihydratMerck1.065.801.000
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TiertemperaturreglerWorld Precision InstrumentsATC2000
503599PRID00000772

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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